Иванов А.Т., Петрова В.С., Кенигсберг Я.Э. Ветеринарная токсикология

Подождите немного. Документ загружается.

циями 20 г свежепрокаленного сернокислого натрия.

Полученную смесь энергично встряхивают в течение

10 мин. Эфирный экстракт собирают в колбочку ем-

костью 50 мл, выпаривают на водяной бане (30—40

или ротационном испарителе до объема 1 мл, остаток

испаряют при комнатной температуре.

К оставшемуся в колбочке жиру добавляют 3 мл

дистиллированной воды, взбалтывают в течение 1—2 мин

при подогревании на водяной бане или под струей теп-

лой воды. Затем смесь охлаждают до затвердения жира,

водный экстракт фильтруют через бумажный фильтр в

делительную воронку емкостью 50 мл. Операцию повто-

ряют дважды. Полученный водный экстракт хлорофоса

в делительной воронке промывают н-гексаном 3 раза

порциями по 10 мл и гексановые экстракты отбрасывают.

Очищенный водный экстракт трижды экстрагируют хло-

роформом, насыщенным водой, порциями по 15 мл,

встряхивая в делительной воронке в течение 5 мин.

Хлороформные экстракты объединяют, сушат без-

водным серно-кислым натрием (7—10 г) в течение 10—

20 мин, отгоняют хлороформ на испарителе при темпера-

туре бани 40—45

C до объема 0,2 мл, остатку дают испа-

риться на воздухе, затем пробу растворяют в эфире и

наносят на пластинку со слоем силикагеля.

25 г мяса, измельченного на мясорубке, дважды экс-

трагируют по 30 мин дистиллированной водой порциями

по 70 мл, встряхивая на аппарате или вручную. Водные

экстракты объединяют, прибавляют 1—1,5 г хлористого

натрия, экстрагируют хлорофос хлороформом, насы-

щенным водой, порциями по 50, 40 и 40 мл. При встряхи-

вании в делительной воронке в нижнем хлороформном

слое образуется стойкая эмульсия, для разрушения ко-

торой прибавляют безводный серно-кислый натрий. Дают

пробе постоять 10—15 мин, хлороформ количественно

собирают в сухую колбу, пропуская через слой серно-

кислого натрия. Объединенный хлороформный экстракт

отгоняют на водяной бане при температуре не выше

C до небольшого остатка (0,3—0,5 мл) или выпари-

вают на ротационном испарителе. Остаток хлороформа

упаривают при комнатной температуре досуха. Затем

пробу растворяют в диэтиловом эфире, наносят на пла-

стинку и хроматографируют.

Пластинку с нанесенными пробами и стандартными

растворами (10 мг/100 мл диэтилового эфира) помещают

в камеру для хроматографирования, в которую налит

5 Зак. 1116

121

бензол. Соблюдают правила хроматографирования. По-

сле того как фронт растворителя поднимется на 10 см,

пластинку вынимают из камеры и оставляют на воздухе

для его испарения. Затем пластинку вновь помещают в

камеру для хроматографирования, заполненную по-

движным растворителем гексан — ацетон в соотношении

1:1, хроматографируют и проявляют проявляющим

реактивом. Для зерна, молока, мяса им служит 2%-ный

раствор резорцина и 10%-ный водный раствор карбона-

та калия. Перед опрыскиванием растворы смешивают в

соотношении 2 : 3. После опрыскивания пластинку нагре-

вают при IOO

C 7—10 мин. Хлорофос проявляется в виде

оранжевого пятна с Rf = 0,31.

Для проб овощей и травы применяют раствор азотно-

кислого серебра (0,5 г азотно-кислого серебра раство-

ряют в 5 мл дистиллированной воды, прибавляют 10 мл

аммиака и доводят объем раствора до 100 мл ацето-

ном). После опрыскивания им пластинку облучают УФ

в течение 40 мин, располагая ее на расстоянии 20 см от

источника света. Хлорофос проявляется в виде серо-чер-

ного пятна. ДДВФ определению не мешает, так как его

Rf=0,56.

Количественное определение проводят путем сравне-

ния размера пятна пробы с размером пятна стандарт-

ного раствора.

Количественное определение пестицида с надежной

точностью можно проводить лишь до 20—30 мкг в пробе.

При большем содержании препарата зоны локализации

получаются размытыми и это затрудняет сравнение со

стандартом. В этом случае нужно брать пропорциональ-

ную часть исследуемого экстракта.

Расчет проводят по формуле

X = ^'

где X — содержание препарата в пробе, мг/кг; А — ко-

личество препарата, найденного путем сравнения со стан-

дартом, мкг; P — масса исследуемой пробы, г.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ БАЙТЕКСА

Принцип метода основан на экстракции препарата из

исследуемых проб и хроматографировании в тонком слое

силикагель — гипс. В качестве подвижного растворителя

используют смесь петролейного эфира с ацетоном в соот-

'122

ношении 2:1. Чувствительность метода 3 мкг в пробе

или 0,3 мг/кг.

Подготовка пластинок. На стеклянную обезжиренную

пластинку размером 13X18 см наносят слой сорбента,

для приготовления которого берут 50 г силикагеля KCK

зернением 100 меш и смешивают с 2,5 г гипса. Смесь за-

ливают 150 мл 5%-ной уксусной кислоты и тщательно

перемешивают. 2 чайные ложки полученной гомогенной

массы наносят на пластинку и распределяют по поверх-

ности ровным слоем. Пластинку подсушивают в горизон-

тальном положении при комнатной температуре в тече-

ние 24 ч, после чего она готова к использованию.

Ход анализа. Пробу нежирного мяса в количестве Юг

заливают 5 мл ацетона и гомогенизируют в течение

2 мин при 1000 об/мин. Гомогенат помещают в кониче-

скую колбу, четырежды споласкивают сосуд, в котором

измельчают ткань, наливая каждый раз по 5 мл ацето-

на, и выливают смывы в колбу с пробкой. Смесь гомоге-

ната с ацетоном оставляют при комнатной температуре

на 30 мин, затем центрифугируют 15 мин при 6—8 тыс.

об/мин. Жидкую фазу через бумажный фильтр отфиль-

тровывают в делительную воронку, куда приливают

10 мл насыщенного раствора хлорида натрия и 20 мл

хлороформа, и хорошо перемешивают. После полного

разделения слоев нижний слой сливают (смесь ацетона

и хлороформа) и фильтруют через бумажный фильтр.

Процедуру повторяют дважды, объединяя экстракты

(ацетон с хлороформом). Для обезвоживания экстракта

на поверхность фильтра насыпают 5 г сульфата натрия.

Экстракт выпаривают при комнатной температуре под

тягой на водяной бане или ротационном испарителе.

К 10 мл молока добавляют 20 мл ацетона. Дальней-

ший ход экстракции байтекса такой же, как при иссле-

довании мяса.

Сухой остаток растворяют в 0,5 мл ацетона, выпари-

вают растворитель до объема 0,1—0,2 мл и наносят ми-

кропипеткой на хроматографическую пластинку трижды

в одну и ту же точку. Пластинку погружают в хромато-

графическую камеру. Когда растворитель поднимется

на 10 см от линии старта, пластинку вынимают и высу-

шивают в течение 1 ч на воздухе. Для проявления хро-

матограммы пластинку опрыскивают из пульверизатора

1,6 н. раствором гидроксида калия в смеси метилового и

бутилового спирта 1:1, затем через 15—20 мин 1%-ным

водным раствором азотно-кислого серебра. Проявление

5«

123

идет быстрее, если после опрыскивания азотно-кислым

серебром пластинку в течение 2 мин подержать над пли-

той или другим источником тепла. Байтекс проявляется

в виде темно-серых пятен на белом фоне.

После проявления вычисляют величину Rf для бай-

текса (Rf равна 0,67—0,72; Rf оксианалога — 0,24—0,26).

Количественное определение байтекса в исследуемом

материале проводят путем сравнения интенсивности

окраски и величины пятен со шкалой стандартов.

Для стандартной шкалы готовят растворы байтекса

в ацетоне 1 : 5000; 1 : 10000; 1 : 20000; 1 : 50000;

1 : 100000 и по 0,1 мл из каждого разведения наносят на

хроматографическую пластинку. После разгонки и про-

явления получают пятна, соответствующие 20; 10; 6; 2;

1 мкг байтекса. Пятна измеряют и сравнивают визу-

ально.

Расчет проводят по формуле

V А

•

1000

где X — количество препарата в 1 кг исследуемого про-

дукта, мг/кг; А — количество препарата, выделенное из

"пробы, мг; P — масса пробы, г.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДИАЗИНОНА И ДУРСБАНА

Принцип метода основан на определении диазинона и

дурсбана в экстрактах исследуемых проб на газовом

хроматографе с термоионным детектором. Чувствитель-

ность метода 0,05 нг для диазинона и 0,1 иг для дурсба-

на в пробе, вводимой в хроматограф.

Ход анализа. 5 мл молока или 5 г измельченной или

гомогенизированной ткани животного помещают в бюкс,

заливают 10 мл ацетона или этилового спирта, разме-

шивают стеклянной палочкой и ставят в холодильник на

1 ч. Затем фильтруют через бумажный фильтр в дели-

тельную воронку. Бюкс промывают 10 мл ацетона или

спирта, пропуская растворитель через тот же фильтр в

делительную воронку. Фильтр промывают 5 мл дистилли-

рованной воды. Затем в делительную воронку с экстрак-

том приливают 25 мл дистиллированной воды, встряхи-

вают, добавляют 10 мл гексана и встряхивают 1—2 мин.

После разделения жидкостей верхний гексановый слой

сливают в градуированную пробирку с притертой проб-

кой, в которую предварительно насыпают 100—150 мг

'124

безводного серно-кислого натрия. При плохом разделе-

нии водного и гексанового слоев по каплям добавляют

спирт, осторожно вращая воронку. Объем гексанового

экстракта доводят до 10 мл тем же растворителем и

аликвотную часть вводят в хроматограф с термоионным

детектором. Используют стеклянную колонку длиной

1 м, диаметром 3 мм, заполненную хромосорбом W с

5% SE-30. Температура колонки 190

C, испарителя

220 °С. Вводимый объем 2—5 мкл. Расход газов: азота

22—24 мл/мин, водорода—12—17, воздуха —

200 мл/мин.

Количественное определение проводят методом срав-

нения высоты или площади пика исследуемого вещества

из экстракта и стандартного раствора.

Расчет ведут по формуле

° или X =-^M

где А — количество стандарта, введенное в хроматограф,

мг; Si(Hi)—площадь (высота) пика стандарта, мм

(мм); S

)—площадь (высота) пика препарата в

пробе, мм

(мм); Vi—объем экстракта, введенный в

хроматограф, мкл; V

— объем упаренного экстракта,

мкл; V3 — масса анализируемой пробы, кг, л.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ МЕТАФОСА, ТИОФОСА, КАРБОФОСА,

ФОСФАМИДА

Принцип метода основан на извлечении из исследуе-

мой пробы метафоса, тиофоса, карбофоса экстракцией

н-гексаном, фосфамида — водой и количественном опре-

делении на газовом хроматографе с термоионным детек-

тором. Чувствительность метода во фруктах и овощах —

0,02 мг/кг, в воде — 0,005 мг/л.

Ход анализа. Определение фосфамида. 25 г измель-

ченного растительного материала заливают в конической

колбе 100 мл дистиллированной воды, встряхивают в те-

чение 20 мин и фильтруют экстракт в делительную во-

ронку. Экстракцию повторяют дважды. Объединяют вод-

ный раствор в делительной воронке и экстрагируют фос-

фамид дважды хлороформом по 100 мл. Отделяют

органический слой, сушат безводным серно-кислым нат-

рием и упаривают на испарителе при температуре

50 °С.

'125

200 мл воды экстрагируют в Делительной воронке

дважды хлороформом по 100 мл. Отделяют органиче-

ский слой, сушат безводным серно-кислым натрием и

упаривают.

Определение метафоса, тиофоса, карбофоса. 25 г ово-

щей измельчают, заливают 50 мл н-гексана, периодиче-

ски встряхивают в течение 15—20 мин, экстракцию повто-

ряют дважды. Отделяют экстракт в делительную ворон-

ку, объединяют гексановый слой, сушат безводным

серно-кислым натрием, упаривают на испарителе при

температуре не выше 60

С.

200 мл воды экстрагируют в делительной воронке

гексаном дважды порциями по 50 мл. Отделяют органи-

ческий слой, сушат и упаривают на ротационном испари-

теле при температуре не выше 60 °С. Сухой остаток рас-

творяют в 5 мл гексана. 1 мкл этого раствора вводят в

хроматограф с термоионным детектором, используя

стеклянную колонку 1 мХЗ мм, заполненную хромосор-

бом W с 5 % SE-30. Температура колонки 190

испа-

рителя— 220

C. Расход газов: азота—19—21 мл/мин,

водорода—15—17, воздуха — 400 мл/мин. Линейность

наблюдается в пределах: для фосфамида 0,1—1 нг, для

метафоса, тиофоса, карбофоса — 0,1—4 нг.

На хроматограмме измеряют высоту или площадь пи-

ков. Расчет содержания препаратов в пробе ведут по

формуле

где X — количество препарата, мг/л или мг/кг; А — ко-

личество препарата в стандартном растворе, введенном

в хроматограф, нг; S

) — площадь (высота) пика пре-

парата в пробе, мм

(мм); Vi — объем экстракта, вве-

денный в хроматограф, мкл; V

— общий объем экстрак-

та после упаривания, мл; V

— количество анализируе-

мой пробы, мл (г); Si(Hi) — площадь (высота) пика

стандарта, мм

(мм).

Принцип метода основан на экстракции ДДВФ из тка-

ней животных ацетоном или его 80%-ным водным рас-

твором, очистке с использованием разной растворимости

ДДВФ и коэкстрактивных веществ в водных растворах

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДДВФ

'126

ацетона и этанола, хроматографировании в тонком слое

силнкагеля. Нижний предел обнаружения — 0,16 мг/кг.

Ход анализа. 25 г тканей животных измельчают в го-

могенизаторе, приливают к пробе 75 мл 80%-ного ацето-

на и гомогенизируют при малых оборотах. Для более

полной денатурации белков содержимое быстро нагре-

вают на водяной бане до начала кипения и охлаждают

водопроводной водой. Ацетоновый экстракт отделяют

центрифугированием в течение 10 мин при 2000 об/мин

или фильтрованием через бумажный фильтр.

Пробы жира после предварительного измельчения

растирают в ступке, затем переносят в колбу. Ступку

смывают 75 мл чистого ацетона. Жиры растворяют в

ацетоне при встряхивании в течение 30 мин. Содержимое

колбы охлаждают до 0°С и приливают 25 мл ледяной

воды. Ацетоновый раствор отделяют фильтрованием, пе-

реносят в ротационный испаритель и отгоняют раство-

ритель при 50 °С. Водную фазу переносят в делительную

воронку емкостью 150—200 мл в смеси эфиров (петро-

лейный и диэтиловый 3:2) и энергично встряхивают

3 мин, слоям дают разделиться и нижний отбрасывают.

Эфирный слой собирают и выпаривают (можно в выпа-

рительной чашке, куда вносят 5 мл 20%-ного этанола).

Водно-спиртовой' слой фильтруют через складчатый

фильтр в делительную воронку на 50 мл, чашку промы-

вают 3 мл 20%-ного этанола, который тоже переносят на

фильтр. К собранному фильтрату приливают 8 мл дистил-

лированной воды и извлекают ДДВФ, энергично встряхи-

вая 3 мин с 8 мл смеси эфиров. Нижний слой после раз-

деления сливают и отбрасывают. К этой фракции добав-

ляют 0,3—0,5 г безводного серно-кислого натрия и

оставляют на 5 мин. Эфирный раствор переносят в кони-

ческую центрифужную пробирку, в которую вставляют

стеклянный капилляр, запаянный в верхней части, и по-

мещают в водяную баню, предварительно нагретую до

36—40

C. Растворитель испаряют до объема 0,1—0,2 мл,

не допуская полного испарения.

Остаток из пробирки с помощью капилляра, запаян-

ный конец которого отламывают, количественно перено-

сят на хроматографическую пластинку. Пробирку смы-

вают 0,1 мл смеси эфиров и наносят в ту же точку. На

пластинку наносят стандартные растворы ДДВФ и по-

мещают в хроматографическую камеру, куда налит по-

движный растворитель (хлороформ и этилацетат 9:1).

После того как растворитель поднимется на 10 см, пла-

'127

стинку вынимают и оставляют на воздухе до полного

испарения растворителя, затем последовательно опры-

скивают 5%-ным раствором гидроксида натрия и

5%-ным раствором резорцина. Для образования окра-

шенных пятен пластинку осторожно нагревают над плит-

кой или в сушильном шкафу 5—7 мин при темпера-

туре 60 °С. При наличии ДДВФ образуется красное пятно

(стандартный раствор ДДВФ 40 мкг/мл в смеси эфиров).

Количество пестицида рассчитывают по формуле

где А — количество пестицида, найденное на пластинке

в анализируемой пробе, мкг; P — масса образца, г.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ КЕЛЬТАНА

Принцип метода основан на извлечении препаратов из

исследуемой пробы органическими растворителями

(н-гексан, петролейный эфир, диэтиловый эфир, хлоро-

форм), очистке экстракта и последующем хроматогра-

фировании в тонком слое окиси алюминия или силика-

геля. Подвижным растворителем служит н-гексан или

гексан — ацетон. Места локализации препаратов обна-

руживают после опрыскивания пластинок раствором

аммиаката серебра в ацетоне или 2%-ным раствором

дифениламина с последующим облучением ультрафиоле-

товыми лучами. Количественное определение проводят

визуальным сравнением или измерением площадей пятен

проб и стандартных растворов. Минимально детектируе-

мое количество при проявлении азотно-кислым сереб-

ром — 0,5 мкг, дифениламином — 10 мкг. Чувствитель-

ность определения — 0,002—0,1 мг/кг (л).

Ход анализа. 10 г зерна мелко измельчают, заливают

н-гексаном или петролейным эфиром и экстрагируют на

приборе для встряхивания порциями по 30 мл. Экстрак-

ты объединяют в делительной воронке, прибавляют

10 мл насыщенного раствора безводного серно-кислого

натрия в серной кислоте и осторожно встряхивают не-

сколько раз. Отделяют органический слой и повторяют

обработку, пока кислота не станет бесцветной. Сушат

экстракт безводным серно-кислым натрием и испаряют

растворитель до небольшого объема.

10 г измельченного сена или 20—30 г травы заливают

'128

100 мл ацетона. Встряхивают в течение 2—3 мин, при-

бавляют 20 мл ледяной дистиллированной воды и охлаж-

дают на льду в течение 30 мин. Экстракт сливают и

фильтруют холодным. Экстракцию повторяют. Ацетоно-

водные экстракты объединяют, ацетон отгоняют, из вод-

ного слоя экстрагируют препарат н-гексаном или петро-

лейным эфиром порциями по 10 мл 3 раза. Гексановые

экстракты очищают серной кислотой, насыщают и сушат

безводным серно-кислым натрием. Отгоняют раствори-

тель до небольшого объема и наносят на пластинку.

Если очистка произошла не полностью (после испарения

растворителя на колбе остается белый налет), экстракт

испаряют досуха, остаток промывают холодным ацето-

ном 3 раза по 0,2 мл и смывы наносят на пластинку.

Очищенную от чешуи и внутренних органов рыбу и

мясо измельчают в гомогенизаторе или мясорубке. 25 г

пробы заливают 40 мл н-гексана или петролейного эфи-

ра, взбалтывают 2 мин, разбивают образовавшиеся ко-

мочки и оставляют на 30 мин. Экстракцию повторяют

дважды. Экстракты объединяют, переносят в делитель-

ную воронку, прибавляют 10 мл насыщенного раствора

серно-кислого натрия в серной кислоте и осторожно

встряхивают несколько раз. Отделяют органический

слой. Обработку повторяют, пока кислота не станет бес-

цветной. Сушат экстракты безводным серно-кислым на-

трием и испаряют растворитель до объема 0,1 мл.

25 г измельченных внутренних органов и животного

жира помещают в колбу и заливают концентрированной

серной кислотой, насыщенной безводным серно-кислым

натрием, в таком количестве, чтобы кислота покрыла

пробу. Перемешивают стеклянной палочкой, прибавляют

40 мл н-гексана, встряхивают в течение 2 мин и остав-

ляют на 30 мин, периодически встряхивая. Экстракт сли-

вают, экстракцию повторяют. Объединенные экстракты

осторожно встряхивают в делительной воронке с кон-

центрированной серной кислотой, насыщенной серно-

кислым натрием. Операцию повторяют несколько раз до

получения бесцветного раствора серной кислоты, отде-

ляют гексановый слой, сушат безводным серно-кислым

натрием и испаряют.

0,2—2 мл цельной крови, 2—4 мл желчи, 10—20 мл

мочи помещают в пробирку с притертой пробкой и экс-

трагируют три раза порциями по 5—10 мл (20 мл для

экстракции мочи) диэтилового эфира в течение 15 мин.

Экстракт декантируют. Объединяют все порции, сушат

'129

безводным серно-кислым натрием и упаривают раство-

ритель до 0,1 мл.

5 г кала заливают концентрированной серной кисло-

той, насыщенной безводным серно-кислым натрием. Пе-

ремешивают и приливают 20 мл н-гексана, встряхивают

2 мин и оставляют на 30 мин, периодически перемеши-

вая. Экстракцию повторяют дважды. Объединенные экс-

тракты очищают в делительной воронке концентрирован-

ной серной кислотой, насыщенной безводным серно-кис-

лым натрием. Сушат и отгоняют растворитель до 0,1 мл.

Хроматографирование. На хроматографическую пла-

стинку на расстоянии 1,5 см от края при помощи шприца

или пипетки наносят исследуемую пробу в одну точку

так, чтобы диаметр пятна не превышал 1 см.

Колбочку с экстрактом трижды смывают небольши-

ми порциями (0,2 мл) диэтилового эфира, которые так-

же наносят в центр первого пятна. Справа и слева от

пробы на расстоянии 2 см наносят стандартные раство-

ры исследуемых препаратов, содержащие 1; 5 или 10 мкг

препарата (исходный 100 мкг/мл гексана). Пластинку

с нанесенными растворами помещают в камеру, в кото-

рую заранее налит подвижный растворитель н-гексан,

а для препаратов, у которых Rf в гексане ниже 0,3 —

гексан — ацетон 6:1.

После того как растворитель поднимется на 10 см,

пластинку вынимают из камеры и оставляют на несколь-

ко минут для его испарения. Далее пластинку орошают

проявляющим реактивом и облучают УФ-светом 10—

15 мин (проявляющий реактив: 0,5 г азотно-кислого се-

ребра растворяют в 5 мл дистиллированной воды, при-

бавляют 7 мл аммиака и доводят объем раствора до

100 мл ацетоном. Готовят в день употребления).

При наличии хлорорганических пестицидов на пла-

стинке проявляются пятна серо-черного цвета. Количест-

венное определение проводят путем сравнения размеров

пятен пробы и стандартного раствора (пропорциональ-

ность наблюдается только при содержании препаратов в

пробе до 20 мкг, при большем содержании пробу необ-

ходимо разбавить).

Расчет результатов производят по формуле

X = — или X =

1 1

P PSA

где X — содержание препарата в пробе, мг/кг (л); А —

количество препарата, найденного путем визуального

'130