Иванов А.Т., Петрова В.С., Кенигсберг Я.Э. Ветеринарная токсикология

Подождите немного. Документ загружается.

сравнения со стандартным раствором, мкг; P — масса

исследуемой пробы, г, мл; Ai — содержание препарата в

стандартном растворе, мкг; S

— площадь пятна стан-

дартного раствора, мм

; Si — площадь пятна пробы, мм

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДИЛОРА

Принцип метода основан на экстракции пестицида

н-гексаном (бензолом), очистке экстракта от мешающих

определению примесей концентрированной серной кисло-

той, хроматографировании в системе окись алюминия —

н-гексан и количественном определении препарата по

площади пятна путем сравнения со стандартом

(100 мкг/мл). Чувствительность определения — 0,5 мкг

в пробе.

Ход анализа. Навеску растительного образца 10—

60 г измельчают, помещают в коническую колбу объемом

700 мл, заливают н-гексаном (бензолом) и встряхивают

1 ч. Экстракт отфильтровывают через складчатый

фильтр, растворитель отгоняют до 0,3—0,5 мл на водя-

ной бане, переносят количественно в центрифужную про-

бирку и добавляют 0,3—0,5 мл концентрированной сер-

ной кислоты. Содержимое пробирки слегка взбалтывают

и оставляют до четкого разделения слоев. Верхний слой

раствора количественно собирают пипеткой и наносят

на хроматографическую пластинку.

К 0,5 л исследуемой воды добавляют -50—100 мл

н-гексана и экстрагируют при встряхивании 30 мин. Гек-

сан тщательно отделяют от воды в делительной воронке

(остатки воды мешают определению) и отгоняют до

остатка 0,5 мл, который в случае необходимости очищают

серной кислотой.

100 г измельченных органов животных помещают в

ступку и тщательно растирают вместе с 5—10 мл н-гек-

сана или бензола. Затем растертую массу количественно

собирают в колбу емкостью 50—200 мл, доливают рас-

творитель до покрытия массы и экстрагируют 30 мин.

Экстракт фильтруют через складчатый фильтр. Далее

проводят анализ, как для продуктов растительного про-

исхождения.

Хроматографирование. На хроматографическую пла-

стинку, покрытую сорбционной массой, состоящей из 5 г

безводной окиси алюминия, 0,5 г медицинского гипса,

7,5 мл дистиллированной воды, наносят экстракт, поме-

щают в камеру для хроматографирования и погружают

'131

на 1 см в подвижный растворитель (перегнанный н-гек-

сан). Хроматографирование проводят до поднятия фрон-

та подвижного растворителя на 10 см, пластинку выни-

мают, высушивают, обрабатывают проявляющим реак-

тивом (0,85 г азотно-кислого серебра, 2,5 мл аммиака,

97 мл дистиллированной воды) и облучают ультрафио-

летовыми лучами до четкого проявления стандартных

пятен (10—30 мин).

Идентификацию дилора проводят по величине пятен

и Rf, равной 0,8.

Расчет результатов анализа проводят по формуле

X =

ASa

P '

где X — содержание препарата в пробе, мг/кг или мг/л;

А — содержание препарата в стандартном растворе, мкг;

Si — площадь пятна стандартного раствора, мм

; S2 —

площадь пятна пробы, мм

; P — масса исследуемой про-

бы, г, мл.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПОЛИХЛОРКАМФЕНА И ПОЛИХЛОРПИНЕНА

Принцип метода основан на извлечении препаратов из

исследуемой пробы н-гексаном, очистке экстракта кон-

центрированной серной кислотой и хроматографировании

в тонком слое адсорбента.

Чувствительность определения ПХП и ПХК с по-

мощью дифениламина составляет 2 мкг, с помощью азот-

но-кислого серебра — 0,5—0,6 мкг в анализируемой

пробе.

Проявляющие растворы. 1. 0,5 г азотно-кислого се-

ребра растворяют в 2,5 мл дистиллированной воды, при-

бавляют 3 мл аммиака и доводят ацетоном до метки в

мерной колбе на 50 мл.

2. 0,5 г дифениламина и 0,5 г хлористого цинка рас-

творяют в 100 мл ацетона. Используют свежеприготов-

ленным.

Стандартный раствор готовят растворением 0,025 г

пестицида в н-гексане в мерной колбе емкостью 50 мл.

Концентрация раствора 500 мкг/мл.

Ход анализа. 100 мл воды экстрагируют н-гексаном

трижды по 50 мл в течение 3 мин каждый раз. Экстрак-

ты объединяют и промывают концентрированной серной

кислотой порциями по 25 мл до тех пор, пока свежая

порция кислоты перестанет окрашиваться и мутнеть.

'132

Слой кислоты отбрасывают, н-гексан промывают ди-

стиллированной водой два-три раза по 100—150 мл. Экс-

тракт фильтруют через воронку, заполненную безводным

серно-кислым натрием и упаривают досуха. К охлажден-

ному остатку приливают 0,05—0,1 мл н-гексана. С по-

мощью микропипетки отбирают аликвотную часть (10—

20 мкл) и наносят на пластинку.

25—50 г измельченного картофеля, свеклы, ботвы,

мяса, тканей внутренних органов крупных животных или

1—2 г тканей мелких животных заливают н-гексаном так,

чтобы проба была полностью покрыта им, и встряхи-

вают в течение 1 ч. Н-гексан декантируют, пробу зали-

вают свежей порцией его, встряхивают еще 1 ч и н-гек-

сан декантируют снова. Вытяжки объединяют и очищают

концентрированной серной кислотой, как для воды. Для

уменьшения порций кислоты при очистке можно настаи-

вать экстракт над ней в течение 1 ч, периодически встря-

хивая.

Для проб ботвы свеклы, картофеля необходима до-

полнительная очистка с помощью ацетона. Для этого к

очищенному и упаренному досуха экстракту приливают

холодный ацетон и фильтруют через бумажный фильтр.

Упаривают досуха, приливают 0,05—0,1 мл н-гексана.

Отбирают с помощью микропипетки аликвотную часть

и наносят на пластинку.

2 г жировой ткани измельчают, растирают в фарфо-

ровой ступке и переносят в химическую колбу. Прибав-

ляют 10—15 мл концентрированной серной кислоты и

оставляют на 1 ч, периодически встряхивая содержимое.

Затем прибавляют н-гексан (20—30 мл) и снова перио-

дически встряхивают в течение 1 ч. Экстракт деканти-

руют и экстракцию повторяют. Объединенные экстракты

очищают с помощью концентрированной серной кислоты,

как описано для воды.

5 мл крови или 30—50 мл мочи экстрагируют диэти-

ловым эфиром трижды порциями по 10, 30 и 50 мл. Эфир-

ные вытяжки соединяют и фильтруют через слой безвод-

ного серно-кислого натрия в колбу для отгонки раство-

рителя. Выпаривают на водяной бане досуха. Затем

приливают 0,05—0,1 мл н-гексана, отбирают аликвотную

часть и наносят на пластинку.

К 50 мл молока в делительной воронке приливают

25—30 мл разбавленной серной кислоты (1:1) и взбал-

тывают. Когда молоко створожится, проводят экстрак-

цию с помощью н-гексана дважды по 50 мл в течение

'133

5 мин каждый раз. Для ускорения разделения слоев в

воронку приливают несколько капель этилового спирта.

Гексановые экстракты объединяют, приливают 20—25 мл

концентрированной серной кислоты и осторожно взбал-

тывают. Затем оставляют воронку в спокойном состоя-

нии. Когда слои разделятся, нижний отбрасывают.

К гексану приливают свежую порцию кислоты и остав-

ляют на 1 ч, периодически встряхивая. Затем нижний

слой отбрасывают, дальнейшую очистку н-гексана про-

водят серной кислотой до тех пор, пока свежая порция

кислоты перестанет окрашиваться и мутнеть (еще 3—6

порций кислоты), или с помощью колоночной хромато-

графии. Стеклянную колонку высотой 20 см и шириной

2 см заполняют силикагелем марки ACK (объем 70 мл).

Предварительно пропускают 50 мл н-гексана и прошед-

ший растворитель отбрасывают. На подготовленную та-

ким образом колонку наносят упаренный до 30 мл экс-

тракт молока. После того как экстракт впитается в сор-

бент, препараты элюируют 90—100 мл н-гексана. Элюат

упаривают досуха, затем приливают 0,05—0,1 мл н-гекса-

на, отбирают аликвотную часть и наносят на пластинку.

Хроматографирование. При возможном совместном

присутствии в анализируемой пробе полихлорпинена и

ДДТ экстракт необходимо наносить на пластинки разме-

ром 6x6 см. Наносят стандартные растворы с помощью

микропипетки (10—20 мкл), пробы — с помощью капил-

ляра. Пробы и стандартный раствор в количестве 5—

10 мкл наносят так, чтобы диаметр пятна не превышал

3 мм, затем к пластинке прикладывают стеклянную

крышку так, чтобы она не прикасалась к силикагелю,

скрепляют резиновым кольцом и спускают в камеру для

хроматографирования. Подвижным растворителем слу-

жит смесь н-гексана, метилового спирта и аммиака в

соотношении 10 : 4 : 0,3. После поднятия подвижного рас-

творителя на высоту 4 см пластинку вынимают, снимают

крышку, пластинку сушат и опрыскивают 0,5%-ным

раствором дифениламина и хлористого цинка в ацетоне.

Затем пластинку нагревают в сушильном шкафу 10—

15 мин при 140—150 °С. При наличии полихлорпинена

или полихлоркамфена появляется голубовато-зеленое

пятно. Пятна ДДТ и ДДЕ окрашиваются в красный цвет,

ДДД — голубой, альдрина и ГХЦГ — не окрашиваются.

При отсутствии ДДТ и других хлорорганических пе-

стицидов хроматографирование экстрактов можно про-

водить на пластинках размером 9x12 см. На пластинку

'134

при помощи микропипетки наносят исследуемую пробу

в одну точку так, чтобы диаметр пятна не превышал

1 см. На расстоянии 2 см от места нанесения анализи-

руемой пробы на пластинку наносят стандартный рас-

твор ПХП (ПХК) и хроматографируют в смеси н-гекса-

на и этилацетата в соотношении 5 : 1. По окончании хро-

матографирования пластинку сушат на воздухе и опры-

скивают раствором азотно-кислого серебра и аммиака

в ацетоне. Затем ее сушат и облучают 10—15 мин

УФ-лучами до появления пятен. При наличии ПХП

(ПХК) и других хлорорганических пестицидов появляют-

ся черные пятна на белом фоне.

Значение величины Rf для ПХП (ПХК) — 0,83±0,05,

для ДДТ —

0,85

±0,05.

Количественное определение проводят путем сравне-

ния площади пятна пробы и стандартного раствора.

Расчет содержания препаратов в пробах воды, почвы,

продуктов растительного и животного происхождения,

крови, моче, проводят по формуле

X=**,

РБ

где X — содержание препарата, мг/кг или мг/л; А — ко-

личество пестицида, найденное путем сравнения со стан-

дартом, мкг; P — масса пробы, г; Б — количество иссле-

дуемого раствора, взятого для анализа, мл; В — общий

объем исследуемого раствора пробы, мл.

Если в пробе присутствует ПХП (ПХК) в количестве,

меньшем 10 мкг, на пластинку количественно наносят

весь остаток экстракта после упаривания.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭТИЛМЕРКУРХЛОРИДА

Принцип метода основан на извлечении этилмеркур-

хлорида из биологического материала соляной кисло-

той, реэкстракции хлороформом и титровании его дити-

зоном. Чувствительность — 1 мг/кг.

Реактивы. 1. Стандартный раствор этилмеркурхлори-

да 1 : 100 000 в хлороформе.

2. Дитизон перекристаллизованный: 1 г дитизона

растворяют в 100 мл хлороформа и помещают в дели-

тельную воронку емкостью 500 мл, добавляют 10 мл

3%-ного раствора аскорбиновой кислоты и 100 мл ам-

миака (1 : 100), встряхивают и получают в водном слое

оранжевое окрашивание (цвет дитизона). Экстракцию

'135

проводят 4—6 раз. Водные аммиачные вытяжки объеди-

няют и прибавляют раствор соляной кислоты 1 : 1 до тех

пор, пока не выпадут сине-фиолетовые хлопья. Хлопья

отфильтровывают и сушат между двумя листами филь-

тровальной бумаги. Хранят в склянке из темного стекла.

3. Растворы дитизона в хлороформе: а) основной

0,1%-ный раствор (1 мг в 1 мл) хранить под слоем

20 %-ного раствора серной кислоты; б) рабочий

0,001 %-ный раствор, хранить в холодильнике не более

2—5 дней.

Для определения титра 0,001 %-ного хлороформного

раствора дитизона 0,5—1,0 мл стандартного хлороформ-

ного раствора этилмеркурхлорида (1:100 000) вносят

в химический стакан, прибавляют 5 мл хлороформа,

10 мл ацетатного буфера, 5 мл дистиллированной воды

и титруют 0,001 %-ным хлороформным раствором дити-

зона до зеленой окраски. Рассчитывают титр дитизона.

Например, на титрование 1 мл стандартного хлороформ-

ного раствора этилмеркурхлорида 1 : 100 000 пошло

1,94 мл 0,001 %-ного хлороформного раствора дитизона,

следовательно, 1 мл 0,001 %-ного раствора дитизона со-

ответствует 0,0051 мг этилмеркурхлорида (ЭМХ).

Ход анализа. 20 г гомогената печени, почек, мышц,

50 г белка куриного яйца или другого патологического

материала заливают 80 мл 2,5 н. соляной кислоты и экс-

трагируют 30 мин при встряхивании. Смесь центрифу-

гируют или отфильтровывают через ватный тампон и

вновь дважды экстрагируют по 30 мин соляной кислотой

по 80 мл. В делительной воронке объединенные профиль-

трованные порции соляно-кислых вытяжек обрабатывают

хлороформом трижды по 15 мл. Хлороформ фильтруют

в мерную колбу на 50 мл и доводят до метки. К 1—3 мл

хлороформного экстракта добавляют 4 мл хлороформа,

10 мл ацетатного буфера, 5 мл дистиллированной воды

и титруют 0,001 %-ным раствором дитизона до перехода

желтой окраски в серовато-зеленую.

20—40 г зерна экстрагируют дважды 40—60 мл 2,5 н.

соляной кислотой по 15 мин, фильтруют соляно-кислые

вытяжки в делительную воронку через марлю или ват-

ный тампон и экстрагируют 3 раза хлороформом по 10 мл

в течение 5 мин. Хлороформные экстракты отделяют и

фильтруют в мерную колбу на 50 мл, промывают фильтр

небольшими порциями хлороформа и доводят до метки.

К 5 мл хлороформного экстракта добавляют 10 мл

ацетатного буфера, 5 мл дистиллированной воды и тит-

'136

руют 0,001 %-ным раствором дитизона до перехода жел-

той окраски этилмеркурдитизоната в серовато-зеленую.

Содержание этилмеркурхлорида вычисляют по фор-

муле

AT • 50 • 1000

где X — количество этилмеркурхлорида в патологиче-

ском материале, мг/кг; А — объем 0,001 %-ного хлоро-

формного раствора дитизона, затраченного на титрова-

ние в опыте, мл; T — титр 0,001 %-ного раствора дитизо-

на по этилмеркурхлориду; Б — объем экстракта, взятого

для анализа, г; В — масса органа, взятого для анализа,

г; 50 — объем всего экстракта, мл; 1000 — коэффициент

пересчета на 1 кг образца. ,

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СЕВИНА И А-НАФТОЛА

Принцип метода основан на экстрагировании севина

и его метаболита а-нафтола из патологического материа-

ла бензолом или хлороформом, упаривании, растворении

сухого остатка в этиловом спирте, в котором севин, гид-

ролизованный щелочью до а-нафтола, соединяется с диа-

зобензосульфокислотой с образованием изокраски крас-

ного цвета.

Метод определения севина в моче основан на очистке

ее с помощью уксусно-кислого свинца и последующей

экстракции препарата из фильтрата н-гексаном. Опреде-

ление севина и а-нафтола производят в спиртовой среде

путем реакции соединения его с диазотированным диме-

тил-н-фенилендиамином.

Чувствительность метода — 0,15—0,20 мг/л, или 3 мкг

севина в анализируемой пробе.

Приготовление диазотированной сульфаниловой ки-

слоты. Навеску 4 г сульфаниловой кислоты растворяют

в 60 мл 5%-ного раствора углекислого натрия и прибав-

ляют 2 г нитрита натрия. Затем смесь охлаждают на

льду и в раствор медленно по каплям вливают 20 мл

20%-ной соляной кислоты, охлажденной льдом. Выпав-

ший осадок отфильтровывают, отмывают на фильтре

50—100 мл этилового спирта и высушивают при комнат-

ной температуре на фильтровальной бумаге до воздуш-

но-сухого состояния.

Перед постановкой реакции готовят 0,5%-ный раствор

диазобензосульфокислоты в 10%-ном растворе едкого

натра. Реактив пригоден в течение одного дня.

'137

Ход анализа. 10 г измельченной ткани помещают в

банку с притертой пробкой, заливают 10 мл бензола или

хлороформа, перемешивают стеклянной палочкой и ста-

вят в холодильник (4°С) для экстракции на 12 ч. После

этого бензол или хлороформ сливают в фарфоровые

чашки, в исследуемый материал снова добавляют 10 мл

бензола или хлороформа и экстракцию повторяют в

течение 3—4 ч. Затем экстракты объединяют и испаряют

досуха.

Сухой остаток растворяют в 2—3 мл этилового спир-

та и сливают в пробирку, после чего фарфоровую чаш-

ку дополнительно ополаскивают несколько раз неболь-

шими порциями спирта с таким расчетом, чтобы общее

количество его для растворения остатка составило

10 мл.

К спиртовому раствору исследуемого материала до-

бавляют 0,05 мл 0,5%-ной диазобензосульфокислоты в

10%-ном растворе едкого натра. Пробирку встряхивают,

содержимое фильтруют через бумажный фильтр и остав-

ляют в штативе. Через 30 мин пробы колориметрируют

против этанола в кюветах с расстоянием между рабо-

чими гранями 5 мм при длине волны 490 нм (зеленый

светофильтр).

Расчет суммарного количества севина и а-нафтола

проводят по градуировочному графику. Для этого гото-

вят стандартные растворы севина в этаноле с концентра-

цией 0,1—20 мкг/мл объемом по 10 мл каждый. В стан-

дартные растворы добавляют 0,05 мл 0,5%-ной диазо-

бензосульфокислоты в 10%-ном растворе едкого натра,

через 30 мин колориметрируют и строят градуировоч-

ный график.

Кислую мочу разводят 0,25 н. уксусной кислотой в

соотношении 1:1; щелочную — 0,5 н. уксусной кислотой

(1:1 или 1:2) до кислой реакции. Для очистки от бал-

ластных веществ к разведенной моче прибавляют рас-

твор уксусно-кислого свинца из расчета 1 мл 20%-ного

раствора на каждые 10 мл разведенной мочи. После это-

го мочу фильтруют через бумажный фильтр.

Фильтрат в количестве, эквивалентном 10 или 20 мл

неразведенной мочи, переносят в делительную воронку

и трижды экстрагируют н-гексаном, используя каждый

раз 20—30 мл экстрагента. Экстракты объединяют и су-

шат путем добавления 1—2 г безводного серно-кислого

натрия. После этого н-гексановый экстракт сливают в

'138

выпарительную чашку, а оставшийся осадок дважды

промывают н-гексаном, который сливают туда же.

Экстракт упаривают до 5—10 мл, добавляют 0,2 мл

10%-ного раствора глицерина в этаноле. Оставшийся

н-гексан осторожно выпаривают, продувая над чашкой

струю теплого воздуха. Затем добавляют 3 мл 60%-ного

этанола и переносят раствор в колориметрическую про-

бирку. Чашку еще раз промывают 2 мл 60 %-ного этанола

и сливают смыв в ту же колориметрическую пробирку.

К раствору в пробирке добавляют 1 мл раствора едкого

калия и охлаждают пробу до 0—5

C. К охлажденному

раствору добавляют 1 мл диазореактива, приготовлен-

ного перед употреблением путем смешивания предвари-

тельно охлажденных до 0—5

C 0,05%-ного раствора

диметил-п-фенилендиамина серно-кислого в 1 н. соляной

кислоте и 2%-ного раствора нитрита натрия (10 : 1).

Через 3—5 мин после добавления диазореактива в

пробирку вносят 5 мл 60%-ного этанола и пробы поме-

щают в холодильник на 30—60 мин при 0—5 °С. Колори-

метрирование проводят, используя в качестве контроля

60%-ный этанол, едкий калий и диазореактив в тех же

соотношениях и в той же последовательности, что и в

опытных пробах (но без севина) при 490 нм "в кюветах

с расстоянием между гранями 20 мм. Малиновая окраска

устойчива в течение 6—8 ч.

Количественное определение препарата в пробах про-

водят по градуировочному графику. Готовят стандарт-

ный раствор севина с содержанием 100 мкг препарата в

1 мл спирта. Из стандартного раствора в пробы мочи

(10—20 мл) вносят соответственно 2, 3, 5, 10, 20 и 30 мкг

севина. Пробы анализируют по описанной выше схеме.

Расчет содержания севина в мг на 1 л мочи проводят

по формуле

X -

где X — содержание препарата в 1 л мочи, мг/л; А — со-

держание препарата в пробе, мкг; С — количество мочи,

взятой для анализа, мл.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТЕТРАМЕТИЛТИУРАМДИСУЛЬФИДА

(ТМТД)

Принцип метода основан на разрушении красящих ра-

стительных пигментов под воздействием водного раство-

ра щелочи с последующим извлечением препарата гек-

'139

саном, взаимодействии пестицида с очищенным последо-

вательно соляной и азотной кислотами реактивным си-

ликагелем, импрегнированным сульфатом меди, с кото-

рым ТМТД образует окрашенный в зеленый цвет тиура-

мат меди.

Приготовление реактивного силикагеля. Очищенный и

отмытый до нейтральной реакции силикагель измель-

чают, просеивают через сито с отверстиями 0,02—0,04 мм

и заливают 1%-ным раствором сульфата меди на 1 ч.

Жидкость сливают, силикагель подсушивают на филь-

тровальной бумаге, а затем в сушильном шкафу при

100

C. Хранят в плотно закрытых склянках.

Ход анализа. 10 г исследуемого растительного мате-

риала заливают 10—20 мл 0,5%-ного раствора едкого

натра (зерно — 10 мл, сено, комбикорм — 20 мл), перио-

дически встряхивают 30 мин. Затем добавляют 10 мл

н-гексана и встряхивают 30 мин.

После того как слои экстрагентов станут хорошо раз-

деляться, гексан декантируют и фильтруют через двой-

ной бумажный фильтр. К фильтрату прибавляют 0,2 г

реактивного силикагеля и встряхивают 30—60 с. В при-

сутствии ТМТД силикагель окрашивается в зеленый

цвет.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТРИАЛЛАТА

Принцип метода основан на извлечении триаллата из

исследуемой пробы н-гексаном, адсорбционной очистке

экстракта, испарении гексана и взаимодействии пести-

цида с пиридином в щелочной среде с образованием

окрашенного в вишнево-сиреневый цвет соединения, ко-

торое определяют колориметрическим путем.

В данных условиях альдрин, линдан, ДДТ не дают

цветной реакции, хлордан и гептахлор образуют соеди-

нения, окрашенные в желтовато-коричневый цвет, а по-

лихлорпинен образует комплексы коричневато-красного

цвета.

Чувствительность метода — 5 мкг триаллата в пробе,

или 0,5 мг/кг.

Ход анализа. Исследуемую пробу мяса и внутренних

органов (печень, почки, сердце, содержимое желудка,

легкие, селезенка) массой 5—10 г измельчают и прово-

дят экстрагирование триаллата н-гексаном в течение

1,5—2 ч два раза по 20—25 мл при- встряхивании. Экс-

тракты объединяют и пропускают через колонку, запол-

'140