Волькенштейн М.В. Общая биофизика

Подождите немного. Документ загружается.

6.1.

БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ

281

Здесь

НАД —

кофермент никотинамидадениндинуклеотид

(рис.

6.2),

Е —

фермент, ФАД— кофермент флавинадениндинуклеотид

он

сн

о о не;

iill°

II II \ "С

HS-CH2-CH

-NH-C-CH

-NH-C-CH-C-CH

-0-P-0-P-0-CH

1|K ^

сн

№

Рис.

6.1.

Кофермент

А.

(рис.

6.3), АДФ и

АМФ

—

аденозиндифосфат

аденозинмоно-

фосфат,

ФФ

—неорганические моно-

дифосфаты. Обратим

внимание

попутно

на

общность

строения

АТФ,

КоА—SH,

НАД и

ФАД

(см. [3], гл. 2). При

разруше-

нии

жиров

конечном счете обра-

зуется ацетил-КоА,

также

про-

пионил-КоА

глицерин.

Расщепление

окисление

угле-

водов

(в

частности, крахмала)

при-

водит

образованию триозофосфа-

тов

пировиноградной кислоты

При

разрушении белков, наряду

с индивидуальными аминокислота-

ми,

используемыми

синтезе

бел-

ков

novo,

образуются ацетил-

Ко

А,

оксалацетат, а-кетоглутарат,

фумарат

сукцинат.

Эти

процессы

метаболизма детально изучены

современной

биохимии

(см. [1, 2]).

Основные продукты расщепле-

ния

окисления жиров,

углеводов

белков претерпевают дальнейшие превращения

цикличе-

ской

системе реакций, именуемой

циклом лимонной

кислоты

или

циклом Кребса. Эта

система локализована

митохондриях.

Цикл

Кребса, «образно говоря,

та

главная

ось,

вокруг которой

вертится метаболизм почти

всех

существующих клеток... Цикл

"О-Р-О-СН,

„

НО—1

Рис.

>с-

р=о

он

\н

Ы-

он

НС

СН

.4/1

он

л*

не

^С

•с/|

он

СН

6.2. Никотинамидаденин-

динуклеотид

(НАД).

282 ГЛ. 6. СОПРЯЖЕННЫЕ ПРОЦЕССЫ В МИТОХОНДРИЯХ

Кребса является

«фокусом»,

в котором сходятся все метаболи-

ческие

пути»

[1].

Цикл

Кребса изображен на рис. 6.4. За один оборот цикла,

состоящего из восьми реакций, отмеченных на рисунке цифрами

в кружках, происходит деградация одной молекулы ацетил-КоА

он

он он оо не | |

с—сн—сн—сн—сн

—о—р—о—р-о—сн

\ /

Vvvv

*• ™

$$ "

I I I

vvv $

I I

Н II

Рис.

6.3. Флавинадениндинуклеотид (ФАД).

или одной молекулы пирувата до СОг и НгО, т. е.

«сгорание»

этих молекул. Соответствующие суммарные реакции имеют вид

COS

- КоА + 3 НАЦ

+ (ФАД) + ГДФ + Ф„ + 2 Н

О —•

—• 2 СО

+ КоА - SH + 3 НАД-Н + (ФАД-Н) + ГТФ + ЗН

Пируват" + КоА - SH + НАД

—-+ CH

COS - КоА + НАД-Н

+ Н

+ СО

(Скобки

обозначают, что ФАД тесно связан с белком.)

От цикла Кребса

идут

пути многих биосинтетических реак-

ций

— пути синтеза

углеводов,

липидов, пуринов, пиримидинов

порфиринов. Синтез белков также связан с циклом, в котором

создаются предшественники ряда аминокислот.

Вместе

с тем,

как

мы увидим, биологическое окисление является источником

энергии,

запасаемой в АТФ и необходимой для биосинтетических

процессов.

В реакциях цикла возникают СО

и ионы Н

. Одновременно

происходит восстановление коферментов НАД и ФАД. Для не-

прерывного и полного биологического окисления эти кофермен-

ты должны окисляться вновь. Окисление осуществляется сово-

купностью переносчиков электронов, образующих цепь переноса

электронов

(ЦПЭ),

фиксированную в митохондриях. ЦПЭ обес-

печивает

следующие

реакции:

3 НАД-Н + 1,5 О

+ ЗН

—

•>

3 НАД"

" + 3 Н

О — 3

•

52,4 ккал/моль,

(ФАД-Н) + 0,5 О

—>• (ФАД) + Н

О — 36,2 ккал/моль.

§61 БИОЛОГИЧЕСКОЕ

ОКИСЛЕНИЕ

283

Реакция

ацетил-КоА имеет вид

COS

— КоА + 2 О

-> 2 СО

+ Н

О + КоА — SH - 215,2 ккал/моль

ЦПЭ,

иначе именуемая дыхательной цепью, представляет собой

Углеводы+•

СН

Пируват

KaA-SH-~\

-KOA

СН,

Жирные

'кислоты

Тре-ЪА,-изоцитрат,

а-кетоглутарагд

Рис.

6.4.

Цикл

Кребса.

полиферментную систему, акцептирующую электроны из цикла

Кребса и цикла окисления жирных кислот.

284

ГЛ. 6. СОПРЯЖЕННЫЕ ПРОЦЕССЫ В МИТОХОНДРИЯХ

Электрон переносится по следующей цепи

[1,2,4]:

Сукцинат —• ФП

;

Субстрат -

Цитохром С\

НАД —• ФП

>•

Цитохром с —

-*• Цитохром Ь —•

Цитохромы а + аз

О,

Флавопротеиды — специфические ферменты, содержащие флави-

новые коферменты — ФАД (см. рис. 6.3) и флавинмононуклео-

тид ФМН, рибофлавин-5'-фосфат. Цитохромы содержат группу

гема, атом железа которого при работе цепи подвергается окис-

лению и восстановлению:

Перенос электронов в приведенной цепи происходит слева на-

право, завершаясь восстановлением кислорода, который соеди-

няется с водородом и образует

воду.

Освобождаемый при окис-

лении электрон соединяется со следующим звеном цепи. Перенос

электронов сопровождается изменением свободной энергии, так

как

электроны перемещаются по каскаду возрастающих окисли-

тельно-восстановительных потенциалов Их значения приведены

в табл. 6.1 [1].

Таблица 6.1

Окислительно-восстановительные

потенциалы

некоторых

систем

Система

O/'/

Цит

aFe

/Fe

Цит

+/Fe

Цит

с,

/Fe

Цит

Ь Fe

7Fe

Сукцинат/фумарат

Глутамат/а-кетоглутарат

1р, В

0,82

0,29

0,23

0,21

0,05

-0,03

—0,14

Система

Восстановленный флавин/фла-

вин

Лактат/пируват

НАД-Н/НАД

Малат/пируват

'/гНг/Н

Ацетальдегид/ацетат

ф,

-0,189

-0,19

-0,32

-0,33

-0,42

—0,60

Перенос электронов по дыхательной цепи сопряжен с запа-

санием энергии в макроэргических молекулах АТФ. Иными сло-

вами, освобождаемая свободная энергия конвертируется в хи-

мическую энергию АТФ. Происходит окислительное фосфорили-

рование.

Это важнейшее явление было впервые открыто Энгельгард-

том в 1930 г. [5]. Белицер и Цыбакова [6] подробно изучили

стехиометрические соотношения

между

окислением и фосфори-

лированием, провели первые определения коэффициента Ф

: О,

т. е. отношения числа молекул этерифицированного неорганиче-

6.1

БИОЛОГИЧЕСКОЕ

ОКИСЛЕНИЕ

285

ского фосфата

числу атомов поглощенного кислорода,

и по-

казали,

что

значение этого коэффициента

не

менее

2. В

работе

[6] были даны термодинамические оценки, показавшие,

что

энер-

гия переноса электронов

на

кислород достаточна

для

образова-

ния

двух

или

большего числа молекул

АТФ на

один атом

по-

глощенного кислорода. Калькар установил,

что

аэробное фосфо-

рилирование сопряжено

дыханием

и не

зависит

от

гликолити-

ческого фосфорилирования

[7].

Количественные соотношения

были уточнены Очоа

[8].

Коэффициент

Ф„:

О для

окислительных

реакций цикла Кребса

реакций

участием

НАД

равен

Ленинджер впервые установил,

что

процессы окислительного

фосфорилирования локализованы именно

митохондриях

[4, 9,

Пирубот Сукцинат

Маш,

™^

Изоцитрат

--^>*S

Ч» ^ S ' ' .

НАД— ФП,—>-KoQ—^uumb—-цат

с.-^-цитс-^цит

#+&—*-

О,

Глутамат-

З-оксиацил-Ш;

КоА -производное

жирной

кислоты

Глицеророарат

Рис.

6.5. Дыхательная

цепь

[1, 2].

Прямые стрелки показывают места вхождения электронов. ФП,, ФП

, ...—флавопротеиды.

KoQ

—кофермент

10],

и в

работах

его

лаборатории были найдены узловые пункты

дыхательной цепи,

которых происходит фосфорилирование.

Указанное значение

: О

следует

из

уравнения

НАД-Н

+ 3

АДФ

+ 3

Ф„

+ VsOj —>

НАД

+ 4

+ 3

АТФ.

этом уравнении суммируются экзергоническая реакция

НАД-Н

+ Н

—>

НАД

+ 52,7

ккал/моль

эндергоническая реакция

ЗАДФ

ЗФ„

—» 3

АТФ+ ЗН

—21,9

ккал/моль.

Фосфорилирование

АДФ -> АТФ

происходит

трех

узловых

пунктах

— в

участке цепи НАД-Н

—»

флавопротеид,

участке

цитохром

Ь -*

цитохром

С] и в

участке цитохром с—•цитохромы

Общая схема сопряжения окисления

фосфорилированием

приведена

на рис. 6.5.

Напишем

вновь брутто-уравнение фосфорилирования

АДФ +

РО4

+ H

ц=± АТФ + Н

О - ДО,

286 ГЛ. 6. СОПРЯЖЕННЫЕ ПРОЦЕССЫ В МИТОХОНДРИЯХ

где AG — изменение свободной энергии. Имеем

°4'][н1

[АТФ] [Нг0]

(6-1)

— стандартное изменение свободной энергии в калориях,

т. е. значение AG при рН 7,0, 25 °С и концентрациях

всех

компо-

нентов,

равных 1,0 М. Как известно,

AG°

= -RT In К, (6.2)

где К — константа равновесия реакции. Для фосфорилирования

AG° = 7,3 ккал/моль. Наблюдаемое значение AG in

vivo

зависит

от концентрации протонов по обе стороны мембраны и, следо-

вательно, от мембранной разности потенциалов. AG зависит так-

же от концентрации ионов Mg

. При изменении рН от 6,0 до

9,0 при

[Mg

]

= 10 мМ AG меняется от 6,17 до 9,29 ккал/моль

(см.

[79,

113]).

Изменение

свободной энергии при переносе

двух

электронных

эквивалентов по ЦПЭ от НАД-Н к О

определяется разностью

окислительно-восстановительных потенциалов 0,82 —

(—0,32)

1,14 В, т. е.

= г Aip = — 2

•

23,06

-1,14 ккал/моль = — 52,7 ккал/моль.

Это обеспечивает с избытком синтез 3 молей АТФ из АДФ

. Эффективность процесса выражается величиной

21,9/52,7,

т. е. примерно равна 40%.

Энергетический смысл дыхания состоит в синтезе АТФ. Энер-

гия,

аккумулированная в АТФ, используется клеткой для выпол-

нения

всех

видов ее работы.

Раскрытие химизма биологического окисления — крупнейшее

достижение биохимии. Здесь изложены лишь некоторые важней-

шие сведения, подробное рассмотрение сложной биохимической

системы окисления содержится в специальной

литературе

(см.

[1-3,

11-13]).

Особенность системы окислительного фосфорилирования, от-

личающая ее от ряда ферментативных реакций, протекающих в

растворе, состоит в строгой пространственной локализации зве-

ньев многоступенчатого процесса. Окислительное фосфорилиро-

вание локализовано в митохондриях и непосредственно связано

с транспортной и механохимической функциональностью их

мембран. По-видимому, столь сложная система биохимических

реакций

принципиально

требует

пространственной неоднородно-

сти и не могла бы реализоваться в гомогенной среде.

Расшифровка

кратко описанных здесь окислительно-восста-

новительных реакций была получена в

результате

применения

тонких химических и физических методов. Здесь, в частности,

в.1.

БИОЛОГИЧЕСКОЕ

ОКИСЛЕНИЕ

287

сыграли

большую

роль работы Чанса, посвященные спектроско-

пии

переносчиков электронов

(НАД, ФП,

цитохромов)

интакт-

ных митохондриях.

Эти

переносчики

обладают

характерными

полосами поглощения

видимой

близкой ультрафиолетовой

областях спектра,

разностные спектры позволяют изучать

ки-

нетику

их

окисления

восстановления

[14].

Были применены

различные способы удаления

из

митохондрий специфических

ферментов

и. тем

самым, сохранения лишь определенных звеньев

НАД-Н

(Fe-Fe)

•

KoQ

•

j-(Fe-F.)~,,

KoQ

(Fe-Fe)

Су/гцинт

Рис.

6.6.

Распределение белков

по

комплексам

ЦПЭ /, //, ///, IV.

о,

6, с,

Ci,

as—цитохромы,

Си

— медьсодержащие белки, (Fe — Fe) — негеминовое железо,

— сукцинатдегидрогеназа,

/д

—НАД Н-дегидрогеназа.

процесса. Митохондрии подвергались расчленению,

из

субмито-

хондриальных частиц выделялись комплексы

дыхательных

фер-

ментов, свободные

от

структурных

белков. Такие комплексы

оказалось возможным очищать

детально исследовать. Были

проведены успешные опыты

по

восстановлению

ЦПЭ

из

выде-

ленных препаратов

растворимых ферментов. Наконец, очень

ценная

информация была получена

опытах

по

ингибированию

отдельных стадий процесса

и по

разобщению окислительного

фосфорилирования

переноса электронов

(см.

§ 6.5).

Можно считать установленным,

что

переносчики

ЦПЭ

сгруп-

пированы

четыре комплекса, именуемые

комплексами Грина

(см.

[15]). Соответствующая

схема

приведена

на рис. 6.6.

Моле-

кулярный

вес

каждого комплекса равен примерно

3-Ю

Он со-

держит

около

64%

белка

и 36%

липидов. Электрон-переносящий

288 ГЛ. 6. СОПРЯЖЕННЫЕ ПРОЦЕССЫ В МИТОХОНДРИЯХ

комплекс

определяется как минимальная единица ЦПЭ,

сохра-

няющая

способность переносить электрон со скоростью, сравни-

мой

с этой скоростью в интактных митохондриях.

Изучение биологического окисления встречается с необходи-

мостью решения ряда физических проблем, относящихся к раз-

личным

уровням организации и функционирования системы.

Структура

и функции молекулярных переносчиков электро-

нов

изучены еще недостаточно. В § 6.7 рассмотрены современ-

ные

данные, относящиеся к строению и свойствам цитохрома с.

Цитохром с исследовался очень детально, но его динамические

свойства нельзя считать полностью установленными и объяснен-

ными.

Строение и функциональная организация митохондрий яви-

лись предметом интенсивного изучения. Тем не менее, многие

важнейшие вопросы,

сюда

относящиеся, пока не имеют

ответа.

Специфическая

мембранная

структура

митохондрий, присутствие

них автономной программы синтеза белков

(ДНК),

механохи-

мическая

активность митохондрий непосредственно связаны с их

ролью

«силовых

станций» клетки. Дальнейшее развитие физики

митохондрий

требует

целостного

подхода.

Общая теория электронного транспорта в локализованной

системе биологического окисления интенсивно развивается.

Предложены содержательные кинетические модели, начаты тео-

ретические исследования, основанные на рассмотрении элект-

ронно-конформационных

взаимодействий. Эти проблемы пред-

ставляют первостепенный интерес для биофизики.

Необходимо установить молекулярную природу биологиче-

ского окисления, осуществляемого в

результате

сопряжения фер-

ментативных, транспортных и механохимических процессов. Ми-

тохондрия есть место интегрирования широкой совокупности мо-

лекулярно-биологических явлений, целостная система,

требую-

щая

всестороннего изучения — теоретической и эксперименталь-

ной

разборки и сборки

«черного

ящика».

§ 6.2. СТРОЕНИЕ

СВОЙСТВА МИТОХОНДРИЙ

Митохондрии

фигурируют

во

всех

аэробных клетках живот-

ных и растений, за исключением некоторых примитивных бакте-

рий,

где функции митохондрий выполняет плазматическая мем-

брана.

Число

этих органоидов в клетке различно — от

20—24

в спер-

матозоидах до 500 000 в клетке гигантской амебы

Chaos

chaos.

В клетке

Escherichia

coli

имеется лишь одна митохондрия. Число

митохондрий характерно для клеток данного типа данного вида:

по-видимому, при митозе происходит деление митохондрий и их

правильное расхождение в дочерние клетки. Форма,

структура

6.2.

СТРОЕНИЕ

СВОЙСТВА

МИТОХОНДРИЙ

289

размеры митохондрий также варьируют, но митохондрии

всегда обладают развитой системой внутренних мембран, име-

нуемых кристами. На рис. 6.7 [16] схематически изображена

структура

митохондрии из печени крысы. Длина такой митохонд-

рии

примерно 3 мкм, ширина 0,5—1 мкм, и поэтому она хорошо

видна в оптическом микроскопе. Средний

сухой

вес митохондрии

10~

г. Общая площадь поверхности

всех

крист составляет

16 мкм

, внешней мембраны — 13 мкм

. В клетке печени содер-

жится примерно 1000 митохондрий и, значит, полная поверх-

ность митохондриальных мембран составляет около 29 000 мкм,

Рис.

6.7. Схематическое изображение митохондрии.

что в десятки раз превышает площадь мембраны самой хлетки

[16]. Внутренность митохондрии, не занятая кристами, заполнена

матриксом.

Митохондрии содержат так называемые

плотные

гранулы,

по-видимому, возникшие в

результате

аккумуляции

различных ионов, в частности Са

В митохондриях обнаружено наличие ДНК и в них происхо-

дит ДНК-зависимый синтез РНК. Более того, в митохондриях

представлена вся система биосинтеза белка — в них содержатся

тРНК,

аминоацил — РНК-синтетазы и рибосомы (см. [17—19]).

Мембраны митохондрий тоньше большинства клеточных мем-

бран—

их толщина порядка 50 А. Методом электронной микро-

скопии

было установлено, что внутренние мембраны и кристы

покрыты

сферическими или полиэдрическими частицами диамет-

ром

80—100

А, прикрепленными к мембранам ножками, имею-

щими

размеры

20—40X40—50

А. Эти структурные элементы

весьма многочисленны: их число в одной митохондрии достигает

290

ГЛ.

СОПРЯЖЕННЫЕ ПРОЦЕССЫ

МИТОХОНДРИЯХ

—10

и они

занимают

10—15%

ее

объема.

некоторых

слу-

чаях удалось наблюдать

еще

один элемент

—

подставку,

к ко

торой прикреплена ножка размером

40—50 X 115 X 115 А

. Го-

ловка, ножка

подставка образуют

так

называемую элементар-

ную частицу митохондрии [20—22].

На рис. 6.8

показано элект-

ронно-микроскопическое

изображение крист

митохондрии

из

сердца быка,

на

котором видны

эти

элементарные частицы

[21J.

Не

исключено, однако,

что

элементарные частицы являются

артефактом, возникающим

при

негативном контрастировании.

Возможно,

что их нет в

необра-

ботанных митохондриях.

Все же

трудно считать случайностью,

что

они

появляются

при

подго

товке препарата именно лишь

на

внутренних мембранах

и кри-

стах.

Митохондрия содержит

50—

60 ферментов, катализирующих

реакции

электронного транспор-

та, окислительного фосфорили-

рования,

окисления жирных

кис-

лот, цикла Кребса

другие.

Кроме

того, примерно

40%

всего

митохондриального белка

— это

структурный белок, предположи-

тельно индивидуальный, сходный

с белком миелина

бактериаль-

ных мембран

[23].

Липиды составляют

от 15 до 50%

сухого

веса митохондрий.

90% липидов

—

фосфолипиды.

О локализации окислительных ферментов

митохондриях

можно

до

некоторой степени судить

по

результатам обработки

митохондрий детергентами

или

ультразвуком. Цитохромы

и фла-

вопротеиды дыхательной цепи обнаруживаются

нерастворимых

частицах, по-видимому, принадлежавших мембранам. Напротив,

ферменты цикла Кребса (дегидрогеназы

и др.)

содержатся

растворимой части. Отсюда можно заключить,

что они

локали-

зованы

вблизи крист

или на них, но

легко отделяются.

Эти

факты

свидетельствуют

об

определенной пространственной

ор-

ганизации

окислительно-восстановительной системы.

работе

Чанса

Уильямса

[14]

установлено наличие простых стехиомет-

рических соотношений

содержании флавопротеидов

цитохро-

мов

митохондриях. Также постоянны молярные соотношения

различных цитохромов

[24], НАД и

цитохромов

[25] и т. д.

Кристы

образованы впячиванием внутренних мембран. Число

поверхность крист непосредственно связаны

интенсивностью

Рис.

6.8. Контрастированное изо-

бражение

крист.

Верхняя стрелка указывает головку,

нижняя

—подставку элементарной

ча-

стицы.