Чупахина Г.Н. Система аскорбиновой кислоты растений

Подождите немного. Документ загружается.

углеродных атомов и сходных по расположению отдельных атомов в положении

-С

с l-АК. Соединения, не отвечающие этим требованиям, как полагает автор,

в биосинтезе АК непосредственного участия не принимают. Основным

материалом для синтеза АК, по его мнению, являются углеводы, и в первую

очередь такие углеводы и их производные, как инозит, сорбит, 2-кето-l-

гулоновая кислота, левулоза и сорбоза.

Большое влияние на биосинтез

аскорбиновой кислоты из экзогенных

субстратов оказывают условия освещенности. Так, в опытах Аберга [193]

выдерживание в темноте в течение 1-5 суток листьев овса и петрушки на 2,5-5%-

ных растворах сахарозы, глюкозы, фруктозы, маннозы, галактозы, ксилозы

снижало в них содержание аскорбиновой кислоты и только при длительном

выдерживании листьев (2-4 суток) на 10-20%-ных растворах сахарозы и 5%-ных

растворах глюкозы и ксилозы в темноте наблюдалось некоторое увеличение

содержания аскорбиновой кислоты по сравнению с исходным. В наших

исследованиях [98, 103] также подчеркивается необходимость света в

образовании аскорбиновой кислоты из глюкозы.

Иного характера данные приводит Е.Ассольбергс [209]. Из большого набора

исследованных им соединений (d-глюкоза, d-фруктоза, l-сорбоза, d-глюкуроно-

вая кислота

, 2-кета-l-гулоновая кислота, глюкозоциклоацетоуксусная кислота и

др.) только γ-лактон глюкуроновой кислоты вызывал значительное увеличение

содержания аскорбиновой кислоты в листьях молодых побегов яблони,

находящихся на свету (18 тыс.люкс, 24,48 часов). Автор не нашел положи-

тельного действия глюкозоциклоацетоацетата на биосинтез АК, в то время как

ряд исследователей [350, 427] рассматривал это соединение как

промежуточное

при биосинтезе АК. Семена фасоли при проращивании в присутствии

радиоактивной глюкозы или радиоактивного глюкозоциклоацетоацетата

использовали последний в пять раз лучше, чем глюкозу [427]. М.Натх и

М.Белкходе [350] также отмечали преимущественное использование

глюкозоциклоацетоацетата в биосинтезе АК по сравнению с глюкозой и

ацетоацетатом. В опытах М.Накатани [З48] ферментный препарат, выделенный из

зародышей 6-дневных зеленых проростков гороха, способных интенсивно

синтезировать АК, катализировал образование АК из d-глюкуроновой, d-

галактуроновой и особенно из диацетон-2-кето-l-гулоновой кислот. В

присутствии d-глюкозы и d-галактозы синтез АК не шел.

Использование углеводов в биосинтезе АК в настоящее время не вызывает

сомнения [368, 402]. Что касается исследования органических

кислот как

субстрата для образования АК, то здесь следует снова обратиться к работе

В.А.Девятнина [32], в которой помимо уже названных соединений изучалось

действие щавелевой, винной, фумаровой, янтарной, лимонной, альгиновой, АК и

2-кета-l-гулоновой кислот. При инфильтрации в проростки овса из них лишь

последняя увеличила содержание АК на 20% по

сравнению с исходным.

Введение АК поднимало собственный уровень лишь на 6%, фумаровой и

лимонной - на 2,6. Винная и альгиновая кислоты не меняли содержание АК,

щавелевая - снижала его на 15%. В опыте использовались растения, выращенные

на свету.

В своей работе по изучению действия органических кислот на биосинтез АК

мы строго контролировали условия освещения во время опыта. В качестве

субстрата использовали α-кетоглутаровую, янтарную, винную, щавелевую,

яблочную и

лимонную кислоты в концентрации 0,005 М. Опытные 7-9-дневные

проростки ячменя, предварительно выдержанные в темноте в течение 48 часов,

помещали на растворы кислот в темноте и на свету люминесцентных ламп ЛЦД-

40 (17 тыс. эрг⋅см

-2

⋅с

-1

) на 6 часов. В связи с тем, что использование глюкозы в

процессе биосинтеза АК является доказанным, в параллельных вариантах листья

помещались на 0,005 М раствор глюкозы и на воду. Контролем служили

растения, растущие во время опыта в темноте.

В таблице 1 представлены данные о действии винной кислоты на биосинтез

АК в проростках ячменя.

На растворе винной кислоты на свету содержание АК в

листьях увеличилось в 2,5 раза по сравнению с контролем, тогда как на растворе

глюкозы - общепризнанном субстрате для биосинтеза АК - в 2 раза, на воде -

лишь на 38%. Положительное действие на биосинтез АК винная кислота, так же

как и глюкоза, оказывала только на свету.

Таблица 1

Влияние винной кислоты на биосинтез АК в 8-9-дневных

проростках ячменя (экспозиция 6 час; интенсивность света 17 тыс. эрг⋅см

-2

⋅с

-1

)

Вариант опыта АК t

мкг/г %

Контроль (а) 49,3 100

На воде:

свет (б)

темн. (в)

67,8

50,9

138

103

= 041,

На 0,005 М растворе винной кислоты:

свет (г)

темн. (д)

126,5

44,4

256

= 927,

= 12 39,

= 085,

На 0,005 М растворе глюкозы:

свет (е)

темн. (ж)

99,0

49,1

201

100

= 609,

= 007,

n = 6, t

табл.

= 2,57 для Р ≤ 0,05

Достаточно хорошо используется в биосинтезе АК и α-кетоглутаровая

кислота (табл.2): содержание АК в листьях, плавающих на 0,005 М растворе α-

кетоглутаровой кислоты, на свету увеличилось на 47%, на растворе глюкозы - на

44. В этой серии опытов использовались проростки с более высоким исходным

содержанием АК, поэтому прибавка АК в абсолютных величинах не столь

высока, как в предыдущих опытах, однако и здесь достоверно показано, что α-

кетоглутаровая кислота используется в биосинтезе АК так же хорошо, как и

глюкоза. Использование α-кетоглутаровой кислоты в этом процессе идет только

на свету.

Положительное действие на биосинтез АК оказала и янтарная кислота

(табл.3). Содержание АК в листьях, находившихся

на растворах янтарной

кислоты и глюкозы, увеличилось соответственно на 51 и 58%, на воде - на 39. В

данных опытах выявлено достоверное накопление АК в листьях, находившихся

в темноте на растворе янтарной кислоты и на воде. Вероятно, в определенных

условиях проростки содержат достаточное количество предшественника АК, что

позволяет им осуществлять синтез АК и в темноте

, независимо от наличия экзо-

генных субстратов.

В проростках ячменя, помещенных на 0,005 М раствор щавелевой кислоты

на свету (табл.4), за 6 часов освещения содержание АК увеличилось на 55% по

сравнения с контролем. В листьях на растворе глюкозы прибавка в содержании

АК составила 56%, на воде - 32. Следовательно, щавелевая кислота наряду с

винной, янтарной и α-

кетоглутаровой может использоваться как субстрат в

биосинтезе АК.

Таблица 2

Влияние

α-кетоглутаровой кислоты на биосинтез АК в 8-дневных

проростках ячменя (экспозиция 6 час; интенсивность света 17 тыс. эрг

⋅см

-2

⋅с

-1

)

Вариант опыта АК t

мкг/г %

Контроль (а) 104,2 100

На воде:

свет (б)

темн. (в)

142,7

115,0

137

110

= 554,

На 0,005 М растворе α-кетоглутаровой кислоты:

свет (г)

темн. (д)

152,8

98,3

147

= 362,

= 048,

= 141,

На 0,005 М растворе глюкозы:

свет (е)

150,1

144

= 870,

темн. (ж)

111,0 106

= 133,

n = 6, t

табл.

= 2,57 для Р ≤ 0,05

Таблица 3

Влияние янтарной кислоты на биосинтез АК в 8-дневных

проростках ячменя (экспозиция 6 час; интенсивность света 17 тыс. эрг

⋅см

-2

⋅с

-1

)

Вариант опыта АК t

мкг/г %

Контроль (а) 126,6 100

На воде:

свет (б)

темн. (в)

175,7

140,9

139

111

= 496,

На 0,005 М растворе янтарной кислоты:

свет (г)

темн. (д)

191,7

137,8

151

109

= 376,

= 138,

= 958,

На 0,005 М растворе глюкозы:

свет (е)

темн. (ж)

199,6

135,8

158

107

= 4,60

= 123,

n = 6, t

табл.

= 2,57 для Р ≤ 0,05

Таблица 4

Влияние щавелевой кислоты на биосинтез АК в 8-дневных

проростках ячменя (экспозиция 6 час; интенсивность света 17 тыс. эрг

⋅см

-2

⋅с

-1

)

Вариант опыта АК t

мкг/г %

Контроль (а) 113,8 100

На воде:

свет (б)

темн. (в)

150,0

125,6

132

110

= 2,79

На 0,005 М растворе щавелевой кислоты:

свет (г)

темн. (д)

176,4

144,4

155

127

= 745,

= 054,

= 355,

На 0,005 М растворе глюкозы:

свет (е)

темн. (ж)

178,2

130,5

156

115

= 361,

= 193,

n = 8, t

табл.

= 2,36 для Р ≤ 0,05

Наиболее активно биосинтез АК идет в проростках, помещенных на раствор

щавелевой кислоты на свету, однако щавелевая кислота может использоваться и

в темноте.

Содержание АК в проростках, используемых в опытах по изучению

действия яблочной кислоты на биосинтез АК, было низким (табл. 5), поэтому

отмечалось резкое возрастание содержания АК в освещенных листьях,

находящихся на

воде и на глюкозе (на 113 и 140%). В варианте же с яблочной

кислотой увеличение АК составило всего лишь 48%, т.е. меньше, чем на воде.

Таблица 5

Влияние яблочной кислоты на биосинтез аскорбиновой кислоты в 7-дневных

проростках ячменя (экспозиция 6 час; интенсивность света 17 тыс. эрг

⋅см

-2

⋅с

-1

)

Вариант опыта АК t

мкг/г %

Контроль (а) 50,4 100

На воде:

свет (б)

темн. (в)

107,5

47,6

213

= 139,

На 0,005 М растворе яблочной кислоты:

свет (г)

темн. (д)

74,4

58,2

148

115

= 632,

= 735,

= 091,

На 0,005 М растворе глюкозы:

свет (е)

темн. (ж)

121,2

43,5

240

= 346,

= 385,

n = 8, t

табл.

= 2,36 для Р ≤ 0,05

В следующей серии опытов исследовалось действие лимонной кислоты на

накопление АК (табл. 6). Здесь также отмечено резкое возрастание содержания

АК в освещенных проростках, причем прибавка АК была почти одинаковой во

всех вариантах: на воде - 89%, на растворе лимонной кислоты - 94%, несколько

большее увеличение на растворе глюкозы - 104%. Во всех темновых вариантах

прибавка АК составила 19-26%. Следовательно

, в присутствии экзогенной

лимонной кислоты скорость новообразования АК на свету не увеличивается по

сравнению с контролем на воде, а в случае с яблочной кислотой даже

уменьшается.

Таким образом, наряду с углеводами в процессе биосинтеза АК могут

использоваться соединения, содержащие более короткую углеродную цепочку, в

частности некоторые органические кислоты, такие, как щавелевая, янтарная,

винная и

α-кетоглутарозая. Причем использование их идет преимущественно на

свету, а в случае с винной и α-кетоглутаровой кислотами - только на свету [110].

Стимуляцию накопления АК в присутствии экзогенной щавелевой и винной

кислот можно объяснить исходя на того факта, что деградация АК в растениях

идет с образованием данных кислот. Следовательно, при их

избытке, когда воз-

можно ингибирование процесса деструкции молекулы АК конечными про-

дуктами реакции, снижаются ее потери.

Таблица 6

Влияние лимонной кислоты на биосинтез аскорбиновой кислоты в 8-дневных

проростках ячменя (экспозиция 6 час; интенсивность света 17 тыс. эрг

⋅см

-2

⋅с

-1

)

Вариант опыта АК t

мкг/г %

Контроль (а) 73,8 100

На воде:

свет (б)

темн. (в)

139,6

92,3

189

125

= 19 91,

На 0,005 М растворе лимонной кислоты:

свет (г)

темн. (д)

143,6

87,6

194

119

= 071,

= 108,

= 505,

На 0,005 М растворе глюкозы:

свет (е)

темн. (ж)

150,6

92,9

204

126

= 156,

= 247,

n = 6, t

табл.

= 2,57 для Р ≤ 0,05

Стимуляцию синтеза АК экзогенными субстратам вообще, и органическими

кислотами в частности, нельзя интерпретировать однозначно, как

непосредственное использование этих соединений при новообразовании АК.

Возможно опосредованное ускорение биосинтеза АК через стимуляцию других

процессов, например, ЦТК в случае с органическими кислотами -

интермедиатами цикла [15]. Это предположение проверялось в опытах по

исследованию действия экзогенного пирувата,

декарбоксилирование которого

дает уксусную кислоту, используемую в ЦТК. Исследования показали

стимуляцию синтеза АК в листьях ячменя, плавающих на 0,005 М растворе

пирувата, по сравнению с вариантом, где в качестве субстрата использовался

0,005 М раствор глюкозы (рис.1). Положительное действие пирувата

наблюдалось только у освещенных растений (рис. 2). Следовательно,

существует связь биосинтеза АК с функционированием ЦТК на

свету.

Рис. 1. Накопление АК в освещенных (31,5 тыс. эрг⋅см

-2

⋅с

-1

) листьях ячменя,

плавающих на 0,005 М растворе глюкозы (1) и 0,005 М растворе пирувата (2)

различное время

Рис. 2. Действие экзогенного пирувата (0,005 М) на накопление АК в листьях ячменя в

темноте (1) и на свету (31,5 тыс. эрг⋅см

-2

⋅с

-1

) (2)

Более достоверные и информативные данные при исследовании

возможности использования в биосинтезе АК тех или иных соединений,

несомненно, дает метод меченых атомов. Показано, что изолированные листья

девичьего винограда пятилисточкового (Parthenocissus quinquefolia α.)

трансформируют меченую d-глюкозу (5-

H-1-

С-глюкозу и

H-,

С-глюкозу) в

АК с сохранением порядка атомов С-цепочки и С-6-положения оксиметильной

группы [271, 272]. Таким образом, метод позволяет не только однозначно

решить вопрос о возможности использования конкретного субстрата в

биосинтезе АК, но и дает материал для решения вопроса о путях ее биосинтеза.

Подробнее эти два взаимосвязанных вопроса будут рассматриваться в

следую-

щем разделе.

3.2. Химизм биосинтеза

Установление веществ, необходимых для образования АК, является лишь

первым этапом в изучении путей ее синтеза, которые до сих пор полностью не

исследованы [28, 306]. Наиболее значительные работы в этой области

выполнены двумя группами исследователей: Ф.Ишервуд, Л.Мапсон, Г.Чжень и

Ф.Ловус, Р.Джанг, а в последние годы - Ф.Ловус в сотрудничестве

Я.Хелспером, К.Саито и др. уже больше внимания обращали не на биосинтез, а

на метаболизм АК.

Большинство авторов наиболее вероятными предшественниками АК

считают d-глюкозу и d-галактозу [150]. Это значит, что при превращении их в l-

АК гидроксильные группы у пятого углеродного атома должны быть

перемещены из d, положения

в l. Это может осуществиться прямой инверсией

групп у С

или инверсией всей цепи так, что С-1 d-глюкозы станет С-6

углеродной цепи АК. Имеется несколько возможных механизмов для

реализации этих изменений.

Ф.Ишервуд, Г.Чжень, Л.Мапсон [282, 283] считают, что превращение d-глю-

козы и d-галактозы в l-АК включает инверсию всей молекулы и идет без

предварительного расщепления углеродной

цепи:

CHO CHO СH

OH CO

Н-С-OH H-С-OH H-С-OH HO-С

НО-С-H HО-С-H HО-С-H * HО-С О

H-C-OH H-C-OH H-C-OH H-C

H-C-OH H-C-OH H-C-OH HO-C-H

СH

OH СOOH СOOH СH

-OH

D-глюкоза D-глюкуро- L-гулоно- L-АК

новая кислота вая кислота

* инверсия

Биосинтез АК, по их мнению, более вероятно протекает из d-галактозы

путем окисления ее в d-галактуроновую кислоту, восстановления d-

галактуроновой кислоты в l-галактоновую и окисления γ-лактона последней в l-

АК:

CHO CHO СH

OH CO

Н-С-OH H-С-OH H-С-OH HO-С

НО-С-H HО-С-H HО-С-H * HО-С О

HO-C-H HO-C-H HO-C-H H-C

H-C-OH H-C-OH H-C-OH HO-C-H

СH

OH СOOH СOOH СH

-OH

D-галактоза D-галактуро- L-галактоно- L-АК

новая кислота вая кислота

Приведенная схема не включает всех промежуточных соединений на пути

синтеза АК. Л.Мапсон и Ф.Ишервуд [327] более подробно анализируют

превращение d-галактуроновой кислоты в l-АК растительными экстрактами. Под

влиянием экстракта из проростков гороха происходит превращение

производных d-галактуроновой кислоты в производные l-галактоновой кислоты

и дальше в l-АК. Этот

процесс in vitro осуществляется в две стадии:

1) восстановление метил-d-галактуроната в l-галактоно-γ-лактон под

влиянием фермента, локализованного в растворимой части цитоплазмы; процесс

идет за счет восстановленного НАД⋅Н;

2) окисление лактона в АК, требующее присутствия ферментного ком-

понента, заключенного в митохондриях.

Эффективность использования l-галактоно-γ-лактона в биосинтезе

АК

показана и другими авторами [287], наблюдавшими при его введении в листовые

пластинки Petroselinum crispum резкое возрастание АК, содержание которой

через 190 часов достигало 12% от сухого веса.

Правильность предлагаемой схемы синтеза проверяется следующим

образом: в качестве субстрата растениям дается предполагаемое промежуточное

вещество и регистрируется, насколько быстро из него синтезируется АК. В том

случае, когда образование

АК идет из d-глюкозы, непосредственным

предшественником l-АК будет l-гулоно-γ-лактон [74, 283, 388]. Возможность

использования в синтезе АК d-галактуроновой кислоты и гулонолактона

отрицалась Е.Ассольбергсом [209], который показал, что в отрезанных листьях

яблони они вызывали меньший синтез АК, чем водный контроль. Автор

предполагал, что промежуточное вещество между глюкуроновой и АК может

быть иным, чем γ-лактон.

Схема биосинтеза АК, предложенная Ф.Ишервудом с сотрудниками,

находит

подтверждение в экспериментах с использованием экзогенных

субстратов (in vivo) и ферментных препаратов (in vitro). Подкормка проростков

салата, бобов и гороха l-галактоно-γ-лактоном легко дает l-АК. Д-глюкуроно-γ-

лактон и l-гулоно-γ-лактон также дают l-АК, но в намного меньшем количестве,

чем соответствующие производные галактозы.

Ф.Ишервуд с сотрудниками первыми

демонстрировали образование l-АК in

vitro в экстрактах из проростков гороха, используя l-галактоно-γ-лактон как

субстрат. Ответственные ферменты были всецело локализованы внутри

митохондрий. L-галактоно-γ-лактон быстро превращался в l-АК. Скорость

превращения l-гулоно-γ-лактона в l-АК составляла лишь 1/20 от скорости

предыдущей реакции [282].

Таким образом,

группой Ф.Ишервуда получены экспериментальные данные

в подтверждение того, что в биосинтезе АК могут быть использованы

производные d-глюкозы и d-галактозы, причем последние: d-галактуроновая

кислота, l-галактоно-γ-лактон - являются лучшими субстратами, чем

соответствующие производные d-глюкозы. Этот путь образования АК, по

мнению авторов, включает инверсию углеродного скелета исходной

молекулы и

образование промежуточных фосфорилированных продуктов.

Схема путей биосинтеза l-АК у Euglena gracilis, предложенная С.Шигеока

[402], предусматривает возможность обмена метаболитами, образующимися из

d-глюкозы и d-галактозы при перестройке их в молекулу АК:

Д-глюкоза Д-галактоза

UДР-глюкоза UДР-галактоза

(А)

UДР-глюкуроновая кислота UДР-галактуроновая кислота

Д-глюкуроновая кислота Д-галактуроновая кислота

(В)

Д-глюкуроно-γ-лактон L-галактоновая кислота

(В)

L-гулоно-γ-лактон L-галактоно-γ-лактон

(С) (С)

L-аскорбиновая кислота

Жирные линии на схеме показывают главный путь синтеза АК, в ней

приведены некоторые ключевые ферменты, катализирующие данный процесс: