Калинина О.С., Паникар И.И., Скибицкий В.Г. Ветеринарная вирусология

Подождите немного. Документ загружается.

Розділ 5

120

комбінація). У цьому процесі, очевидно, беруть участь ферменти

клітини-хазяїна, хоч і не виключається роль вірусоспецифічних фе-

рментів, закодованих у вірусному геномі. Для ДНК-вмісних вірусів,

за винятком поліомавірусів, характерна висока частота рекомбіна-

цій — від 14 до 38 %. Низька частота рекомбінацій у поліомавірусів

(до 0,2 %) зумовлена кільцевою структурою молекули ДНК. Пору-

шення її цілісності в результаті опромінення УФ-променями при-

зводить до істотного підвищення частоти рекомбінацій.

Унікальний механізм рекомбінації властивий РНК-вмісним ві-

русам із фрагментованим геномом (ортоміксо-, арена-, бунья- і рео-

віруси). Він полягає в обміні фрагментами геному між партнерами

на стадії морфогенезу, при цьому ковалентні зв’язки в нуклеїновій

кислоті не розриваються. Такий механізм рекомбінації називається

пересортуванням генів, або реасортацією. Наслідком цього є обмін

великими блоками спадкового матеріалу, що спричинює значну

зміну властивостей вірусу. Наприклад, вірус грипу А може отрима-

ти в результаті рекомбінації нові селективно цінні типи поверхне-

вих антигенів гемаглютиніну і нейрамінідази, що зумовлює анти-

генний шифт і призводить до виникнення пандемічних штамів. Ча-

стота рекомбінацій для РНК-вмісних вірусів із фрагментованим ге-

номом становить від 18 до 50 %.

Механізм рекомбінації у РНК-вмісних плюс-нитчастих пікорна-

вірусів (віруси поліомієліту та ящуру) полягає в обміні не генетич-

ним матеріалом, а спадковою інформацією. За умов змішаної інфек-

ції частина генетичної інформації при синтезі геномної РНК реком-

бінантів постачається одним із батьків, а друга частина — іншим

(механізм вибіркового копіювання зі зміною матриці). Частота ре-

комбінацій у пікорнавірусів невисока — 0,05 – 0,6 % (іноді до 1 %),

що зумовлено невеликими розмірами їхніх геномів.

Аналогічний механізм рекомбінації властивий ретровірусам. Як

відомо, геном ретровірусів диплоїдний, утворений двома ідентич-

ними плюс-нитками РНК і підлягає зворотній транскрипції. У ході

цього процесу ревертаза може «перескакувати» з однієї нитки РНК

на іншу, утворюючи гібридну матрицю ДНК. Якщо обидві молекули

РНК ідентичні, це не призводить до наслідків. Однак за наявності

вірусів-мутантів, які несуть різні молекули РНК, можлива поява

рекомбінантів з іншими геномами. Подібний механізм опосередко-

вує генетичну нестабільність у вірусу імунодефіциту людини (ВІЛ).

З усіх зворотних транскриптаз ретровірусів ревертаза ВІЛ найактив-

ніша щодо збою генетичного коду. За нуклеотидними послідовнос-

тями РНК ізоляти ВІЛ із різних пасажів одного вірусу можуть відрі-

знятися більше ніж на 20 %. Для ретровірусів характерна висока

частота рекомбінацій — 10 – 50 %.

Здійснення рекомбінацій призводить до утворення у вірусній по-

пуляції нових інтегрованих генотипів. Виникнення їх відбувається

Генетика вірусів

121

за рахунок не збагачення популяції генами з новими функціями, а

перерозподілу вже існуючих генів. У цьому полягає кардинальна

відмінність двох внутрішніх джерел спадкової мінливості вірусів:

унаслідок мутацій генофонд вірусної популяції поповнюється змі-

неними генами, а рекомбінації перерозподіляють уже існуючий

спадковий матеріал. Рекомбінації можуть слугувати для вірусної

популяції не тільки джерелом спадкової мінливості та створювати

генотипову різноманітність, а й виконувати протилежну роль —

згладжувати існуючі відмінності. Співвідношення і вираження цих

суперечливих процесів залежать від величини і генотипової різно-

манітності популяції, від надходження в неї нових генів та від час-

тоти і молекулярних механізмів рекомбінацій, властивих вірусам

різних таксономічних груп.

ВКЛЮЧЕННЯ У ВІРУСНИЙ ГЕНОМ ГЕНЕТИЧНОГО

МАТЕРІАЛУ КЛІТИНИ-ХАЗЯЇНА

Це слугує джерелом спадкової мінливості в онкогенних РНК-

вмісних ретровірусів, які на певній стадії репродукції вбудовують

ДНК-копію геному в генетичний апарат клітини. При цьому клітинні

гени в провірусну ДНК можуть включитися шляхом рекомбінації.

Подальша транскрипція інтегрованого ДНК-провірусу призводить до

появи у вірусному геномі клітинних генів, які підпадають під конт-

роль вірусних регуляторних механізмів. Ці гени не потрібні для роз-

множення ретровірусів, але продукти їхньої експресії спричинюють

трансформацію клітин, зумовлюючи таким чином онкогенні власти-

вості збудників. Тому ці гени називаються трансформувальними

генами, або онкогенами, а їхні клітинні аналоги — протоонкогена-

ми, які присутні в геномі кожної нормальної клітини і можливо, бе-

руть участь у регуляції клітинного поділу і диференціації. У складі

ретровірусів виявлено до 35 онкогенів клітинного походження.

В онкогенних ДНК-вмісних вірусів теж є трансформувальні гени,

але їхнє походження невідоме. Вони не мають гомології з клітинни-

ми протоонкогенами. Навіть якщо вони еволюціонували від клітин-

них генів, то відбулася їхня значна дивергенція, оскільки не спосте-

рігається рекомбінація трансформувальних генів онкогенних ДНК-

вмісних вірусів із клітинною ДНК.

ПОТІК ГЕНІВ

Під цим терміном розуміють природні процеси зміщення вірус-

них популяцій, які призводять до порушення ізоляції та спричиню-

ють одно- або двосторонній обмін генами. Внаслідок цього відбува-

ється збільшення запасів спадкової мінливості певної вірусної по-

пуляції за рахунок надходження генів з іншого генофонду.

Розділ 5

122

Стан ізоляції вірусної популяції, що створюється в організмі ха-

зяїна і може тривати при наступному передаванні збудника, пору-

шується за двох обставин: 1) при повторному зараженні; 2) при

змішуванні вірусу, який виділяється від різних хазяїв, у навколиш-

ньому середовищі та зараженні цим неоднорідним матеріалом но-

вих індивідів. Утворені в даному випадку вірусні популяції генеа-

логічно зв’язані з двома або кількома батьківськими популяціями й

отримують ту чи іншу частину їхнього генофонду. Ці явища постій-

но відбуваються при циркуляції вірусів у інфекційних осередках і

відіграють істотну роль у мінливості збудників.

ГЕНЕТИЧНІ ТА НЕГЕНЕТИЧНІ ВЗАЄМОДІЇ ВІРУСІВ

У природних та експериментальних умовах клітина може бути за-

ражена не одним, а багатьма віріонами одного штаму вірусу, генети-

чно різними штамами, або навіть неспорідненими вірусами. У проце-

сі такої змішаної інфекції виникають різні форми взаємодій між віру-

сними геномами або продуктами генів. Між вірусними геномами мо-

жуть бути такі форми генетичних взаємодій, як рекомбінація, гене-

тична реактивація, гетерозиготність. На рівні генних продуктів ви-

никають негенетичні взаємодії: комплементація, фенотипове змішу-

вання, інтерференція. Негенетичні взаємодії часто призводять до

фенотипового маскування істинного вірусного генотипу.

Рекомбінація детально висвітлена в розділі «Спадкова мінли-

вість вірусів». Нагадаємо, що рекомбінацією називають обмін генети-

чним матеріалом між батьківськими вірусами, внаслідок чого утво-

рюється потомство з властивостями, успадкованими від обох батьків.

Генетична реактивація є окремим випадком рекомбінації, ко-

ли один або обидва партнери неінфекційні внаслідок пошкодження

геному, але при змішаній інфекції дають повноцінне потомство, що

має ознаки обох батьків. Це потомство є рекомбінантами, в яких інак-

тивувальні пошкодження геному неінфекційного батьківського віру-

су еліміновані. Розрізняють множинну і перехресну реактивації.

Множинна реактивація виникає між неінфекційними партне-

рами, коли клітина заражається кількома віріонами з пошкодже-

ними геномами. Якщо інактивувальні пошкодження локалізовані в

різних ділянках вірусного геному, відбувається рекомбінація, вна-

слідок чого відновлюється повний генетичний набір, потрібний для

утворення повноцінного потомства. Зазвичай множинна реактива-

ція відбувається між вірусами, інактивованими УФ-променями. Її

спостерігають як між різними штамами або серотипами одного і то-

го самого вірусу, так і між неспорідненими вірусами (наприклад,

аденовірусом людини типу 12 і SV40). Ефективність множинної ре-

активації залежить від багатьох факторів: ступеня пошкодження

вірусного геному, множинності зараження, аутоінтерференції.

Генетика вірусів

123

Перехресна реактивація, або крос-реактивація, виникає між

інфекційним та інактивованим вірусами. У разі змішаної інфекції

виникає рекомбінація непошкоджених ділянок геному інактивова-

ного вірусу з геномом повноцінного вірусу, внаслідок чого з’явля-

ються штами з властивостями обох батьків. Цей феномен називають

також урятуванням маркера, оскільки реактивується лише части-

на геному інактивованого вірусу, яка несе певну генетичну ознаку

(маркер). За крос-реактивації рекомбінантні форми отримати значно

легше, ніж у разі схрещування двох нативних вірусів.

Гетерозиготність полягає в тому, що в разі змішаної інфекції

різними штамами вірусу утворюються віріони потомства, які містять у

своєму складі два батьківські геноми (повні гетерозиготи) або принай-

мні один повний геном і частину іншого (неповні гетерозиготи). Це

явище зумовлене неправильним упакуванням геномів при формуван-

ні віріонів складно організованих вірусів. Наприклад, потомство вірусу

ньюкаслської хвороби може містити понад 10 % повних гетерозигот.

Вони нестабільні та при наступній реплікації розділяються на батьків-

ські форми, на одну з батьківських форм і певний рекомбінант або на

два рекомбінанти. Феномен гетерозиготності не властивий просто ор-

ганізованим вірусам, у яких структурні обмеження при упакуванні

роблять малоймовірним потрапляння двох геномів у один капсид.

Комплементацією, або негенетичною реактивацією, на-

зивають взаємодію генних продуктів двох вірусів, що стимулює їхнє

розмноження, але не змінює генотипи. При цьому один вірус поста-

чає іншому компоненти, яких бракує для здійснення повного циклу

репродукції, зазвичай структурні або неструктурні білки.

Комплементація може бути дво- та односторонньою. Двосторон-

ня комплементація виникає між дефектними вірусами, кожен з

яких не здатний до самостійної репродукції. Обидва партнери за-

безпечують один одного потрібними генними продуктами. За одно-

сторонньої комплементації повноцінний вірус-помічник стимулює

репродукцію залежного від нього дефектного вірусу-сателіта, нада-

ючи йому потрібні білки.

Комплементація досить поширена серед вірусів як споріднених,

так і неспоріднених. Цей феномен тісно пов’язаний із дефектністю

вірусів. У вірусній популяції зазвичай присутні, крім стандартних,

дефектні віріони, зокрема ДІ-частинки, які втратили частину гене-

тичного матеріалу. Тому комплементація має місце в інфекційному

циклі багатьох вірусів і полягає в тому, що члени популяції поста-

чають один одному продукти генів, які дефектні в партнерів.

Комплементація трапляється і серед вірусів, що належать до різ-

них таксономічних груп. У цьому процесі часто беруть участь пред-

ставники родини Adenoviridae. В одних системах аденовіруси є де-

фектними, а в інших — діють як помічники. Наприклад, у культурі

клітин нирки африканської зеленої мавпи аденовіруси людини

Розділ 5

124

спричинюють абортивну інфекцію: цикл репродукції переривається

на пізніх стадіях через блокаду синтезу капсидних білків. У присут-

ності вірусу SV40 з родини Polyomaviridae ця блокада знімається

під дією Т-антигену SV40 й інфекція завершується формуванням

віріонів потомства. В інших системах аденовіруси виступають як

помічники, а сателітом є аденоасоційовані віруси з родини Parvo-

viridae. Синтез структурних компонентів аденоасоційованих вірусів

забезпечують продукти ранньої транскрипції аденовірусів.

Вірус гепатиту В є помічником для дефектного РНК-вмісного ві-

русу гепатиту D, надаючи йому свій поверхневий НВ

-антиген для

формування зовнішньої оболонки. Поєднання двох вірусів виявля-

ють при хронічному активному гепатиті, що в 41 % випадків закін-

чується цирозом печінки.

Фенотипове змішування — це явище, за якого геном одного

вірусу упаковується в капсид або суперкапсид, що складається пов-

ністю чи частково зі структурних білків іншого вірусу. В разі фено-

типового змішування об’єднуються тільки вірусні білки, генетичної

взаємодії між нуклеїновими кислотами не відбувається. Якщо обо-

лонка віріона (капсидна чи суперкапсидна) містить структурні біл-

ки обох батьків, такі варіанти вірусу нейтралізуються сироватками

проти вихідних штамів.

Фенотипове змішування досить поширене серед просто організо-

ваних вірусів, як близькоспоріднених (наприклад, віруси поліоміє-

літу типів 1 і 2), так і віддаленіших (віруси ЕСНО типу 7 і Коксакі

типу А9). Коли дочірній геном вбудовується в капсид, що складаєть-

ся повністю з білків іншого вірусу, це явище називають транскап-

сидацією. Іноді більша частина потомства має гетерологічний кап-

сид. Транскапсидація виявлена, наприклад, у вірусу ящуру та ен-

теровірусу ВРХ або у вірусів поліомієліту і Коксакі.

У деяких складно організованих вірусів фенотипове змішування

часто відбувається так, що нуклеокапсид одного вірусу виявляється

оточеним суперкапсидною оболонкою іншого, тобто формується псев-

дотип. Наприклад, вірус везикулярного стоматиту утворює псевдо-

типи з вірусами грипу птахів, простого герпесу, онкогенними ретро-

вірусами птахів і мишей.

Фенотипове змішування є тимчасовим феноменом: у наступному

поколінні віріони відтворюють ознаки того вірусу, чию нуклеїнову

кислоту вони містять.

Інтерференція полягає в здатності одного вірусу пригнічувати

розмноження іншого. Залежно від спорідненості між вірусами-

партнерами розрізняють гомологічну інтерференцію, яка виявляєть-

ся тільки стосовно гомологічного або близькоспорідненого вірусу, і

гетерологічну інтерференцію, що виникає між вірусами різних так-

сономічних груп. Інтерференція між вірусами може виявлятися на

різних стадіях репродукції внаслідок конкуренції за синтезовані ві-

Генетика вірусів

125

русоспецифічні макромолекули, а також за рахунок утворення особ-

ливого білка — інтерферону, який виробляється клітинами у відпо-

відь на вірусну інфекцію та має виражену противірусну активність.

Найцікавішою для генетики є гомологічна інтерференція. Однією

з її форм є аутоінтерференція, що спостерігається в процесі серій-

ного пасажування за високої множинності зараження. У цих умовах

сумарний урожай віріонів залишається відносно постійним, проте

вміст інфекційного вірусу знижується в міру пасажування. Отже,

спостерігається інтерференція щодо зростання інфекційної частини

вірусної популяції. Вивчення таких інтерферувальних вірусних по-

пуляцій показало, що вони містять значну частину ДІ-частинок. Ці

делеційні мутанти інтерферують із розмноженням інфекційного

вірусу, ефективно конкуруючи за компоненти реплікативного ком-

плексу, наприклад, за полімеразу, що призводить до утворення все-

зростаючої частини ДІ-частинок.

Гомологічна інтерференція спостерігається і з ts-мутантами, які

інтерферують із репродукцією вірусу дикого типу як за пермісивної,

так і непермісивної температури.

ГЕННА ІНЖЕНЕРІЯ

До цього часу йшлося про генетичні процеси, які відбуваються

при взаємодії біологічно та еволюційно близьких вірусів. Проте мож-

ливі генетичні взаємодії й неспоріднених вірусів, що є предметом

дослідження генної інженерії. Цей новий напрям у генетиці та

біотехнології виник завдяки успішному розвитку молекулярної біо-

логії. 31 липня 1972 р. у Національній академії наук США було

представлено першу

генно-інженерну роботу П.Берга про створення

in vitro химерної ДНК, яка не мала аналогів у природі: гібриду мав-

пячого вірусу 40 (SV40) і бактеріофага λ. Цей химерний геном був

уведений у формі плазміди в бактеріальну клітину (Esсherichia coli)

й експресований з утворенням вірусоспецифічних білків.

На відміну від класичної та молекулярної генетики, генна інже-

нерія має своїм об’єктом дослідження не клітини, не віруси, а гени

або їхні групи, оперуючи з ними не як із біологічними об’єктами, а як

із молекулами або фракціями молекул. Генна інженерія вивчає за-

кономірності конструювання in vitro нових генетичних структур —

рекомбінантних (гібридних) ДНК і клонування їх у реципієнтній клі-

тині. Мета генної інженерії — пересадження генів у гетерогенні сис-

теми, їхня експресія для отримання біологічно активних білків (гор-

монів, ферментів, антигенів тощо). Головним завданням генної інже-

нерії є вибір таких клітинних систем, які б забезпечили економічно

вигідну технологію виробництва біологічно активних речовин. Осно-

вним об’єктом при виборі клітинних систем, де вводяться гени і здій-

снюється їхня експресія, є прокаріоти (бактерії, насамперед E. coli) та

Розділ 5

126

найпростіші еукаріоти (дріжджі). У деяких випадках доцільно вико-

ристовувати вищі еукаріотні системи (клітини птахів і ссавців).

Основним інструментом генно-інженерних робіт є певні ферменти і

насамперед рестриктази, або рестрикційні ендонуклеази, які

отримують із бактеріальних клітин. Рестриктази досить поширені се-

ред прокаріотів і беруть участь у генетичних процесах. Вони захища-

ють бактеріальну клітину від чужорідної ДНК, розщеплюючи ДНК

бактеріофагів. Відомо понад 500 рестриктаз, які характеризуються ви-

сокою специфічністю. Рестриктази розпізнають у молекулі дволанцю-

гової ДНК строго визначені нуклеотидні послідовності (зазвичай 4 – 7

пар нуклеотидів) і розщеплюють обидві нитки ДНК на фрагменти

розміром від кількох сотень до кількох тисяч пар нуклеотидів. При

генно-інженерних маніпуляціях за допомогою різних рестриктаз вда-

ється отримати потрібні фрагменти геномів або окремі гени. Здебіль-

шого рестриктази утворюють у місцях розрізу молекул ДНК липкі кін-

ці, комплементарні один одному, що дає змогу з’єднувати окремі гени

або генетичні елементи (екзони, інтрони тощо). Якщо липкі кінці не

формуються, їх створюють штучно за допомогою ферменту кінцевої

трансферази. Для ковалентних зшивань ниток ДНК застосовують

фермент ДНК-лігазу, яку виділяють з E. coli.

Чужорідний генетичний матеріал можна ввести в клітину за до-

помогою вектора. Це молекула ДНК, яка здатна до автономної ре-

плікації в реципієнтній клітині та забезпечує експресію вбудованих

у неї чужорідних генів. Векторами можуть слугувати плазміди, бак-

теріофаги, штучні структури (наприклад, косміди — похідні фагів і

плазмід). Зручними векторами для еукаріотних клітин є деякі віру-

си тварин: із ДНК-вмісних — віруси вісповакцини, поліоми, папі-

ломи, SV40, герпесу, аденовіруси; із РНК-вмісних — ретровіруси.

Крім векторів, іноді застосовують додаткові генетичні елемен-

ти. Якщо при утворенні генетичної структури в

потрібному гені

відбулося зрушення рамки зчитування, тоді у відповідну ділянку

потрібно вставити лінкер — синтетичний олігонуклеотид, який ви-

править зрушену рамку. Іноді при вирізанні гена втрачається іні-

ціювальний кодон АУГ, тоді його доводиться ковалентно з’єднувати

з початком гена. У багатьох випадках до початку гена потрібно при-

єднати сильно діючий промотор — специфічну ділянку ДНК, яка

виконує регуляторну функцію за рахунок приєднання РНК-полі-

мерази, що ініціює транскрипцію. Часом доводиться відділяти про-

мотор, який надто близько розміщений до початку гена, невеликим

олігонуклеотидом — спейсером. Іноді для успішного функціону-

вання гена слід застосовувати тандемну ампліфікацію — по-

вторити ген кілька разів, поставивши один за одним.

До цього часу йшлося про гени, які порівняно легко отримати.

Що стосується генів вищих еукаріотів (наприклад, інсуліну або ін-

терферону людини), то виділити їх серед десятків тисяч генів, які

Генетика вірусів

127

містяться в геномі еукаріотної клітини, — непосильне завдання.

Крім того, гени еукаріотів не можуть бути безпосередньо використа-

ні через їхню мозаїчну структуру, що полягає в чергуванні екзонів

та інтронів. Тому для отримання таких генів спочатку індукують

синтез відповідної іРНК, використовуючи спеціалізовані клітини.

Так, іРНК інсуліну отримують in vitro з клітин інсуліноми (пухлини

підшлункової залози), а іРНК інтерферону — з лейкоцитів донор-

ської крові. При дозріванні іРНК за допомогою спеціальних ферме-

нтів вирізають ділянки, які відповідають інтронам. Виділяють іРНК

із полісом і піддають зворотній транскрипції за участю РНК-за-

лежної ДНК-полімерази (син.: зворотна транскриптаза, ревертаза),

яку отримують із віріонів вірусу мієлобластозу птахів. Цей фермент

синтезує на матриці іРНК

комплементарну нитку ДНК. Другу нит-

ку ДНК отримують за допомогою ДНК-полімерази E. coli.

Отриманий ген (у цьому разі ген інсуліну або ген інтерферону)

вводять у вектор — плазміду рВР322 за участю ферментів рестрик-

тази, кінцевої трансферази і ДНК-лігази й отримують таким чином

молекулу рекомбінантної ДНК. Вбудовування гена у векторну ДНК

проводять у відповідних ділянках, наприклад, у гени плазміди, які

визначають стійкість бактерії до того чи іншого антибіотика. Це

призводить до пошкодження гена і супроводжується втратою анти-

біотикостійкості тією бактеріальною клітиною, що стане носієм ре-

комбінантної ДНК.

Наступним етапом генно-інженерних маніпуляцій є клонування

рекомбінантної ДНК і введення її в реципієнтні клітини (зокрема

Е. соlі) з подальшою селекцією та клонуванням цих клітин. Для

вбудовування рекомбінантної ДНК у бактерію створюють відповідні

умови. Наприклад, гіпотонічний розчин кальцію хлориду при 0 –

10 °С і тепловий шок роблять клітинні стінки бактерій проникними

для рекомбінантної ДНК. Слід зазначити відносно невисоку ефек-

тивність трансформації бактеріальних клітин. Так, із 10

рекомбі-

нантних молекул із вбудованим геном ІФН-α тільки одна поглина-

ється клітиною-хазяїном.

Наступним етапом є пошук бактеріальних клітин, що містять

рекомбінантну ДНК. Для цього використовують селективні середо-

вища і відбирають колонії, в

яких виявив себе селективний маркер,

наприклад, ген стійкості до ампіциліну, зруйнований під час гене-

тичних маніпуляцій. Після відбору позитивних колоній перевіря-

ють наявність вбудованого гена методом молекулярної гібридизації

та рестрикційного аналізу.

Створенням і клонуванням рекомбінантної ДНК завершується ли-

ше перший етап генно-інженерних робіт. Головна мета — досягти

експресії потрібного гена в прокаріотних чи еукаріотних клітинах і на

основі сучасних методів молекулярної біології розробити технологію

отримання білкового продукту в умовах промислового виробництва.

Розділ 5

128

Генна інженерія відкриває широкі можливості й перспективи

для створення вірусних вакцин. Препарати нового покоління міс-

тять лише протективні вірусні антигени, що стимулюють утворення

вірусонейтралізувальних антитіл. Такі субодиничні вакцини (проти

гепатиту В, грипу А, сказу, ящуру та ін.) були отримані мікробіоло-

гічним синтезом з використанням плазмідного або фагового векто-

ра, в який вбудували гени протективних вірусних білків. Проте бі-

льшість протективних антигенів вірусів є продуктами складних

внутрішньоклітинних модифікацій, які не можуть здійснити фер-

ментні системи бактерій і дріжджів. Здебільшого потрібно застосо-

вувати клітини вищих еукаріотів (птахів і ссавців), що робить генно-

інженерні вакцини нерентабельними. Проте для вірусів, які важко

культивуються в лабораторних умовах, цей шлях є виправданим.

Перспективним напрямом у створенні генно-інженерних вакцин

є використання в ролі вектора великих вірусів тварин, у геном яких

вбудовують гени протективних вірусних білків. Найвдалішою мо-

деллю для отримання таких рекомбінантних вакцин є вірус віспо-

вакцини. Він має великий геном (187 тис. пар нуклеотидів), в який

без шкоди для репродукції вірусу можна вбудувати до 25 тис. пар

нуклеотидів чужорідного генетичного матеріалу, тобто кілька генів,

що кодують протективні вірусні білки. Найзручнішим місцем для

їхнього введення є ділянка ранніх генів вірусу вісповакцини, зок-

рема ген тимідинкінази, який має сильний промотор. Така локалі-

зація чужорідного гена забезпечує його ефективну транскрипцію, не

блокує розмноження рекомбінантного вірусу вісповакцини і створює

маркер щодо пошкодження гена тимідинкінази, який потрібний

для відбору генетично змінених клонів.

На основі вірусу вісповакцини розроблено рекомбінантні вакцини

проти гепатиту В, грипу А, сказу, хвороби Ауєскі, везикулярного сто-

матиту, ньюкаслської хвороби та ін. Враховуючи безпечність і нала-

годжене виробництво вісповакцини, на основі цього вірусу можна

конструювати не тільки моновалентні, а й полівалентні препарати.

Крім вакцин, генно-інженерні методи використовують також під

час розробки досконаліших діагностикумів. Так, для експрес-

діагностики вірусних інфекцій застосовують метод молекулярної

гібридизації нуклеїнових кислот. Він ґрунтується на взаємодії

вірусного геному з комплементарною ДНК, міченою радіоактивним

ізотопом або ферментом. Такий мічений комплекс ДНК називають

ДНК-зондом. Для його отримання в плазмідний вектор вводять

фрагмент вірусної ДНК (або ДНК-копію потрібного фрагмента віру-

сної РНК) й отримують рекомбінантну ДНК. Метод молекулярної

гібридизації показав високу чутливість і достовірність при виявлен-

ні в патологічному матеріалі геномів вірусів хвороби Ауєскі, інфек-

ційного ринотрахеїту ВРХ, аденовірусу ВРХ, інфекційного ларинго-

трахеїту птиці та ін.

Генетика вірусів

129

Принципово новим діагностичним методом є рестрикційне

картування (рестрикційний аналіз) вірусних геномів. Осно-

ва цього методу — складання фізичних карт вірусних геномів, які

показують взаємне розміщення генів, їхні межі, локалізацію почат-

ку реплікації, промоторів, лідерів, екзонів та інтронів, сигнальних

послідовностей та інших генетичних елементів. Справжню револю-

цію у фізичному картуванні геномів вірусів здійснило застосу-

вання рестриктаз і метод секвенування (встановлення послі-

довності нуклеотидів). Як вже зазначалося, рестриктази специфічно

розпізнають нуклеотидні послідовності та розщеплюють молекулу

ДНК у строго визначених місцях. Застосування широкого набору

рестриктаз дає змогу отримати фрагменти вірусного геному різної

величини, які потім розділяють та аналізують за допомогою елект-

рофорезу в агарозному або поліакриламідному гелі. Поєднання рес-

трикційного аналізу з методом секвенування дало змогу скласти

фізичні карти геномів вірусів із точністю до одного нуклеотиду. У

разі РНК-вмісних вірусів обов’язковою умовою для їхнього рестрик-

ційного аналізу є зворотна транскрипція, тобто отримання ДНК-

копії РНК-геному з допомогою зворотної транскриптази (ревертази).

Рестрикційний аналіз гарантує точну типізацію близькоспорід-

нених вірусів, що не завжди вдається зробити іншими молекулярно-

біологічними та імунохімічними методами. Крім того, рестрикцій-

ний аналіз має важливе значення при стандартизації та контролі

біопрепаратів.

Незважаючи на великі успіхи, труднощі, які стоять перед генною

інженерією, ще не подолані. Якщо прийняти за 100 % шлях від по-

чатку досліджень до промислового, комерційно вигідного продук-

ту — вакцини, інтерферону чи гормону, то оцінити кожен із трьох

основних етапів цього завдання можна так: отримання рекомбінант-

них молекул ДНК — 10 %, досягнення експресії потрібного гена в

прокаріотних або еукаріотних клітинах — 30 %, вихід на економічно

вигідну технологію — 60 %. Незважаючи на всі ці труднощі, генна

інженерія стала ядром сучасної біотехнології, і внесок її у виробницт-

во з кожним роком зростає.

? Контрольні запитання

1. Яка особливість генетичного дослідження вірусів? 2. Схарактеризуйте

структурну організацію вірусного геному та регуляцію його активності.

3. Назвіть механізми збільшення генетичної інформації у вірусів. 4. Що

таке генетичні ознаки, генотип і фенотип вірусів? 5. Схарактеризуйте ві-

русну популяцію, її генофонд і генетичну неоднорідність. 6. Які процеси

лежать в основі спадкової мінливості вірусів? 7. Що таке модифікації віру-

сів? 8. Схарактеризуйте мутації у вірусів, їх механізм і наслідки. 9. Назвіть