Елинов Н.П. Основы биотехнологии

Подождите немного. Документ загружается.

сравнении с растительными и животными клетками микробы

размножаются, как правило, быстрее и, следовательно, у них

быстрее протекают все метаболические (обменные) процессы.

Относительные преимущества большинства микробов как биообъ-

ектов следующие:

1) большая "простота" организации генома,

2) достаточно легкая приспособляемость (лабильность) к среде

обитания в естественных и искусственных условиях,

выраженные скорости протекания ферментативных реакций

и нарастания клеточной массы в единицу времени.

Первое преимущество обеспечивает микробным клеткам луч-

шие возможности для изменения и перестроек наследственного

материала, например, включение в него чужеродной генетической

информации, привнесение в клетки или, напротив, элиминация из

них плазмид, и пр.

Второе преимущество, связанное с лабильностью микробов,

можно показать на примере бактерий и грибов. Так, применитель-

но к температуре микробы подразделяют на психрофилы, мезо-

филы и термофилы (от греч. psichria — холод, mesos — средний,

terme — теплота, fileo — люблю) со следующими оптимумами

показателей для них: ниже 20°С, 20—45°С и выше 45°С соответст-

венно. Однако указанные интервалы, как

правило,

перекрываются.

Например, психрофильный вид Xanthomonas pharmiicola может

расти при температуре от

0°С

до +

40°С,

мезофильный Lactobacillus

lactis — от + 20°С до +

50°С,

термофильный Вас. coagulans — от

20°С

до +65°С. Поэтому выделили дополнительные подгруппы:

облагатные психрофилы, факультативные психрофилы, стено-

термофилы и эвршпермофилы. Первые из них не растут при

температуре выше +20°С, для вторых верхний температурный

предел превышает +

20°С,

третьи не растут при температуре ниже

37°С,

четвертые растут при температуре ниже + 37°С.

Кроме стенотермофилов и эвритермофилов целесообразно вы-

делить еще одну подгруппу термофильных микроорганизмов под

названием супертермофилов, для которых температурный опти-

мум составляет 105°С, то есть выше точки кипения воды (100°С).

К числу таких микробов относят бактерии родов Pyrodictium и

Pyrococcus. Так для Pyrococcus furiosus, изолированного из подвод-

ного гидротермального излияния около средиземноморского ост-

рова Вулкано, кардинальные точки температуры (minimum,

optimum, maximum) составляют 60°С, 105°С, 110

С. Среди супер-

термофилов отдельные представители являются или могут быть

375

•

loa

20.

„«<*>

/\ !/

/ \ /I

\ /

'r/

*°«

источником термостабильной ДНК-полимеразы, активной к тому

же при высоких давлениях (рис. 124).

Рис."

124.

Скорость роста

или другой физиологиче-

ской функции микроорга-

низмов (V max) в процентах

от максимального значения

для данных условий: 1 —

пеихрофилы, 2 — мезофи-

лы,

3 — термофилы, 4 —

и' 105 но супертермофилы.

Среди грибов имеются пеихрофилы и мезофилы, реже -~

эвритермофилы (от греч. euris —. широкий), но до .сих пор не

описаны грибы — стено- и супертермофилы. Например, аспоро-

генные"дрожжи Candida включают виды, способные расти при

температуре

в диапазоне от — 10°С до +37

C; диморфный гриб

Aureobasidiumpullulans растет при температуре от 16°С до 30°С.

Грибы-садрофиты — продуценты БАВ выращивают в производст-

венных условиях обычно при 24—26°С.

Клетки микроорганизмов проявляют также лабильность к из-

менению в среде концентрации водородных

ионов.

Давно известна

следующая закономерность — бактерии более выраженно прояв-

ляют свою физиологическую активность в средах при значениях

рН выше 7,0, тогда как грибы — при рН ниже 7,0. Однако это не

значит, что' отдельные микробы не будут расти и размножаться

при существенных отклонениях рН. Так, молочнокислые бактерии

в процессе размножения закисляют среду до рН 3,0 и ниже;

некоторые представители дрожжей рода Candida на питательных

средах с рН

8,0—10,0

способны накапливать биомассу клеток

достаточно эффективно после заметной пролонгации lag- и log-

фаз.

это время происходит не только адаптация к среде обитания,

но и постепенное закисление.

Диморфный дрожжеподобный гриб Aureobasidium pullulans

хорошо развивается при рН 6,0—6,5, но продуцирует экзогликан

— аубазидан более выраженно при рН 3,0—3,5.

Образование ряда вторичных метаболитов нитчатыми грибами

имеет место на грани между стационарной и летальной фазами,

когда происходит защелачивание сред. Так, Penicillium notatum

лучше растет при рН 4,5, тогда как продукция пенициллина более

выражена при рН 7,5.

376

Третье преимущество микробов, связанное с большими скоро-

стями ферментативных реакций, можно показать на примерах

размножения отдельных видов различных микроорганизмов. Так,

удвоение числа клеток E.coli и Вас. subtilis на благоприятных

питательных средах наблюдается, в среднем, через 20 минут;

почкование Candida albicans на жидком суслё

—]

через 30 минут;

после проникновения Т-четной фаговой частицы в клетку Е. coir

через 20 минут появляется от 20 до 200 новых фаговых частиц, и

т. п. Конечно, в мире микробов имеются представители, скорость

размножения которых определяется сутками, например, микобак-

терии туберкулеза. С учетом условий среды культивирования и

активности ферментов (чаще — иммобилизованных), скорость

реакции является, в основном, результатом скорости реакции в

непосредственном микроокружении активных центров ферментов

и диффузии субстратов и веществ в направлении к этим центрам

и от них — в противоположную сторону.

Микробы относятся к живым саморегулирующимся системам,

восстанавливающим равновесие после какого-либо воздействия,

если оно не было чрезмерно сильным и продолжительным. Если

же воздействие действительно было сильным и продолжительным,

то организм погибает или переходит в новое устойчивое (равно-

весное) состояние. Это может произойти, например, после воздей-

ствия мутагенных факторов и образования мутантов (см. выше

первое преимущество микробных клеток). В этой связи необходи-

мо отметить, что микроорганизмы легче приспосабливаются, или

адаптируются к изменившимся условиям существования, чем рас-

тения и животные, хотя и среди микробов адаптивные возможно-

сти у видов-сапрофитов более выраженные, чем у видов-паразитов;

это связано с более широким набором ферментов у первых, нежели

у вторых. Поскольку ферменты — это первичные метаболиты, то,

в конечном итоге, их арсенал определяется генотипом.

Микробиотехнология на клеточном уровне практически реа-

лизована значительно раньше, чем фито- и зообиотехнологии. Для

примера можно назвать приготовление ряда пищевых продуктов

(кисломолочных, хлеба, сыров), производство вин, пива, спиртов,

органических кислот, аминокислот, антибиотиков, ферментов, от-

дельных витаминов, белковых и других кормов для сельскохозяй-

ственных животных, а также веществ, производство которых

основано на методах генетической инженерии, и пр.

В данной главе не приведены материалы о биотехнологии

вирусных препаратов и о процессах, в которых применяют прото-

377

зойные организмы. Вирусы — как облигатные, или безусловные

паразиты выращивают в живых тканях животных организмов, а

протозоа пока не нашли широкого практического воплощения в

производстве. Поэтому определенные сведения о тех и других даны

в главе 11.

Микроскопические водоросли

—

как биообъекты рассмотрены

в главе 10. Настоящая глава посвящена биотехнологическим про-

цессам, основанным на использовании биообъектов — представи-

телей двух царств — бактерий и грибов.

9.1.

Принципы культивирования микроорганизмов. С момента

внесения микробов (засева) в питательную среду имеет место

индукция их физиологической активности, особенно — в логариф-

мическую и/или стационарную фазы размножения. При этом

одновременно сопряженно протекают многие реакции, катализи-

руемые иммобилизованными или свободными ферментами. В ре-

акции, особенно — на первых этапах, нередко вовлекаются высо-

комолекулярные вещества с определенной конфигурацией моле-

кул (сравнить такие источники углерода как глюкоза и крахмал

или источники азота—аммония сульфат, какая-либо аминокислота

и нативный белок). Поэтому следует учитывать специфику выра-

щивания микроорганизмов.

Главные особенности культивирования микробов в целях пол-

учения большинства первичных и вторичных метаболитов следу-

ющие:

необходимость применения специальных биореакторов вме-

стимостью 63, 200, 1000 и более м

, в которых возможно поддер-

жание асептических условий в течение сравнительно длительного

времени;

2) видовые различия биообъектов, с которыми связаны специ-

фические характеристики питательных сред, кардинальные точки

(минимальные, оптимальные и максимальные) температуры и рН;

3) невозможность одновременного поддержания постоянства

критериев химического, теплового, диффузионного и гидродина-

мического подобия, с чем связаны трудности масштабирования

биотехнологических процессов;

4) различия в массообменных процессах у аэробов и анаэробов

—

культивирование аэробов осуществляют в трехфазных системах

["твердое

тело (клетки)-жидкость-газ"], анаэробы выращивают в

виде двухфазных систем

["твердое

тело (клетки)-жидкость"];

5) необходимость перемешивания культуральных жидкостей в

целях улучшения массообмена (кислорода воздуха для аэробов —

378

прежде всего), а это, в свою очередь, индуцирует ценообразование

и, как следствие, диктует необходимость прибегать к пеногашенйю;

6) микроорганизмы чувствительны к воздействию механиче-

ских, физических и химических факторов;

7) при микробном синтезе целевых продуктов имеют место

индукция, активация, ингибирование, репрессия и некоторые дру-

гие регуляторные процессы, усложняющие в целом регуляцию

размножения продуцента и биосинтез им конечного продукта;

8) скорость биосинтеза целевых продуктов более медленная по

сравнению со скоростями химического синтеза;

9) отдельные виды микроорганизмов, используемых в биотех-

нологических процессах, являются болезнетворными и работа с

ними должна проводиться с особой тщательностью (дифтерийные

и столбнячные палочки, микобактерии туберкулеза, холерный

вибрион и др.);

10) некоторые представители микробного мира должны куль-

тивироваться только на (в) живых тканях/клетках (куриные эмб-

рионы, клетки человека и животных и

т.

д.);

к таким представителям

можно отнести вирусы, риккетсии.

Любой биотехнологический процесс.реализуют условно в два

этапа. Первый из них — предферментация, когда необходимо

выполнить все подготовительные работы для реализации второго

этапа — ферментации, то есть накопить и выделить целевой

продукт.

Предферментация

Предферментационный этап включает подготовку питательных

сред, биообъекта, воздуха для аэробов и биореактора. Компоненты

питательных сред подбирают на основании расчета материального

баланса, связанного с трансформацией того или иного источника

питания в клеточную биомассу и/или метаболит при учете расхо-

дуемой (выделяемой) энергии. Обычно качественный и количест-

венный составы питательных сред указаны в регламентной доку-

ментации.

Питательные среды, используемые на подготовительном этапе,

могут несколько отличаться от среды, применяемой на втором

этапе. Так, например, при пересеве лиофильно высушенной ма-

точной культуры обычно рекомендуют обогащенные питательны-

ми ингредиентами жидкие среды. Последующие пересевы осуще-

ствляют вначале на агаризованную ферментационную среду, а

затем — на жидкую.

На всех этапах подготовки биообъекта питательные среды

перед их засевом должны быть стерильными (см. главу

7).

Биообъ-

379

ект,

или

промышленный штамм

идеале должен удовлетворять

следующим основным требованиям:

1) стабильность структурно-морфологических признаков

и фи-

зиологической активности

при

длительных хранении

эксплуата-

ции

производстве;

2) повышенные скорости роста

биосинтеза целевого

(-ьгх)

продукта (-ов)

лабораторных

производственных условиях;

3) достаточно широкий диапазон устойчивости

воздействию

неблагоприятных внешних факторов (колебания температуры,

рН,

аэрация, перемешивание, вязкость среды);

4) умеренная требовательность

ограниченному числу источ-

ников питания;

чем

более широкий набор источников углерода,

азота

других элементов может использовать производственный

штамм,

тем

легче

его

культивировать

и с

большей экономической

выгодой.

В действительности каждый штамм имеет свои особенности

не

по

всем показателям отвечает вышеперечисленным требовани-

ям.

Как

правило,

чем

богаче усвояемыми ингредиентами питатель-

ная среда,

тем

лучше растет

метаболизирует на(в)

ней

микроор-

ганизм.

Уже

многие годы используют кукурузный экстракт

качестве добавки

питательным средам, поскольку

он

богат

не

только источниками углерода

азота,

но

также микроэлементами

и витаминами. Сухие вещества

в нем

составляют 45—55%,

в их

состав входят зольные вещества —.

1,5—4,5%

(таблица

40).

а б л и ц а

40. Химические ингредиенты

составе сухих веществ

(СВ)

и золы кукурузного экстракта

Ингредиент

Аминокислоты

(в СВ)

Алания

Аргинин

Валин

Гистидин

Изолейцин

Кислота

аспарагиновая

Кислота

глутаминовая

Содержание,

2,4-5,9

1,0-2,4

0,8-1,8

0,2-0,4

3,5-4,2

1,0-2,7

3,5-8,8

Ингредиент

Зольные

элементы

Алюминий

Железо

Калий

Кальций

Магний

Марганец

Медь

Натрий

Фосфор (РгОб)

Содержание,

0,007-0,02

0,023-0,068

0,450-1,350

0,225-0,675

0,188-0,563

0,006-0,018

0,001-0,002

0,075-0,225

0,006-0,018

380

Продолжение табл.

Ингредиент

Лейцин

Лизин

Метионин

Пролин

Серии

Тирозин

Треонин

Триптофан

Фенилаланин

Цистин

Содержание,

2,7-4,2

1,6-3,7

0,2-0,6

1,6-2,0

1,2-2,0

0,5-1,0

0,4-1,1

0,5-1,0

0,8-1,3

0,2-0,4

Ингредиент

Цинк

Витамины

(в

СВ):

Биотин

Кислота

никотиновая

Кислота

пантотеновая

Кислоты

органические

(летучие,

молочная)

в СВ

Сахароза

в СВ

Содержание,

о/

/о

0,005-0,016

(1,5-5,5)

• 10"

(1,2-1,8)-10

-2

(0,8-1,4)-10

-2

5,1-12,0

0,1-11,0

Не менее часто применяют дрожжевой экстракт

из

клеток

Saccharomyces cerevisiae, богатый различными веществами —ами-

нокислотами (аргинином

— 5%,

валином

—

5,5%, гистидином

—

4%,

изолейцином

— 5,5%,

лейцином

— 7,9%,

лизином

— 8,2%,

метионином —

2,5%,

тирозином

—

5%,

треонином

—

4,8%, трипто-

фаном

— 1,2%,

фенилаланином

— 4,5%,

цистином

— 1,5%) и

витаминами (биотином

—

0,06%, инозитом

— 0,3%,

кальция

пантотенатом

—

0,01%,

кислотой р-аминобензойной

—

0,016%,

кислотой никотиновой

—

0,059%, кислотой фолиевой

—

0,001%,

пиридоксина монохлоридом

—

0,002%, рибофлавином

—

0,01%,

тиамина монохлоридом

0,017%, холинхлоридом

—

0,27%)

в расчете

на сухое вещество.

тому

же в

биомассе клеток дрожжей содер-

жится

до

50% белков.

Вместо экстракта можно добавлять автолизат

или

гидролизат

дрожжей.

Объемное

дозирующее оборудование

для

измерения, транс-

портировки

загрузки биореакторов аналогично оборудованию,

применяемому, например,

пищевой (или

химической) промыш-

ленности: различных типов весы, насосы (например, вакуумные),

транспортеры (ленточные, шнековые), элеваторы, контейнеры

др.

Газообразные

жидкие продукты обычно подают

биореак-

торы

по

системам стерильных трубопроводов.

крупномасштаб-

ном производстве питательные среды

некоторые

их

компоненты

стерилизуют нагреванием и/или фильтрованием через пористые

381

мембраны. Тепловая стерилизация может быть периодической и

непрерывной; в биотехнологии применяют оба вида стерилизации.

В случае получения лекарственных средств, например, антиби-

отиков для парентерального введения, необходима исключительно

высокая степень стерильности питательных сред и целевых про-

дуктов. При этом необходимо стремиться снизить, например,

вероятность выживания бактериальных спор до величины менее

10'

исходя из уравнения:

1—P

(t)

= l — e"

, где Р — популяция микроорганизмов, е —

логарифм натуральный, t-время, N

**',

— численность

жизнеспособных микроорганизмов в среде до начала стерилиза-

ции, kd — величина, обратная средней продолжительности жизни

микроорганизма,

— P

(t) - вероятность выживания хотя бы одной

микробной особи при вероятности гибели

P,(t) =

l—(1—|

е-**' |)N

Понятно, что перед засевом биообъекта стерильными должны

быть и питательная среда и биореакторы. Стерилизацию биореак-

торов часто проводят одновременно со стерилизацией питательной

среды в них.

Подготовку биообъектов проводят согласно прилагаемым к

регламентам инструкциям. В заводской или цеховой лаборатории

должна быть подготовлена культура для последующей наработки

инокулюма (инокулята), или посевного материала. В этих целях

исходный штамм микроорганизма, сохраняемый в условиях, близ-

ких к анабиозу или анабиоза (высушенным в стерильной почве,

песке, на пшене, путем лиофилизации, или сублимационной суш-

ки),

оживляют после добавления стерильной жидкой питательной

среды с последующим высевом на уплотненную питательную

среду. Убедившись в подлинности и чистоте культуры (культура

называется чистой, если родительские и дочерние клетки в ней

практически неразличимы и между ними нельзя установить род-

ственные связи), операции по пересеву штамма на среду возраста-

ющих объемов (площади) повторяют несколько раз и проводят в

асептических условиях, переходя от пробирок к колбам, помеща-

емым на качалочные устройства (шюттель-аппараты).

Последующую подготовку биообъекта осуществляют в цехе,

используя небольшие ферментаторы-инокуляторы, в которых на-

ращивают посевной материал для промышленных ферментации.

При этом одноклеточные культуры чаще доводят до середины —

окончания Log-фазы, то есть когда клетки делятся синхронно.

Известно понятие степень синхронизации, то есть степень участия

382

клеток популяции

синхронном делении

(О.

Шербаум,

1959—

1960),

выражающаяся в индексе синхронизации (Is):

/.=

1 1 —

где

— число клеток перед началом их синхронного деления, N\

— число клеток после синхронного деления, Т — время, приходя-

щееся на Log — фазу, g — продолжительность одной генерации.

Индекс синхронизации характеризует степень однородности по-

пуляции.

При необходимости синхронизацию деления можно индуциро-

вать,

например, метаболическим шоком (предварительный посев

культуры на голодные среды), температурным шоком (смена тем-

ператур, в частности, пониженных в начале на оптимальные в

последующем), или используя одинаковые по размеру клетки,

механически разделенные, например, фильтрованием (селектив-

ные методы) и т. п.

В зависимости от плотности суспензии ее необходимое коли-

чество может достигать 1—20% объема производственного фер-

ментатора. Для аэробных микроорганизмов в инокулятор достав-

ляют очищенный стерильный воздух.

В целом, предферментация схематично представлена на рис.

125.

В инокуляторах, как и в промышленных ферментаторах,

целесообразно поддерживать незначительное избыточное давле-

ние воздуха, когда случайные утечки будут происходить только в

направлении из системы, а не наоборот. Этим дополнительно

обеспечивается асептичность биотехнологического процесса.

ВуСАШЩЯХ

цешшоа

цежл

(yvacnu)

Подготови

итательвых сред

• малых объема*

Подготоая*

культуры

Рис.

125. Схема получения посевного материала

— инокулятор, 2 — мешалка,

3 — подача очищенного стерильного воздуха для микроорганизма-аэроба, 4 —

регулирование процесса, 5 — сливной штуцер).

383

Инокуляторы должны отвечать следующим основным требова-

ниям: конструктивные простота, удобство и надежность эксплуа-

тации. Посевные аппараты отечественного производства имеют

следующие объемы: 10, 5, 2 и 0,63 м

, диаметром от 0,9 до 2 м и с

частотой вращения мешалки от 180 до 270 оборотов в минуту.

Ферментация

Второй этап биотехнологического процесса, называемый фер-

ментацией, проводят в производственных биореакторах. По био-

химической сущности он во многом имитирует предферментацию

и поэтому названный термин является условным. Тем не менее,

он принят на практике и в специальной литературе и не нуждается

в каких-либо дополнительных пояснениях.

В процессе ферментации также необходимо использование

стерильных питательных сред, воздуха и биореакторов, выбор

которых обусловлен особенностями культивируемых микроорга-

низмов. На рис. 126 представлены подходы к такому выбору (см.

также главу 7).

Биореакторы для аэробных

Подвод энергии

с газовой фазой

(ФГ)

микроорганизмов

Подвод энергии

с жидкой фазой

(ФЖ)

С самовсасывающей

мешалкой

Подвод энергии с жидкой

и газовой фазой

(ФЖГ)

-»

-•

-»

С перемешивающими

устройствами

С вибромешалками

ФГ с принудительной

циркуляцией

Комбинированные

Одноклеточные

(бактерии, дрожжи)

Одноклеточные (бактерии,

дрожжи), нитчатые грибы

микроорганизмы

Рис.

126. Подход к выбору биореакторов для аэробных микроорганизмов.

384