Волькенштейн М.В. Общая биофизика

Подождите немного. Документ загружается.

6.6.

ЭЛЕКТРОННО-КОНФОРМАЦИОННЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ

321

успевает перестроиться и остается напряженной. На стадии 2

происходит медленная релаксация комплекса к новому равно-

весию и превращение субстрата в продукт (Ё — новая конфор-

мация

фермента). Свободная энергия понижается на величину

. Далее, в стадии 3 комплекс распадается на фермент и

продукт, но фермент остается в напряженной конформации Е,

Рис.

6.19. Энергетические изменения в последовательных стадиях каталити-

ческого процесса.

медленно релаксирующей к равновесию в стадии 4. Общее по-

нижение

свободной энергии равно

ДО = AG, + AG

+ AG

(6.68a)

Это — термодинамическая модель. Кинетика процесса в цити-

рованных выше работах фактически не рассматривается. Блю-

менфельд считает уравнение Аррениуса или Эйринга неприме-

нимым

к ферментативным реакциям [79, 91]. Утверждается, что

система не характеризуется свободной энергией активации в

обычном смысле слова — все молекулы субстрата, образовав-

шие

надлежащий комплекс с ферментом, релаксирующим к но-

вому конформационному состоянию, претерпевают химическое

превращение.

Влияние температуры на скорость реакции опре-

деляется не изменением числа молекул, способных преодолеть

некоторый

активационный барьер, но изменением исходной

конформации

и, следовательно, пути и скорости последующей

релаксации

[92] (см. также [79, 111]).

Для построения кинетической теории необходимо исследо-

вать относительную роль

двух

механизмов переноса электро-

на—

надбарьерный переход по Эйрингу (см. [3], § 6.1) и тун-

нельный

эффект (см. [79, 92, 111]). Туннельный эффект при

переносе электрона в биологической системе был впервые рас-

смотрен Чансом применительно к бактериальному хлоро-

филлу

[114—116].

322

ГЛ. 6.

СОПРЯЖЕННЫЕ ПРОЦЕССЫ

МИТОХОНДРИЯХ

Константа

скорости активационного перехода равна

-г-ехр

(А)

(6.69)

где F+ — свободная энергия активации. Число актов туннель-

ного перехода в единицу времени равно

exp

[- Ц-

л/2т (U

Е)

(6.70)

где v

—частота «колебаний электрона» в молекуле,

участвую-

щей

в цепи переноса, скажем, в цитохроме с— величина порядка

Рис.

6.20. Две несимметричные потенциальные ямы, разделенные барьером.

с"

, L — ширина барьера, U — его высота, Е— уровень

энергии

электрона, m — его масса. На рис. 6.20 показана схема

потенциальных ям

двух

соседних переносчиков.

Полная

скорость переноса определяется суммой k

и &

- При

высоких температурах преобладает первый член, при низких —

второй. Можно предположить, что F+ и U совпадают. Согласно

имеющимся оценкам L «

10—20

A U « 1—2 эВ [111]. При этих

значениях

3> k\. Отсюда

следует,

что реальные переходы

должны быть практически независимы от температуры, что

противоречит опыту. Однако туннельный переход электрона дол-

жен сопровождаться излучением фононов, возбуждением коле-

баний

молекул, конформационными переходами [92, 93, 112], что

приводит к сильной температурной зависимости.

Молекулярная система ЦПЭ содержит «проводящие группы»,

которых л-электроны делокализованы. Это ароматические

группы белков, простетические группы и коферменты. К прово-

дящим

группам

следует

отнести и атомы переходных металлов.

Размеры таких групп порядка нескольких ангстрем. Проводящие

группы отделены

друг

от

друга

диэлектрическими молекулами

6.6. ЭЛЕКТРОННОКОНФОРМАЦИОННЫЕ

ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ

323

белков и липидов; соответственно, ширины барьеров L порядка

размеров этих молекул, т. е.

10—20

А.

Поведение электрона при его туннелировании зависит от со-

отношения

между

разностью электронных уровней Д£ (см.

рис.

6.20) и величиной резонансного расщепления

£ехр[-

У2т(£/

— £)].

(6.71)

Если

Д£ >> Д£

, то туннельного перехода не

будет.

При

A£.<!A£V

переход произойдет за время т

Ь/АЕ

При Lm20A,

U — E&2 эВ, АЕ

~ Ю-

эВ. Реальные значения АЕ в ЦПЭ

должны быть много больше, и такой идеальный переход невоз-

можен. Туннелирование становится, однако, возможным вслед-

ствие диссипации энергии, обеспечивающей сближение электрон-

ных уровней. Именно ЭКВ создают возможность такой дисси-

пации.

Чернавская и Чернавский [111] рассматривают случай

потенциальных ям, защищенных от ионной среды неполярной

оболочкой. Вблизи места локализации электрона можно выде-

лить лишь несколько заряженных групп, сильно связанных с

электроном.

Рассматривается в качестве предельного случая

лишь

одна колебательная степень свободы. В этой ситуации

возможно возбуждение колебательного кванта £

, причем

АЕ =

/ГСО

= £

(6.72)

или

увеличении энергии уже присутствующего кванта

АЕ = АЕ

Лсо

(6.73)

Значения

и Д£

порядка 0,1 эВ. Вероятность туннельного пе-

рехода

при условии

(6.72)

выражается формулой

w = —г-р(Д£)^ ехр т-

•\2пг(и

— Е) .

(6.74)

Здесь р(АЕ)—плотность уровней конечного состояния, g

10~

—Ю-

— константа, характеризующая

«силу

связи». Если

имеет место случай (6.73), то

{и - Е)\

(6.75)

Функцию

р можно представить либо в лорентцовой, либо в гаус-

совой форме. Последняя имеет вид

Она

имеет резкий максимум при АЕ = АЕ

и быстро убывает

при

АЕ — А£

3> Г

- Ширина резонансной области Г

порядка

Ю-

эВ.

324

ГЛ. 6.

СОПРЯЖЕННЫЕ ПРОЦЕССЫ

МИТОХОНДРИЯХ

Электронно-конформационные взаимодействия

(по

термино-

логии Чернавского электронно-конформационные переходы,

ЭКП)

могут

трактоваться именно таким способом.

Как

указано

в цитированных выше работах

(см. [3], § 6.5, а

также

[72, 73,

111]),

ЭКВ

происходят

при

попадании электрона

поляризуе-

мую

среду,

образованную группами макромолекулы. Среда

по-

ляризуется,

образуется самосогласованное поле, эквивалент-

ное потенциальной

яме для

электрона. Такое образование

физике

твердого тела называется

поляроном.

Если поляриза-

ционная

деформация приводит

состоянию, отделенному

от

исходного энергетическим барьером,

то мы

имеем дело

нели-

нейным

поляроном.

биополимерах поляризация приводит

движению

по

конформационным степеням свободы

—

нелиней-

ный

полярон является

конформоном.

Чернавская

Чернавский

дают

грубую

оценку энергии

размеров конформона [111].

среде, содержащей равномерно

распределенные ионы массы

М,

взаимодействующие

по

закону

Кулона, имеем согласно теореме вириала

« e

/r.

(6.77)

Скорости

v и

расстоянию

соответствует частота колебаний

(о

= ^ =

/-^^-„,

(6.78)

где

п =

(

/зяг

—

число ионов

единице объема. Взаимодей-

ствуя

колебаниями ионов, электрон приобретает энергию йсо

импульс

q =

д/2пгйсо

д/4т

(о2,

где т —

масса электрона.

Согласно соотношению неопределенностей соответствующий

раз-

мер электронного облака равен

_!_ . /_» . /_з_ . /

л*м

~ Л/

2шш

Л/ 32я Л/

Вводя боровский радиус

/те

« 0,5 А,

получаем

4 4 4

—-т-.

(6.79)

32я

V тп V 32я у т па

Размеры полярона (конформона) должны быть того

же

порядка.

Энергия поляризации

по

порядку величины равна

/еЯ,

(6.80)

где

е —

микроскопическая диэлектрическая проницаемость.

На-

конец,

отношение

энергии колебаний

дает

число квантов,

участвующих

образовании полярона,

/tm

(6.81)

6.6. ЭЛЕКТРОННО-КОНФОРМАЦИОННЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ 325

Для белков среднее значение плотности зарядов п ~ 10

см~

т. е. расстояние

между

зарядами порядка 10 А. Если заряды

расположены на протонах, то М = (6,2-10

)~' г. Величину е

можно считать равной 3. Получаем со„«3,5-1О

с~', размеры

полярона X да 15 А, т. е. поляризацией охвачена практически вся

макромолекула. Энергия поляризации Е

« 0,35 эВ, сдвиг уров-

ней

электрона

того

же порядка. Наконец, N примерно равно 15.

В кинетике электронно-конформационных переходов можно

выделить четыре процесса [111].

1) Колебания электрона внутри одной ямы, размером в не-

сколько ангстрем, с частотами порядка 10

с~'.

2) Колебания атомов с частотами порядка k^T/h ~ 10

с~

с амплитудами порядка

10"

—10~

А;

частоты

упругих

колеба-

ний

белковой

глобулы

как целого порядка

10~

—10~

с~'.

3) Туннелирование электрона; как уже сказано, ему отве-

чают

времена порядка

10~

—10~

с и расстояния порядка

10—20

А.

4) Конформационные переходы в макромолекуле с време-

нами

10~

—10—'

с; возможны и значительно более медленные

переходы (см. § 8.6).

Соответственно можно не рассматривать быстрые процессы

1),

2), 3) и пользоваться усредненными по времени значениями

электронной плотности в ямах и усредненными положениями

колеблющихся атомов. Именно такая процедура применена в

описанной

выше модели релаксационных ЭКП. Молекула —

акцептор электрона, получив электрон, оказывается в неравно-

весной конформации, медленно превращающейся в равновесную.

Поэтому для туннельного эффекта

требуется

не совпадение

электронных уровней восстановленных донора и акцептора в их

равновесных конформациях, но наличие надлежащим образом

расположенного виртуального электронного уровня акцептора

в окисленной конформации. Энергия, выделившаяся при тунне-

лировании, диссипирует, но энергия, медленно выделяемая при

конформационной

релаксации к новому равновесному состоя-

нию,

может быть конвертирована в энергию макроэрга (ср. так-

же (93]). Так как туннельный эффект связан с условиями резо-

нанса

электронных уровней энергии, он подвержен влиянию

мембранного потенциала. Следовательно, возможен регулятор-

ный

процесс, состоящий в том, что мембранный потенциал,

создаваемый активным транспортом ионов, зависит от скорости

переноса электронов, которая, в свою очередь,

регулируется

мембранным потенциалом. Реализуется обратная связь, обеспе-

чивающая автоматическое поддержание системы в условиях,

близких к резонансным [79].

Изложенная

концепция

дает

гипотетическое качественное

описание электронно-конформационных взаимодействий в фер-

326 ГЛ. 6. СОПРЯЖЕННЫЕ ПРОЦЕССЫ В МИТОХОНДРИЯХ

мент-субстратном комплексе. Однако мы не располагаем пока

теорией, количественно объясняющей скорость ферментативной

реакции,

в частности, кинетику переноса электронов в мито-

хондриальной системе. Задача такой теории состоит в нахожде-

нии

поверхности свободной энергии фермент-субстратного комп-

лекса как целостной системы, обладающей электронными и кон-

формационными

степенями свободы, и в нахождении пути

процесса. Сама эта поверхность действительно должна меняться

с температурой.

При

рассмотрении пути процесса

следует

учитывать

«кон-

формационную» природу явления. Иными словами, положения

электронных уровней энергии зависят от динамического состоя-

ния

среды — белка, обладающего конформационными степенями

свободы.

Вследствие

медленности конформационных движений

система является адиабатической. Основные положения упро-

щенной

модельной теории, развитой в

работах

[94—96], изло-

жены в § 6.7 книги [3]. В последующих

работах

Кришталика

[97] проведено более детальное рассмотрение фермента, учи-

тывающее наличие в его молекуле большого числа поляр-

ных групп, обладающих ограниченной подвижностью. В этих

условиях в

ходе

процесса должен осуществляться перенос за-

ряда в положения, оптимальные для заданной конфигурации

диполей. Тем самым реализуется определенная предоргани-

зация

среды, способствующая повышению скорости фермента-

тивных реакций и благоприятствующая эстафетному переносу

зарядов на дальние расстояния. Рассмотрено также одновремен-

ное

прохождение

двух

реакций переноса заряда. При благо-

приятных геометрических условиях возможно сильное сопряже-

ние

двух

процессов, в частности, протекание эндергонической

реакции

за

счет

экзергонической.

Теория

Блюменфельда и Чернавского, основанная на рас-

смотрении ЭКВ, существенно отлична от модельных представ-

лений,

используемых в феноменологической теории Митчелла.

Представления об ЭКВ (или ЭКП) имеют более реальные и

глубокие физические основания. Переход от этих представлений

феноменологическому, общему описанию и его согласование

с положениями теории Митчелла, подтвержденными опытом, по-

видимому, окажутся возможными в дальнейшем. Для этого не-

обходимы не

грубые

оценки и качественные гипотезы типа пред-

ложенных в

работах

[26, 73, 74, 90], но подлинная количествен-

ная

теория конформона (или нелинейного полярона). Такая тео-

рия

пока не создана. Ее построение связано с исследованиями

конкретных

процессов, учитывающими детали поведения элек-

тронно-конформацнонной

системы. Эти детали не

могут

быть

получены из умозрительной картины (см. [26]), но лишь из экс-

6.7.

ЦИТОХРОМ

с 327

периментальных данных, которых пока недостаточно. Тем самым

сейчас нет еще возможности строить атомно-молекулярную тео-

рию ЦПЭ в целом.

Следует

начать с рассмотрения отдельных

звеньев процесса, с изучения поведения отдельных ферментов —

переносчиков электронов.

§ 6.7. ЦИТОХРОМ с

Были

проведены рентгеноструктурные исследования окислен-

ной

и восстановленной формы цитохрома с [98—100].

Среди участников ЦПЭ в митохондриях именно цит с наибо-

лее доступен для изучения переносчиков электронов. Этот белок

можно выделить в чистой форме и закристаллизовать. Осталь-

ные компоненты удается пока выделить лишь в виде мульти-

ферментных комплексов: цитохромы Ь и с\ как комплекс цито-

хромредуктазы и цитохромы а и а

как цитохромоксидазу. Ре-

дуктаза снабжает цит с электронами, оксидаза отбирает их у

цит с.

Задолго до рентгенографических исследований было прове-

дено изучение первичной структуры цит с из более чем 40 раз-

личных организмов, начиная с низших растений и кончая

обезьянами и человеком (см. [3], § 2.5, [10]). Результаты этих

работ очень существенны и в биологическом, и в биофизическом

аспектах.

Молекулы цит с позвоночных содержат 104 аминокислотных

остатка, насекомых—107, низших растений—107—109, высших

растений — 111 (в одном

случае

110). Последовательности остат-

ков

хорошо отражают биологическую эволюцию. Так, первичные

структуры цит с человека и шимпанзе тождественны, отличаясь

от структуры цит с обезьяны резуса только одной заменой из

104 остатков — у резуса на 102-м месте фигурирует Ала, вместо

Тре. Цит с гремучей змеи отличается от цит с пекарских дрож-

жей добавлением 5 остатков с N-конца, удалением последнего

остатка с С-конца и 40 заменами, а от цит с человека—12 ос-

татками. Примечательно, что большинство замещений во

всех

исследованных цит с консервативно в том смысле, что мутацион-

ная

замена сохраняет характер остатка. Можно разбить амино-

кислотные остатки на 6 классов: гидрофобные ароматические

(Фен,

Трп, Тир), гидрофобные алифатические (Иле, Лей, Мет,

Вал), гидрофильные основные (Гис, Лиз, Apr, Лиз — СН

), гид-

рофильные кислотные (Асп, Глу), амбивалентные, т. е. малые

гидрофобные или незаряженные полярные (Ала, Асн, Цис, Про,

Глн, Сер, Тре) и, наконец, остаток глицина Гли, не имеющий

боковой цепи. Оказывается, что эволюционные изменения цит с

во всей живой природе от низших растений до человека сводят-

ся,

как правило, к замещениям внутри одного класса, и лишь в

328 ГЛ. 6. СОПРЯЖЕННЫЕ ПРОЦЕССЫ В МИТОХОНДРИЯХ

малом числе случаев к изменению класса остатка. Это указы-

вает на далеко идущее

сходство

пространственной структуры

всех

цит с.

ходе

эволюции клетки перешли от анаэробных процессов

дыханию как источнику энергии. Именно на этой стадии, реа-

лизовавшейся примерно 1,2 миллиарда лет назад, возникли ци-

тохромы. Это весьма древние белки, функциональная

структура

которых очень точно стабилизована естественным отбором, о

чем свидетельствует то обстоятельство, что цитохромы с, выде-

ленные из любого эукариота — растения, животного или микро-

организма, реагируют in

vitro

с цитохромоксидазой любого дру-

гого вида [101].

Сходство структуры

всех

цитохромов с выражается не только

постоянстве расположения 6 классов остатков. Некоторые уча-

стки

цепи вообще не варьируют. 35 из 104 положений заняты

одними

и теми же остатками в цит с

всех

изученных видов,

включая длинную последовательность от

70-го

до

80-го

остатка:

— Асн — Про — Лиз — Лиз — Тир — Иле — Про — Гли —

— Тре — Лиз — Мет —

35 инвариантных мест заняты 15 различными остатками. Дру-

гие 23 места заняты только одним или двумя различными, но

весьма сходными остатками. В 17 местах возможны лишь за-

мены

в пределах

трех

остатков на каждом месте. С

другой

сто-

роны,

имеются немногие места, для которых оказываются допу-

стимыми самые различные замены; сюда относится, например,

остаток № 89

[101].

Эти свойства первичной структуры

всех

цитохромов с пока-

зывают, что пространственное строение фермента, ответственное

конечном счете за его биологическую функциональность, фик-

сировано

достаточно строго. Мутационные нарушения первичной

структуры, приводящие к сколько-нибудь существенным измене-

ниям

строения глобулы, элиминируются естественным отбором,

будучи

летальными. В этом смысле цит с фиксирован точнее, чем

гемоглобин, не говоря уже о фибриллярных белках, но менее

строго, чем гистоны (см. стр. 46).

Таковы важные выводы, которые

следуют

из изучения пер-

вичных

структур

40 различных цитохромов с. Ответ на вопрос

смысле наблюдаемого консерватизма последовательности

остатков

дает

рентгеноструктурный анализ.

На

рис. 6.21 изображена

структура

окисленного цитохрома с

лошади, установленная Дикерсоном и его сотрудниками [101]. Ее

рассмотрение показывает, что группа гема соединена пятой и

шестой валентностями атома железа с имидазольным кольцом

Гис 18 и атомом серы Мет 80. Гем связан ковалентно также

6.7. ЦИТОХРОМ е

329

с Цис 14 и Цис 17. Гем расположен в глубокой выемке, причем

его окружение весьма консервативно в эволюции. Инвариантная

последовательность

70—80

также является частью ближайшего

окружения тема.

Структура цит с характеризуется, как обычно, расположе-

нием

гидрофобных остатков внутри молекулы (см. [3], § 4.6, 4.7),

Лиз

Рис.

6.21. Структура окисленного цитохрома с лошади.

тогда

как заряженные группы, кислотные или основные, нахо-

дятся на ее поверхности. Среди последних групп существенны

остатки Лиз, число которых велико — оно равно 19. Очевидно,

что определенное расположение зарядов на поверхности моле-

кулы важно как для фиксированной структуры глобулы, так и

для электростатических взаимодействий с оксидазой и редукта-

зой

Химические исследования показали, что взаимодействие цит

с с оксидазой действительно имеет электростатический харак-

тер, причем положительные заряды расположены на цит с, а

330 ГЛ. 6. СОПРЯЖЕННЫЕ ПРОЦЕССЫ В МИТОХОНДРИЯХ

отрицательные — на комплексе. Блокировка заряда Лиз 13, на-

ходящегося на правой части молекулы, сильно уменьшает это

взаимодействие. Положительные заряды на

другой

стороне мо-

лекулы, по-видимому, взаимодействуют с редуктазой. В этой об-

ласти находятся и три ароматических остатка: Фен 62, Тир 74 и

Тир

67.

Таким

образом, молекула цит с представляет собой упорядо-

ченную систему, молекулярную машину, предназначенную для

переноса электрона в

результате

определенного взаимодействия

с оксидазой и редуктазой.

Пока

нет прямой информации о том, как эта машина рабо-

тает, что происходит при транспорте электронов с составляю-

щими

ее элементами. Из общих представлений об электронно-

конформационных

взаимодействиях (см. § 6.6)

следует,

что

функциональность

цит с определяется конформационными пе-

рестройками молекулы при переходе из окисленного в восста-

новленное

состояние и обратно. Это подтверждается химиче-

скими

исследованиями [102, 103], дающими, однако, ограничен-

ную информацию.

В работе [100] проведено рентгенографическое исследование

восстановленного цит с из сердца тунца с разрешением до 2,45 А.

Результаты этого исследования сопоставлены с данными для

окисленного

цит с. Таким образом, установлены структуры для

двух

конечных состояний окисления и восстановления цито-

хрома с.

Структура глобулы окисленного цит с тождественна для ло-

шади и рыб — бонито и тунца. Кристаллы для

всех

цит с изо-

морфны,

они относятся к пространственной группе Р4

Напротив,

восстановленные цит с рыб бонито и тунца не изо-

морфны,

их пространственные группы соответственно

]

[101] и P2i2,2 [100].

Сравнение

полученных

структур

восстановленного и окислен-

ного цитохромов с показывает, что в целом они похожи. В обоих

случаях гем погружен в полость молекулы, его ковалентные

связи

с белком одни и те же. Сходно и расположение водород-

ных связей.

Полость,

в которой расположен гем, образована слева остат-

ками

80—84,

задняя стенка полости состоит из боковых цепей

Иле

9 и Иле 85 и Лей 68 и 94. Иле 81 находится на краю поло-

сти.

Вблизи гема расположено 7 «критических» ароматических

остатков, сохраняющихся в эволюции. На дне полости находится

пара Тир 48 — Фен/Тир 46, справа пара Фен 10 —Тир/Фен 94 и

между

гемом и поверхностью молекулы триплет Тир/Фен 74 —

Трп

59 — Тир/Фен 67. Инвариантен также остаток Фен 82.

Майер

и Пал изучали влияние последовательной модифика-

ции

метионинов, тирозилов и триптофанилов N-бромсукциними-