Волькенштейн М.В. Общая биофизика

Подождите немного. Документ загружается.

6.2. СТРОЕНИЕ И СВОЙСТВА МИТОХОНДРИЙ 291

клеточного дыхания. Их формы широко

варьируют

для разных

клеток. Митохондрии летательных мышц насекомых

содержат

развитую

поверхность плотно упакованных крист; интенсивность

дыхания этих клеток раз в 20 выше, чем клеток печени, мито-

хондрии которых

содержат

относительно мало крист. У мито-

хондрии клетки печени площадь поверхности внешней мембраны

составляет около 13 мкм

, площадь внутренней — в три раза

больше. В такой митохондрии имеется примерно 17 000

дыха-

тельных ансамблей, как это

следует

из содержания цитохромов.

На

каждый квадратный микрон поверхности внутренней мем-

браны приходится 650 ансамблей, каждый ансамбль занимает

площадь

400X400

[16].

работах

Грина (см. [15, 26]) элементарные митохондриаль-

ные

частицы рассматриваются как реальные

структуры,

в кото-

рых локализованы основные процессы электронного транспорта

окислительного фосфорилирования. Предполагается раздель-

ная

пространственная локализация этих процессов — электроны

протоны разделены в комплексах переноса электронов и раз-

делены белки,

участвующие

в переносе электронов и протонов.

Представление о разделении электронов и протонов является

одним из основных в электромеханохимической модели мито-

хондриальной

структуры

и функции, развиваемой Грином и Джи

[26, 27] (см. стр. 315).

Фазово-контрастная

микроскопия показывает, что митохонд-

рии

живых клеток испытывают изменения размеров и формы,

связанные

с дыханием [4, 16, 28]. Осуществляются циклы набу-

хания и сокращения

двух

типов. Обратимый цикл малой ампли-

туды,

в котором объем меняется не более чем на 1—2%, наблю-

дается у

всех

типов митохондрий in

vitro.

Набухание, сопровож-

даемое понижением оптической плотности, наступает в

отсут-

ствие АДФ в состоянии покоя митохондрий. При добавлении

АДФ происходит сокращение и окислительное фосфорилирова-

ние

АДФ. Цикл блокируется разобщителями окислительного

фосфорилирования

[29].

В цикле большой амплитуды объем митохондрии может ме-

няться

в несколько раз. Это наблюдается как in

vitro,

так и

vivo.

Такие циклы различаются у митохондрий из разных кле-

ток.

Сокращение митохондрий вызывается добавлением АТФ.

Процесс

непосредственно связан с дыханием — с окислительным

фосфорилированием.

Имеется прямой параллелизм в ингибиро-

вании

сокращения и окислительного фосфорилирования олиго-

мицином.

Изменения оптической плотности в циклах

набуха-

ние—

сокращение митохондрий показаны на рис. 6.9 [16].

Высокоамплитудные механохимические процессы в митохонд-

риях определяются свойствами мембран. Мембраны, освобож-

292

ГЛ. 6. СОПРЯЖЕННЫЕ ПРОЦЕССЫ В МИТОХОНДРИЯХ

денные от белка матрикса, «митохондриальные

духи»,

способны

сокращаться в присутствии АТФ.

Эти механохимические процессы сводятся к превращению

химической энергии в механическую работу. Ленинджер подчер-

кивает далеко идущее

сходство

АТФ-азной активности митохонд-

риальных мембран и актомиозиновой сократительной системы

скелетных мышц [16]. Сходны их механохимические свойства,

прежде всего сокращение под действием АТФ. В обоих случаях

для сокращения необходимы двухвалентные катионы, обе си-

стемы являются мультикомпонентными. Можно указать еще ряд

черт

сходства.

Исходя из

этого,

Ленинджер посту-

лировал присутствие со-

кратительных белков, по-

добных актомиозину, в

мембранах митохондрий

[30].

Гипотеза Лениндже-

ра была подтверждена

Онищи,

действительно

выделившим из митохон-

дрий белок такого типа

[311.

Показано, что сокра-

тительный белок

участ-

вует

в митохондриальной

механохимии, но оказа-

лось, что здесь играет су-

щественную роль и липид

Сокращение

Набухание

ГО

30 мин

Рис.

6.9.

Изменения

оптической плотности

при

А.

5200

А в циклах набухание — сокра-

щение

митохондрий.

— цикл малой амплитуды, 2—цикл большой ам-

плитуды.

мембран — фосфатидил-

инозитол

[32]. Имеются и

другие

факторы, участвующие в со-

кращении,

в частности, ферментативные.

В работах школы Ленинджера было показано непосредствен-

ное

участие транспорта катионов в функционировании мембран

митохондрий [16]. Накопление больших количеств Са

, посту-

пающего из окружающей среды, происходит при дыхании и бло-

кируется его ингибиторами и разобщителями окислительного

фосфорилирования.

Количество поступающего Са

связано

с количеством поглощаемого кислорода, фосфат также аккуму-

лируется параллельно накоплению Са

в отношении Са : Ф„ =

5:3 (соответствующем оксиапатиту). Электронная микро-

скопия

показывает, что в митохондриях

могут

накапливаться

гранулы фосфата кальция.

Установлено, что имеется прямое и точное соотношение

между

аккумулированными количествами фосфата и кальция

числом электронов, проходящих по дыхательной цепи [33]. При

перемещении

каждой пары электронов через каждый из

трех

центров накопления энергии в цепи аккумулируется 1,67 моле-

6.3.

ТЕРМОДИНАМИКА ОКИСЛИТЕЛЬНОГО ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ

293

кулы Са

и 1,0 молекула фосфата. Этот процесс альтернативен

окислительному фосфорилированию, что показано схематически

на

рис. 6.10 [16]. Тем самым Са

препятствует окислительному

фосфорилированию,

действует

как его разобщитель.

О/шштельте

фасфсрияиррвание

АДФ (Ф

: 0 = J,

АДф:0=,7)

АТФ

АТФ АТФ

I 1 i

Субстрат'—*~

(НАД-HY

ФП Y Ь Y ^ Y а Y #j

)-*~0

АДФ+Ф

О/гшитемтя

аккумуляция

Са

(Ф

: 0 = J, Са : 0=i)

Фосрат

Са

Фосфат

Са

Фосфат

Са

ФП

Y Y Y Y

Рис.

6.10.

Схемы

альтернативных

окислительных процессов — фосфорилиро-

вания и аккумуляции

Са++.

Малые количества Са

, напротив, стимулируют дыхательный

процесс. Транспорт Са

связан с транспортом катионов Н

и Na

6.3.

ТЕРМОДИНАМИКА

ОКИСЛИТЕЛЬНОГО

ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ

Как

уже сказано, окислительное фосфорилирование сопря-

жено с ионным транспортом в митохондриальных мембранах.

субстраты, и продукты окисления и фосфорилирования яв-

ляются ионами, и, очевидно, их транспорт должен влиять на

скорость соответствующих процессов. Вместе с тем окислитель-

ное фосфорилирование, как таковое, есть система сопряженных

процессов, а не отдельная химическая реакция. Максимально

упрощенная схема сопряжения фосфорилирования с окислением

показана на рис. 6.11 [34].

Предложен ряд гипотез о механизме сопряжения в окисли-

тельном фосфорилировании. Согласно Слэйтеру в

результате

окисления

возникают обладающие избытком энергии промежу-

точные вещества, участвующие в фосфорилировании [35]. Это —

294 ГЛ. 6.

СОПРЯЖЕННЫЕ

ПРОЦЕССЫ

В МИТОХОНДРИЯХ

химическая гипотеза.

Она

включает сопряжение

ионным

транспортом, если принять,

что

промежуточное вещество опре-

деляет работу ионного насоса

[36, 37]. С

другой

стороны, выска-

зано предположение,

что

катионный насос неспецифичен

и спе-

цифичность возникает благодаря различным барьерам прони-

цаемости

[38].

Химической гипотезе противостоит

хемиосмотичс-

ская

теория

Митчелла, подробно рассматриваемая

следующем

параграфе. Согласно основной идее Митчелла, система окисли-

тельно-восстановительных фермеи-

Н*+АДФ

Ф„ АТФ+Н

тов

расположена

во

внутренней

мембране митохондрий таким обра-

^Фосфорилировшеу

зом, что перенос электронов от во-

дорода

к кислороду сопровождает-

ся

переносом заряда сквозь мем-

брану. В

результате

на мембране

возникает разность потенциалов и

В+Н

(или) градиент рН.

Разобщение окисления и фосфо-

Рис.

6.11. Общая

схема

сопря- рилирования катионами, вводимы-

жения окисления и фосфорили- объясняется в химической

рования.

ВН,-окисляемый

субстрат.

Те0

ИИ

КОНК

УР

еНЦИеИ

33 ВЫСОКО-

энергетические промежуточные со-

единения.

Исследования разобщения посредством различных

веществ

дают

некоторые возможности для выбора модели (см.

§6.5).

Общее термодинамическое описание процессов сопряжения

не зависит от конкретной модели. При сопряжении

двух

линей-

ных процессов (см. стр. 53)

L=LJXLJI\

степень сопряжения дается выражением

'•"=,

(6.4)

причем в линейной области справедливо условие Онзагера

L12 = L

i. В

отсутствие

сопряжения q = О, при полном сопря-

жении д= 1. При полном сопряжении окисления и фосфорили-

рования

между

изменениями свободной энергии должно реа-

лизоваться соотношение

где v — стехиометрическое соотношение. При неполном сопря-

жении вместо равенства имеет место неравенство и

6.3. ТЕРМОДИНАМИКА ОКИСЛИТЕЛЬНОГО ФОСФОРИЛИРОВАНПЯ 295

При

промежуточных значениях q отношение скоростей

двух

процессов является функцией отношения

действующих

сил. Для

окислительного фосфорилирования (st — сродство)

— t|i — г" Ь\2 j

^о ^ф \

•>ф—

^\2~ Г '-22 j > |

отношение /ф//

есть отношение Ф

/0. Имеем

Фн _ /ф _ q + lx

О ~ J

~~ Г

+ qx '

гдех=^ф/^

, q определяется соотношением (6.4),

При

q = 1 имеем Ф

/0 = / = 3, независимо от отношения

^ф/^о,

при q = 0 имеем Ф

1Г

/0 = Рх = 9^ф/^

, при 0 < q < 1,

т. е. при неполном сопряжении, отношение Ф„/0 нелинейно за-

висит от х.

Учитывая перенос протонов, напишем функцию диссипации

(умноженную на Т) в виде

где А,пн есть разность электрохимических потенциалов ионов во-

дорода

на

входе

выходе

из мембраны, т. е.

А-

-вход

~вых пт \

Ги+~1

ВЫХ

/Ги

ВЫХ

I лт- л I

- 2,3RT ЬрН + ЗГ At, (6.7)

где 3~ — число Фарадея, Дф — разность потенциалов (см.

стр. 107).

Рассмотрим стационарное состояние с нефиксированными

градиентами электрохимических потенциалов для ионов Са

и т. д. Соответственно потоки этих ионов равны нулю.

Функция

диссипации (см. (6.6)) не определена в том смыс-

ле, что не указано, о каких значениях сродства si-

идет

речь —

о внешних или внутримембранных. Согласно [34], можно про-

вести

соответствующее

уточнение. Рассмотрим митохондриаль-

ное окисление. Функцию диссипации для мембраны, находящей-

ся

в стационарном состоянии, можно написать в виде

°Г =

-Е(й}£}

+ й^). (6.8)

Здесь jij и и,- — электрохимические потенциалы и числа молей

для

субстрата,

продукта, О

, СО

, Н

О, АТФ, АДФ, Ф„, Н

, К

Са

, Mg

. Индексы i и е — внутри и вне мембраны. Для

296 ГЛ. 6. СОПРЯЖЕННЫЕ ПРОЦЕССЫ В МИТОХОНДРИЯХ

совокупности метаболических реакций имеем

Е v

/, = Е (А|

+ п'

) =

+ nj, (6.9)

где /

—поток для г-й реакции, v

— стехиометрические коэффи-

циенты. Подставляя (6.9) в (6.8) и исключая га«, получаем

(6.10)

во внешней, и во внутренней областях для сродства

S4-

имеем

&г = - Е

V/rJl,.

Следовательно,

Если внутри мембраны реализовано стационарное состояние для

J>t'o.

(6.12)

всех

компонентов, то п', = 0 и

Таким образом, в стационарном состоянии достаточны измере-

ния,

проводимые только во внешнем растворе. Величины s4-% и

s4-l фиксированы, соответственно Уф и /

отличны от нуля. На-

против, /ц = 0. Если в стационарном состоянии отличны от

нуля ДДн и Ун, то

«^V^ + 'H^H + VC

(6.13)

Соответствующие феноменологические уравнения имеют вид

(6-14)

Здесь предполагается сопряжение химических реакций окисле-

ния

и фосфорилирования с векторным потоком протонов — отли-

чие от нуля коэффициентов /,фн и

H-

Прямое сопряжение мо-

жет осуществляться лишь вследствие анизотропии мембраны.

Косвенное сопряжение реализуется в условиях стационарности

(см.

стр. 68 и 72). Расчет коэффициентов L

требует

конкрет-

ной

модели.

6.3. ТЕРМОДИНАМИКА ОКИСЛИТЕЛЬНОГО ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ 297

Обратные феноменологические уравнения имеют вид

(6.15)

Если

/н =0, то степень сопряжения равна

Если

ЛД

= 0, получаем

#Ф

<4н

?ф

где

Яи

= -

Степень сопряжения можно оценить экспериментально. При ог-

раниченном

поступлении АДФ происходит окисление без фосфо-

рилирования

[14], следовательно, Ф„/О = 0. При добавлении

АДФ возникает стационарное фосфорилирование. Количествен-

ное

исследование дыхания состоит в том, что в митохондриаль-

ную систему in

vitro

добавляют известное количество АДФ и

измеряют количество поглощаемого кислорода [34]. Определяет-

ся

отношение Ф

/О, а также потенциал фосфата и окислитель-

ный

потенциал субстрата. Соответствующие опыты были прове-

дены Истабруком [39] (см. также [34]). Из полученных значений

s4-%

и si%

следует

высокая степень сопряжения окисления и

фосфорилирования

(q =

0,96).

Максимальная эффективность по-

требления энергии, т. е. отношение выходной мощности к

вход-

ной

зависит только от значения q и выражается формулой [40]

При

q = 0,96 находим Ti

max

= 0,56.

ЭТИ

феноменологические оценки не

дают

информации о

меха-

низме

процесса, они

могут

иметь лишь ограниченную примени-

мость при рассмотрении событий, реализуемых in

vivo,

так как

вовсе не очевидно, что условие близости к равновесию здесь дей-

ствительно соблюдается. Вместе с тем, высокую степень сопря-

жения

окисления и фосфорилирования,

следующую

из термоди-

298

ГЛ. 6. СОПРЯЖЕННЫЕ ПРОЦЕССЫ В МИТОХОНДРИЯХ

намической трактовки экспериментальных данных, можно, по-

видимому, считать установленной. Точность определения q имеет

решающее значение для оценки эффективности ц — при q = 1,00

Птах = 1,00, при q = 0,96 Tlmax = 0,56.

§ 6.4. ХЕМИОСМОТИЧЕСКОЕ СОПРЯЖЕНИЕ

Механизм фосфорилирования в окислительно-восстановитель-

ной

цепи до сих пор нельзя считать точно установленным. Важ-

ное значение для его исследования имеет теория хемиосмотиче-

ского сопряжения, развитая Митчеллом. Эта теория была пред-

ложена впервые в 1961 г. [41]. Ее подробное изложение содер-

жится в обзорных

работах

Митчелла

[42—45]

и в монографии

Скулачева [46].

Не

пользуясь непосредственно представлениями неравновес-

ной

термодинамики, Митчелл оперирует понятием сопряжения,

необходимым при рассмотрении открытых систем. Очевидно, что

сопряженные процессы универсальны в живой природе. В любой

биохимической реакции, катализируемой ферментом, имеется

сопряжение

между

электрон-

ными

и конформационными пе-

рестройками. В системе, содер-

жащей жидкие фазы, разде-

ленные мембраной, возникает

сопряжение

между

химически-

ми

реакциями и мембранным

транспортом, именуемое Мит-

челлом

хемиосмотическим

со-

АН

АДФ+Ф

АТФ

Рис.

6.12.

Принцип

хемиосмотиче-

пряжением.

Мембрана играет

ского сопряжения окисления" и "фос- Р°

ЛЬ

«шрягающей системы,

формирования

по Митчеллу

В Столь

общей формулировке

идея

— внутренняя, г —внешняя стороны мем-

браны.

хемиосмотического со-

пряжения

не содержит чего-

либо нового по сравнению с

представлениями об активном мембранном транспорте, изло-

женными в гл. 2 и 3. Особенности

подхода

Митчелла состоят в

следующем.

1. Предлагается конкретная модель сопряжения дыхания с

фосфорилированием, исходящая из феноменологических сообра-

жений.

2. Рассматриваются главным образом равновесные соотно-

шения

между

факторами, определяющими сопряжение.

Конкретная

модель представляется схемой, показанной на

рис.

6.12 [46]. Донор водорода АН

(например, аскорбат) окис-

ляется переносчиком электронов (например, цитохромом с) у

внешней стороны мембраны. Два электрона переносятся через

5 6.1. ХЕМИОСМОТИЧЕСКОЕ СОПРЯЖЕНИЕ 299

мембрану по дыхательной цепи и посредством цитохромоксидазы

передаются акцептору водорода В, т. е. кислороду. Акцептор

присоединяет два протона из внутренней фазы митохондриаль-

ного матрикса. Создается градиент концентрации протонов — их

избыток во внешней и недостаток во внутренней жидкой фазе.

Вследствие этого происходит перенос протонов через мембрану

противоположном направлении, в результате чего и реализует-

ся

фосфорилирование — синтез одной молекулы АТФ приводит

поглощению

двух

протонов из внешней фазы и выделению

двух

протонов в матрикс. Митохондриальная мембрана работает

как

топливный элемент, в котором разность электрохимических

потенциалов создается за счет окислительно-восстановительного

процесса.

Равновесные термодинамические соотношения определяются

тем, что разность свободных энергий в системе слагается из хи-

мической и осмотической (транспортной) работы:

AG = AG

XHM

+ AG

0CH

(6.16)

где

0CM

= Е

(ji,

- И?) + Е v, (Д, - ц°).

(6.17)

Сумма по / есть сумма по всем продуктам, сумма по i—по всем

реагентам.

\i°

ц° — стандартные химические потенциалы, Vj,

v,- — соответствующие числа молей. Если переносится лишь один

компонент,

то обобщенная сила, действующая на него, есть

АД = -

0CM

/v.

(6.18)

Схему,

показанную на рис. 6.13, можно считать состоящей из

двух

«петель»

(рис. 6.13, а) — окислительно-восстановительной

(дыхание, о/в-петля) и гидрогенизационно-дегидрогенизацион-

ной

(дефосфорилирование, г/д-петля). Сопряжение обоих про-

цессов посредством протонного транспорта показано на

рис.

6.13,6.

Согласно

(6.17)

имеем в равновесии

ДД

н+

= -ЛО

осм

/2 = 0-ДЦ>,

(6.19)

где 9" — число Фарадея, Дг|) — разность потенциалов (в воль-

тах). В процессах о/в и г/д

)

о/в

= - (АС

осм

)

г/д

= 2 ДД

(6-20)

в сопряженной системе

0CM

= - (АС

Осм

)

о/в

+ (АС

осм

)

г/д

(6.21)

300

ГЛ.

СОПРЯЖЕННЫЕ ПРОЦЕССЫ

МИТОХОНДРИЯХ

Полный

электрохимический потенциал каждого компонента

системе выражается формулой

= pV, + z.ST^ + ^. + RT In c

(6.22)

где

р —

давление,

Vi —

молярный объем,

{

—

заряд компонента,

i|)

—

электрический потенциал,

;

—

концентрация (активность).

АН,

Н,0

<?Н

г/Д

/АТФ+^Н

^АДФ+Ф„

а) 6)

Рис.

6.13. Детализация схемы Митчелла,

а —

петли

о/в и г/д; б

—сопряжение

обоих

процессов.

Полная

обобщенная сила, приводящая

равновесию

г-го

компо-

нента

во

внешней фазе

и в

матриксе, равна

ДД(

= Vi Др +

Zi§~ Дг))

RTA

с,-,

(6.23)

причем можно показать,

что

член

ViAp

относительно

мал. Для

протонов

(6.24)

или,

переходя

к рН,

Протонодвижущая сила

Л/

Лф

—

ZApH

(6.25)

(6.26)

состоит, таким образом,

из

двух

вкладов

(Z = 2,3

RT/&~).

При

равновесии

между

внешней

(е) и

внутренней

(i)

фазами

ДДг =

из

(6.23)

следует

с\

Дт1;

= In-г,

(6.27)