Волькенштейн М.В. Общая биофизика

Подождите немного. Документ загружается.

6.4.

ХЕМИОСМОТИЧЕСКОЕ

СОПРЯЖЕНИЕ

301

т.

е.

уже известная формула для равновесия Доннана — Нернста

(см.

стр. 123).

перемещением протонов через мембрану связано опреде-

ленное

значение

ее

энергетической емкости,

т. е.

буферного дей-

ствия.

Емкости фаз

ей/

равны

d (pH

)

i =

где dH

означает число протонов, добавляющихся

соответ-

ствующую

фазу. Буферная емкость мембраны

определяется

числом протонов ДН

, переходящих

из

фазы

е в

фазу

i на

еди-

ницу

понижения рН

по отношению

рН,-, или

д-

(

AH+

)

29)

"~ rf(ApH)

' ^-

причем

l/B=l/B

+l/B

Если

const,

то

ДН

-ВАрН.

(6.30)

Аналогичным образом, электрическая емкость сопрягающей

мембраны равна

г -

(Ae+)

3П

где Де

есть число положительных зарядов, переносимых из фазы

фазу

При

С =

const

Ле+

СД^.

(6.32)

Работа, совершаемая при генерировании разности

рН

обрати-

мым переносом протонов, равна

-ЛрН

ZApHd(AH),

(6.33)

-ЛрН»

где А рН° — равновесное значение Д рН

Д рН'

Д рН — Д рН°.

При

постоянной буферной емкости

Wд

н-

'/2 ZB {(ДрН)

(ДрН

)

(6.34)

Аналогичным образом получаем выражение для работы, совер-

шаемой при генерировании

Д^

обратимым переносом протонов

{(Дг|>)

(Дф°)

(6.35)

Если

установлено равновесие

для

протонов,

то

протонодвижу-

щая

сила Д/=

0 (ср.

(6.26)), Д^°

—

ZApH

полная энергия

302 ГЛ. 6. СОПРЯЖЕННЫЕ ПРОЦЕССЫ В МИТОХОНДРИЯХ

хемиосмотической системы, связанная с электрическим и

химическим компонентами этой силы, равна

W*f = Глрн' + WV = '/

С (Дг|))

+ '/

ZB (ДрН)

-7

2(ZC + iS)(ApH

)

(6.36)

Интегрируя от 0 до

—•

АрН', находим выражение WAJ через

ЛрН'

и Дф'= Дф — Дф°:

= '/

С (Дг|/)

+ 7г 2S (АрН')

(6.37)

Соответственно, уравнение

(6.26)

можно переписать в виде

(6.38)

В митохондриях (из печени крысы) площадь сопрягающей мемб-

раны оценивается в 40 м

на 1 г белка [47]. Электрическая ем-

кость при частотах порядка мегациклов составляет около

мкФ/см

[48]. Отсюда находим С « 0,4 Ф на 1 г белка или

4 мкэкв-В/г белка. Значение В та 12 мкэкв-В/единица рН на

г белка. Принимая величину А/ = 270 мВ, получаем W

j =

0,15 мкэкв -В на 1 г белка при ДрН' = 0 и W

i = 7,2 мкэкв- В

на

1 г белка при Дг|/ = 0. Свободная энергия гидролиза

АТФ составляет около 10 ккал/моль или около 0,44 экв-В. Сле-

довательно, W&f соответствует 0,35 мкмоля АТФ на 1 г белка

при

АрН' = 0 и 17 мкмоль АТФ на 1 г белка при Дч|/ = 0. Бо-

лее точные оценки

дают

соответственно 0,24 и 12 мкмоль АТФ

на

1 г белка. Если синтез АТФ сопряжен с переносом

двух

за-

рядов электрона, что

следует

из экспериментально найденного

отношения Ф„/2е^ = 1 для каждого места фосфорилирования, то

необходимое значение А\|/ действительно оказывается не менее

200 мВ, т. е. при толщине мембраны порядка 100 А напряжен-

ность электрического поля в ней не менее 2-Ю

В/см. Значение

Дг)/ = 200 мВ эквивалентно вкладу АрН' = 3,5 в общую прото-

нодвижущую силу А/.

Разность потенциалов Дх|) в митохондриальной мембране мо-

жет возникать не только за счет транспорта протонов, но и за

счет транспорта

других

ионов, происходящего одновременно.

Так,

для ионов К

в равновесии справедливо соотношение

Нернста

Ai!- = ZApK,

(6.39)

или

(

)

(

6Ж)

)

где D — эффективный буферный дифференциал для К

, опреде-

ляемый как

6.4. ХЕМИОСМОТИЧЕСКОЕ СОПРЯЖЕНИЕ 303

Соотношение между Дг|) и полным смещением зарядов, вызван-

ным перемещением всех ионов через мембрану, есть

£d(Ae

)

Cd(Ai|>),

(6.41)

связь между Аг|з и полным перемещением зарядов (за исклю-

чением перемещения, вызванного ионами К

) дается выраже-

нием

d(Ae

) = Cd(Aifl-d(AK

) = Cd(Ai|>) + |-d(A\|,). (6.42)

кроме

Ионы

считаются здесь находящимися в равновесии. Величина

-\-

DZ~

есть полная эффективная емкость. Ее значение может

сильно возрастать, если мембрана проницаема для данного иона.

Если мембрана непроницаема для ионов Н

и i порознь, но

возможен их совместный транспорт в одном направлении, т. е.

симпорт

(symport) по Митчеллу, то условие равновесия запи-

шется в виде (v — стехиометрические коэффициенты)

v,Api+v

+ApH = 0. (6.43)

Если реализуется антипорт (antiport), т. е. движение ионов i

в направлении, противоположном транспорту Н

, то

v.Api

— v

+ApH = 0. (6.44)

Симпорт с Н

установлен, в частности, для некоторых анионов:

Др (дикарбоксилат

") + 2 ДрН = 0,

Др (трикарбоксилат

~) + 3 ДрН = 0.

Возможны и более сложные ситуации, например,

Др (фосфат*-) + 2 ДрН + АрК = 0.

Антипорт должен осуществляться для Н

и катионов.

Соотношения между ДрН и Лгр можно представить в виде

(см.

стр. 301)

dt " dt '

(6.46)

Суммирование проводится по различным типам реакций, в

ходе

которых происходит транслокация протонов и

других

заряжен-

ных частиц. При постоянных В и С получаем выражения, ана-

логичные (6.30) и (6.32):

" ' ~

= CAi|-. (6.47)

304 ГЛ. 6.

СОПРЯЖЕННЫЕ

ПРОЦЕССЫ

В МИТОХОНДРИЯХ

Второе уравнение можно переписать в виде

(6.48)

где Д1

— члены суммы Де

, отличные от ДН

. Из выражений

(6.26),

(6.47)

(6.48)

следует

...

-L-

(649)

ц ~ с + в/z •

уолу)

При

равновесном распределении протонов Д/= 0 и

(д/

)°

ZApH°

= c + B/Z •

50)

Выражение, содержащее лишь отклонения от равновесия, имеет

вид

ZApH'

С— У(Д/

)'/Д/

дГ = CTBJZ •

)

Таким образом, относительные вклады —ZApH и Лг|) в Д/ зави-

сят лишь от С, В и от числа смещаемых непротонных зарядов.

Вообще говоря, сумма £ (А/

)' отрицательна вследствие движе-

ния

ионов через мембрану по электрическому градиенту, т. е.

в направлении, противоположном движению протонов. Эта сум-

ма минимизируется при симпорте протонов и анионов или при

антипорте протонов и катионов. Напротив, увеличение переноса

ионов

в присутствии, скажем, валиномицина (см. стр. 151)

должно увеличивать отрицательное значение 2 Д/

и, таким об-

разом, увеличить вклад —ZApH' по сравнению с Д\|/.

Не

ограничиваясь приведенными соотношениями, Митчелл

рассматривает кинетику генерации и затухания ДрН' и A\J/ в не-

которых простейших

случаях.

Цель этого исследования состоит,

в частности, в интерпретации изменений рН, возникающих после

достижения равновесия под влиянием импульса окисления —

восстановления или гидролиза АТФ. Такой импульс может быть

создан добавлением соответствующих веществ.

Полная

протонодвижущая сила Д/ состоит из специфического

потенциала Д\|/, определяемого электрическими свойствами про-

тонов, и разности —ZApH', определяемой их кислотными свой-

ствами. Сила А/ стремится восстановить электрическое и кис-

лотно-основное равновесие. Митчелл предполагает существова-

ние

линейной связи

между

силой и потоком, т. е. рассматривает

близкую к равновесию ситуацию. Полную ионную проводимость,

включающую протонную, можно описать уравнением

^е

)

- Z ДрН'),

(6.52)

6.4. ХЕМИОСМОТИЧЕСКОЕ СОПРЯЖЕНИЕ 305

где п — число зарядов иона, эффективная протонная проводи-

мость представлена как доля \/п от полной проводимости, г. е.

g =

(l/n)g,

и члены, отвечающие ZgApH для

других

ионов, счи-

таются пренебрежимо малыми. Опыт дает на 1 г митохондри-

ального белка g = 1,7 мкэкв/(В-с). Для протонной проводимо-

сти имеем

d (АН

) .

1а

„,

—j

—

= — ё*1- (6.53)

Из

уравнений (6.26), (6.29) и (6.53)

следует,

что

^Р = g (Д*' - Z АрН'), (6.54)

из уравнений (6.31) и (6.52) находим

d (

У'

]

=g(Z АрН' - п Аг|/). (6.55)

Допустим, что ДрН' и Дгр' генерируются импульсом окисления —

восстановления, причем скорость переноса Н

постоянна и равна

Полные

скорости генерации ДрН' и Ai|/ даются выражениями

}

= g(A^-Z АрН') -к, (6.56)

(

=g(Z

АрН'

- п

Аг|)')

+ к.

(6.57)

Решения

этих уравнений при начальных условиях АрН' = Д\|/ =

0 при / = 0 имеют вид

(6.58)

где q = Z/B + n/C,

w=^s

+ r, s = Z/B — n/C, r =

4Z/CB.

При

стремлении —ZApH' к стационарному значению Ai|/ возра-

стает до максимума, а затем падает до нуля. Если мембрана про-

ницаема

практически лишь для ионов Н+ или ОН"" и g = g или

306

ГЛ.

СОПРЯЖЕННЫЕ ПРОЦЕССЫ

МИТОХОНДРИЯХ

п = 1, то решения (6.56) и (6.57) не

могут

быть получены в виде

(6.58) и (6.59). В этом специальном случае уравнения (6.56) и

(6.57) не независимы и их можно переписать в виде

-4-

(

-60)

rf(ApH')

С d

(Аг|/)

В dt

Интегрирование (6.60) и

(6.61)

дает

Дф'=-у

С (-Z ДрН').

(6.61)

(6.62)

(6.63)

В этом случае генерация Д\|/ и —ZApH' происходит синхронно.

Время затухания обеих величин до половины исходного значе-

ния

определяется в основном величиной С. Для митохондрий

оно

составляет около 1,5 с. Вообще говоря, временной ход

—Z

АрИ' зависит от значения п, при больших п это время со-

ставляет около 80 с.

Дальнейшие подробности, относящиеся к теории Митчелла,

изложены в работах [42, 44]. На языке линейной неравновесной

термодинамики (см. § 6.3) соответствую-

щие соотношения можно записать на ос-

нове упрощенной схемы, приведенной на

рис.

6.14 [34]. В области / имеем (ср.

стр. 294)

ЛТф

АДФ

у"

—z/

°'

в области //

Рис.

6.14. Схема потоков

химиосмотической мо-

дели.

(6.64)

(6.65)

В области / окисление вызывает транс-

порт протонов в направлении, противо-

положном АДн, в области // спонтанный поток создает фосфо-

рилирование. Общий поток протонов

1 l' J- I

•'

н = J н

-+-

J и.

или

'н

(6.66)

6.5.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ

ИССЛЕДОВАНИЯ 307

Основное предположение теории Митчелла состоит в том, что

коэффициент

прямого сопряжения окисления и фосфорилирова-

ния

равен

нулю

(/.ф

= 0). Иными словами, если Дрн поддер-

живается постоянным, то фосфорилирование должно быть неза-

висимым от окисления, и наоборот. В частности, при АДн = 0

разобщение полное и /ф = 0, если зФ%— 0 при любом значении

Jo, а также J

= 0, если s4-l = 0 при любом значении /

Теория

Митчелла — феноменологическая теория, не рассмат-

ривающая механизм процесса и не учитывающая электронно-

конформационные

свойства митохондриальной системы. Тем не

менее,

эта теория позволяет прийти к

ряду

конкретных выводов,

подлежащих прямой экспериментальной проверке.

Вместе

с тем

подлежит проверке и предполагаемая в теории Митчелла бли-

зость процесса к равновесию.

§ 6.5. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ХЕМИОСМОТИЧЕСКОГО

СОПРЯЖЕНИЯ

Подробное описание экспериментальных исследований хе-

миосмотического сопряжения дано в монографии Скулачева [46].

Здесь мы приводим лишь краткое изложение основных резуль-

татов.

Прежде всего необходимо было проверить основное положе-

ние

теории Митчелла, согласно которому дыхательная цепь ге-

нерирует трансмембранный потенциал ионов Н

. Прямые микро-

электродные измерения не подтвердили предполагаемое в теории

Митчелла высокое сопротивление мембраны

(10

—10

Ом-см

)

дали значение мембранного потенциала 10—15 мВ со знаком,

противоположным предполагавшемуся [49]. Однако эти резуль-

таты нельзя считать вполне достоверными (см. [46]). Более на-

дежную

информацию

дает

исследование транспорта специфиче-

ских ионов через мембрану, вызываемого трансмембранным по-

тенциалом.

Валиномицин

вызывает поглощение ионов К

энергизован-

ными

митохондриями, т. е. митохондриями, способными к реа-

лизации

сопряжения окисления и фосфорилирования [50]. При

нарушении сопряжения митохондрии теряют накопленные ионы

Эти

результаты

согласуются

с представлениями Митчелла,

но

не доказывают их однозначно [46]. Для обнаружения элек-

трического поля, направленного поперек мембраны энергизован-

ных митохондрий, было необходимо найти ионы, способные про-

никать

через эти мембраны, перенос которых мог бы осуществ-

ляться ферментами — транслоказами без участия электрического

поля.

Либерман и его сотрудники изучили транспорт ряда спе-

циально

синтезированных ионов (синтетические ионы) через ис-

кусственные фосфолипидные мембраны (см. стр. 140) [51, 52].

308

ГЛ. 6.

СОПРЯЖЕННЫЕ ПРОЦЕССЫ

МИТОХОНДРИЯХ

Наиболее подходящими оказались ионы

зарядом, экраниро-

ванным

гидрофобными заместителями

(рис.

6.15).

присутствии

этих ионов существенно повышается электропроводность

си-

стемы,

так как они

быстро диффундируют сквозь мембраны.

Да-

лее исследовался транспорт этих ионов через митохондриальные

мембраны

субмитохондриальные частицы

(СМЧ),

полученные

0,N

ТНФ

СН

—СН

C-(CH

)

-N-(CH

)J-CHJ

(СН

)

сн

ТФМФ

TEA

Рис.

6.15. Синтетические анионы и катионы.

ТБ—тетрафеннлборат,

ФКБ —

феннлдикарбоундекаборан,

ТНФ—тринитрофенол (пикрат),

ДДА—дибензилдиметил

аммоний, ТФМФ —трифенилметилфосфоний,

ТБА—тетрабутил-

аммоний.

путем обработки митохондрий ультразвуком. Мембраны мито-

хондрий

и СМЧ

оказываются ориентированными противополож-

ным

образом. Наружная поверхность мембраны

СМЧ

покрыта

структурными элементами, состоящими

из

шляпки, ножки

и под-

ставки

(см. стр. 290),

наружная поверхность мембраны мито-

хондрии этих элементов

не

содержит. Цитохром

локализован

на

внешней стороне мембраны митохондрий

и на

внутренней

стороне мембраны СМЧ.

СМЧ

«вывернуты»

по

сравнению

с ми-

тохондриями. Можно

думать,

что

внутримитохондриальное

про-

странство заряжено отрицательно,

внутреннее пространство

СМЧ

имеет положительный заряд. Оказалось,

что

энергизация

СМЧ

добавкой

АТФ

вызывает поглощение анионов

ФКБ (см.

6.5. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 309

рис.

6.15),

а деанергизация ингибитором дыхания (антимици-

ном) или разобщителем окислительного фосфорилирования ОКФ

(rz-трифторметоксикарбонилцианидфенилгидразон) вызывает вы-

ход анионов. В опытах с митохондриями наблюдается иная кар-

тина [46, 53—56].

Удалось

показать, что транспорт электронов

в мембранах СМЧ сопровождается поглощением анионов ФКБ

[55, 57]. Транспорт ФКБ нарушается ингибиторами электронного

транспорта, а также разобщителями окислительного фосфори-

лирования.

Аналогичные

результаты

получены и с другими синтетиче-

скими

анионами [55, 58, 59].

В целом указанные опыты с синтетическими ионами, а так-

же ряд

других,

доказывают, что в сопрягающих мембранах реа-

лизуется энергозависимый транспорт ионов, причем анионы и

катионы

движутся

в противоположных направлениях. Механизм

транспорта не зависит от

структуры

ионов, существенна лишь

их способность проникать через фосфолипидные мембраны. Из-

менение ориентации мембраны относительно окружающей среды

приводит к переориентации ионных потоков, направленных про-

тив градиентов концентрации ионов [46].

Эти электрофоретические свойства мембран нельзя объяс-

нить высказанными ранее представлениями об ответственности

специфического фермента — энергозависимой транслоказы — за

транспорт ионов (см., например, [60]). Напротив, эти свойства

согласуются

с теорией Митчелла, исходящей из того, что хими-

ческая энергия реакции окисления и фосфорилирования может

превращаться в электрическую энергию мембранного потен-

циала.

Согласно теории Митчелла (см. § 6.4), перенос протонов и

электронов сквозь мембрану не приводит к большим изменениям

рН.

Транспорт электронов, т. е. окислительный процесс, прекра-

щается под действием электрического поля, создаваемого избыт-

ком

отрицательных зарядов на

другой

стороне мембраны. Пере-

нос

электронов активируется вновь при уменьшении поля, т. е.

при

уменьшении мембранного потенциала. Этого можно достичь

перемещением катионов через мембрану. В

результате

должен

возникнуть градиент рН, так как перенос каждого одновалент-

ного катиона должен сопровождаться освобождением одного

протона во внешней среде. В

работах

[3,

53—55]

действительно

показано,

что добавление проникающих синтетических катионов

ДДА,

ТФМФ,

ТБА (см. рис. 6.15) к митохондриям вызывает уве-

личение концентрации Н

в среде. Изменения рН исчезают при

добавке разобщителей. Сам Митчелл показал, что при работе

дыхательной цепи среда подкисляется [42, 43].

Таким образом, установлено, что энергизация сопрягающей

мембраны создает трансмембранный потенциал Д\|з и ДрН.

310 ГЛ. 6.

СОПРЯЖЕННЫЕ

ПРОЦЕССЫ

МИТОХОНДРИЯХ

Из

теории Митчелла

следует,

что энергия дыхания, транс-

формированная

из химической формы в электрическую и осмо-

тическую, может вновь перейти в химическую форму при син-

тезе

АТФ или обратном переносе электронов. Митчелл посту-

лирует,

тем самым, обратимость биоэнергетического процесса.

Это положение также подтверждено (см. [44]). Реализуется так

называемое ионное фосфорилирование — синтез АТФ из АДФ

Ф„ за

счет

электрической или осмотической энергии, выде-

ляемой при движении ионов через мембрану по концентрацион-

ному

градиенту.

Хорошими тестами на трансмембранный потенциал являют-

ся

изменения спектров поглощения цитохромов, вызываемые их

окислением

и восстановлением [61, 62]. При исследованиях по-

ведения цитохромов в СМЧ может оказаться весьма полезным

магнитооптическое вращение, аномальная дисперсия которого

очень чувствительна к изменению состояния группы гема, со-

держащейся в цитохромах (см. [2], гл. 7).

Удается

наблюдать

такую

аномальную дисперсию для цитохрома с во взвеси СМЧ.

Снижение

А*ф должно приводить к нарушению сопряжения

окисления

и фосфорилирования. К этому сводится действие раз-

общителей сопряжения. Таковыми являются динитрофенол

ДНФ,

ФКФ и ряд дру-

/ Мембрана

он" гих

веществ.

ДНФ, по-

видимому,

действует

как

переносчик протонов,

со-

•

гласно

схеме

Митчелла,

показанной

на рис. 6.16.

Очевидно,

что

если

эта

схема верна,

то

любые

Рис.

6.16.

Транспорт протонов разобщите-

СЛабые

КИ

СЛОТЫ

осно-

лем

ДНФ.

вания должны оказывать

разобщающее действие.

Установлено,

что

разобщители действительно повышают

протонную проводимость мембран митохондрий

[63].

Сход-

ные результаты были получены

и на

искусственных фосфо-

липидных мембранах

[53,

64—66]. Выявлено далеко идущее

сходство этих мембран

внутренними мембранами мито-

хондрий. Найден новый класс сильных разобщителей

—

произ-

водных барена

[52]

(дальнейшие подробности

см. в

[46]).

По

схеме

Митчелла

[42, 43]

протоны

электроны шесть

раз

пересекают мембрану

на

пути

от

НАД-Н

к О

Стадии переноса

и е~

чередуются.

Для

детального рассмотрения

аргумен-

тации этой схемы нужно иметь представление

локализации

компонентов реакции. Установлено,

что

цитохром

локализо-

ван

внешней стороны мембраны митохондрий,

ферменты

трансгидрогеназа, НАД-Н-дегидрогеназа

сукцинатдегидроге-