Елинов Н.П. Основы биотехнологии

Подождите немного. Документ загружается.

(Продолжение таблицы 41)

Микроорганизм

Clostridium thermocellum

Clostridium thermohyd-

rosulfuricum

Clostridium thermosac-

charolyticum

Thermoanaerobacter

ethanolicus

Оптимальные

параметры

культивирования

6,9-7,5

—

5,8-8,5

t°,

°с

69-70

55-60

Выход

этанола,

%от

макси-

маль-

ного

Макси-

маль-

ная

кон-

цент-

рация

этанола,

г/л

1,5

—

на кси-

лозе

Примечание

Образует

активный

целлюлозный

комплекс,

не утилизирует

ксиланы,

ксилозу.

Соотношение

этанола

и ацетата = 1:1,

устойчив

в ассоциациях

Аэротолерантен,

время

генерации 70

мин.

Образует

бутират

Широкий

оптимум рН;

время

генерации

90 мин.

качестве сырья для производства этанола в различных странах

используют доступные растительные источники: зерновые, карто-

фель и свекловичная меласса — в России, Украине, Беларуси;

сахарозу и тростниковую мелассу — в США, рис — в Японии и т.

д.

принципе любой источник гексозанов может быть использован

в качестве сырья для получения этилового спирта, например,

целлюлоза в древесине хвойных, соломе, торфе и пр. Поэтому

сульфитные щелока

—

отходы целлюлозно-бумажной промышлен-

ности нашли широкое применение в производстве этилового спир-

та.

Ниже представлена технологическая схема получения этанола,

из которой видно, что первым делом необходимо трансформиро-

вать крахмал в глюкозу, чего добиваются при обработке сырья

395

амилолитическими ферментами. На практике обычно применяют

грибную амилазу (Aspergillus niger, A.oryzae и др.) или пророщен-

ное зерно (солод).

Крахмал

Клейстеризация

ферменты солода (преимущественно ячменного)

или грибов

Осахаренная масса (затор)

1 + дрожжи

Бражка

дистилляция

Этанол

Крахмал для получения этилового спирта может быть различ-

ного происхождения (картофельный, кукурузный, пшеничный,

рисовый). Крахмалистое сырье предварительно дробят (измельча-

ют),

применяя для этого вальцовые, молотковые или другие дро-

билки. Крахмал необходимо клейстеризовать при разваривании.

Например, пшеница и пшеничная крупчатка способны полностью

клейстеризоваться при 68°С в течение 30 мин. Крахмал затем

должен быть гидролизован до низших Сахаров (моноз, биоз),

поскольку более высоко полимеризованные углеводы не сбражи-

ваются дрожжевыми организмами. В качестве гидролизующих

агентов применяют соответствующие ферментные препараты из

нитчатых грибов или солода. Крахмал состоит из амилозы и

амилопектина. Неразветвленная амилоза почти полностью гидро-

лизуется до биозы — мальтозы, тогда как разветвленный амило-

пектин гидролизуется лишь частично — до декстринов, медленно

разлагаемых дрожжами до мальтозы в процессе брожения.

Кроме Сахаров и декстринов в заторах обычно содержатся

аминокислоты, пептиды, макро- и микроэлементы в виде неорга-

нических солей (фосфор — еще и в виде фосфорорганических

соединений).

Сбраживание затора осуществляется с помощью чистых куль-

тур либо периодическим, либо непрерывным способом. Относи-

тельно высокие начальные концентрации Сахаров и декстринов в

заторах неблагоприятны для бактерий — контаминантов из-за

повышенного осмотического давления. Позже, когда осмотическое

давление снижается, образующийся этанол и естественно возра-

стающая или искусственно создаваемая подкислением серной

кислотой) кислотность среды (рН

3,8—4,0)

выступают основными

396

факторами, предотвращающими развитие контаминирующих бак-

терий.

В период брожения поддерживают темпрературу от 30°С до

38°С,

(в зависимости от расы дрожжей).

На сбраживание затора влияют не только вид и раса дрожжей,

температура и рН, но и конструктивные особенности фермента-

ционных аппаратов (система охлаждения/нагрева, способ и интен-

сивность перемешивания). Длительность сбраживания составляет

в среднем от 1,5 до 3 суток.

В бражке накапливается от

1—1,5%

до 6,5—8,5% этанола; его

перегоняют и ректифицируют до 96%. Кроме того, в бражке

содержатся так называемые "сивушные масла" (высококипящая

фракция;— 90°—150°С) и 5—10% альдегидов с эфирами. Сивушные

масла представляют собой смесь изопропилового и н-пропилового,

изобутилового и н-бутилового, изоамиловых (2-метил- и 3-метил-

бутанолы) спиртов. Доля последних двух обычно составляет 50%;

в сивушных маслах находят также Р -фенил- и р-оксифенилэтило-

вые спирты.

Исходя из расчетов по содержанию крахмала на сухое веще-

ство,

различные сорта кукурузы, пшеницы, риса, сорго накапли-

вают в среднем

65—75%

крахмала, из которого можно получить до

45 дкл этанола.

Отходами производства являются барда и диоксид углерода.

Барду испольауют для откорма скота и птиц, диоксид углерода —

в пищевой промышленности, например, в виде "сухого льда".

Этанол можно получать также при сбраживании гидролизатов

древесных и травянистых растений, содержащих целлюлозу. В

таких гидролизатах обычно содержится 2—3,5% редуцирующих

Сахаров (преимущественно — гексозы и, меньше, пентозы, в

большем количестве присутствующие в гидролизатах древесины

лиственных растений).

Применив методы генетической инженерии, удалось включить

в дрожжи Schizosaccharomyces pombe ген, кодирующий биосинтез

фермента ксилозоизомеразы. Этот фермент катализирует реакцию

превращения D-ксилозы в D-ксилулезу. Векторной системой при

этом была "ксилозоизомеразная" плазмида Escherichia coli.

Как известно, D-ксилулоза может включаться в пентозный

цикл, способный переключаться на гликолиз с помощью образую-

щихся ключевых веществ — фруктозо-6-фосфата и 3-фосфОгли-

церинового альдегида (интермедиаты в пентозном цикле). В итоге

удалось добиться прямой конверсии ксилозы в этанол. Следова-

тельно, клетки S.pombe, несущие ген ксилозоизомеразы, стали

397

способными одновременно сбраживать глюкозу и ксилозу в гид-

ролизатах разных пород древесины.

Известны природные виды бактерий, сбраживающие глюкозу

и ксилозу, например, Thermoanaerobacter ethanolicus. Однако не-

обходимо иметь в виду рентабельность бактериальных анаэробных

ферментации гидролизатов растительных отходов — она реальна

лишь в тех случаях, когда концентрация этанола в бражке будет

не ниже 4,5—5%.

Так называемый "гидролизный спирт" после ректификации

содержит до 0,05—0,1% метанола и относительно повышенные

количества альдегидов, органических кислот и эфиров в сравнении

с этанолом — ректификатом из картофеля или зерен.

Отходами целлюлозного производства являются сульфитные

щелока, содержащие около 3% редуцирующих веществ (таблица

42).

Т а б л и ц а 42. Примерный состав сульфитных щелоков

Ингредиенты

Сухие вещества

Редуцирующие вещества в пересчете

на глюкозу

Сбраживаемые углеводы в пересчете

на глюкозу

Метоксильные группы

Зола

Диоксид серы

Оксид кальция

Общая сера

Сульфаты

11,5-12,2

2,0-2,7

1,3-1,9

0,78-0,8

1,2-2,1

0,4-1,4

0,6-1,0

0,9-1,6

0,1

Сахара в сульфитных щелоках, например, из ели, обычно

включают глюкозу

—

около

29%,

галактозу

—

4,2%,

маннозу

—

43%,

пентозы — 17%, уроновые кислоты — 3%, фруктозу — 4%.

Сорта и происхождение древесины, условия сульфитной варки

сказываются на качественных и количественных показателях для

сульфитных щелоков.

398

Из щелоков извлекают прежде всего целлюлозу, после гидро-

лиза которой сбраживание гексоз (глюкозы) осуществляют с по-

мощью специальных рас Saccharomyces cerevisiae. "Сульфитный"

спирт — один из наиболее дешевых, он содержит до 2—8%

метанола, а также другие примеси. Его используют в технических

целях.

Применяя древесину, обычно стремятся совместить получение

этанола и дрожжей, хотя оба этих процесса можно вести по

отдельности. Ниже приведена схема комбинированного использо-

вания целлюлозы.

SO,

Гидро-

лиз

Древесина

пар

^>|

Н^Оз"*

Варка целлюлозы

Сепарирование ^Сульфитный щелок

Целлюлоза 4 Сепарирование

к-пар

Продувание щелока

+ известковое молоко

(аммиачная вода)

* ^ Нейтрализация

Осадок (отход)

Осветленный раствор

Охлаждение

Спиртовое брожение

пар

Дистилляция и ректификация

Этанол,

метанол и пр. < 1

Охлаждение

аэрация >U- питательные соли и

J дрожжи

Флотация, промывание, сепариро-

вание,

высушивание

Кормовые дрожжи

399

Расчетами показано, что при совмещенном производстве

спирта и кормовых дрожжей "выходные" показатели на 1 т

абсолютно сухой древесины выглядят следующим образом:

этанол (абс.) — 175—182 л, метанол — 2 кг, сивушные масла —

0,3 кг, фурфурол (94%-й) — 5,6 кг, диоксид углерода (жидкий)

— 70 кг, дрожжи с остаточной влажностью 10% — 32 кг, лигнин

(абсолютно сухой) — 380 кг, гипс — 225 кг.

На сульфитных щелоках можно получать грибную кормо-

вую массу, используя, например, сапрофитный Paecilomyces

varioti, который утилизирует гексозы, пентозы и ацетат. Подо-

бная технология разработана в Финляндии.

При спиртовом брожении часто используют мелассу —

отход производства свекловичного или тростникового сахара

(патока). Она содержит в среднем 80% сухих веществ и 20%

воды. Примерно от 30—40% до 45—50% сухих веществ состав-

ляет биоза-сахароза, 0,5—2% — раффиноза и до 12—18% —

инвертный сахар (смесь глюкозы и фруктозы), прочие вещества

представлены аминокислотами, бетаином (органическое осно-

вание), некоторыми витаминами группы В, неорганическими

солями, пигментами; рН мелассы находится в диапазоне 7,2—

8,9.

Мелассу применяют одновременно для получения этанола

и кормовых дрожжей (Рис. 128а). Сравнивая "паточные" и

"гидролизные" дрожжи, можно привести следующие данные по

основным ингредиентам клеток (таблица 43).

В паточных дрожжах сравнительно меньше липидов, неко-

торых витаминов (биотина, инозита, пиридоксина, рибофлави-

на),

углеводов, но несколько больше кислоты пантотеновой,

тиамина, холина и зольных элементов; паточные и гидролизные

дрожжи примерно одинаковы по содержанию белков и по

коэффициенту отягощения белка азотом нуклеиновых кислот,

или КОБА-коэффициенту, равному 20% (NH^/NO^. • 100). Для

сравнения можно указать на КОБА-коэффициент для белка

нитчатых грибов — он равен 2—5%, что выгодно отличает его

от белка дрожжей и, тем более, от белка бактерий (КОБА-ко-

эффициент 30%).

400

Т а б л и ц а 43. Химический состав "паточных" (ПД) и "гидролизных" дрожжей

(ГД), %

от сухих веществ

Ингредиенты

Белки

Биотин

Зольные элементы

Инозит

Кислота никотиновая

Кислота пантотеновая

Липиды

Пиридоксин

Рибофлавин

Углеводы

Холин

ПД

46—52

3-КГ

—1,6-10

12—14

0,045—0,35

0,036—0,045

0,009—0,011

0,5—2

7-10^-1,2-10°

0,004—0,007

10—18

0,38—0,75

ГД

43—58

6-Ю"

—2,3-10"

5—11

0,12—0,48

0,04—0,06

0,006—0,01

3—4

1-Ю"

—2-Ю"

0,004—0,013

11—23

0,25—0,45

Одна из схем получения этанола и хлебопекарных дрожжей на

мелассе приведена на рис. 128(6). Перед перегонкой бражки

(позиция 7) хлебопекарные дрожжи сепарируют. Барду в данном

производстве можно использовать для выращивания кормовых

дрожжей.

Ш*

(а)

в!

5 6

Я ГУ

о-

(б)

д|д

^Ш^

Рис. 128. Технологическая схема получения: кормовых дрожжей (а): 1 —

ферментатор, 2

—

сборник, 3, 5

—

сепараторы,

4 —

сборник, 6

—

термонагреватель,

7 —

сушилка,

— упаковка, фасовка; этанола

хлебопекарных дрожжей на мелассе

(б):

1 — рассиропники, 2—4 — аппараты с чистой культурой, 5— стерилизатор, 6

— дрожжегенератор,

—

насос,

8 —

бродильный аппарат, 9 — головной бродильный

аппарат.

401

Дрожжевые организмы, применяемые для получения этанола

из патоки, должны быстро и эффективно сбраживать высокие

концентрации Сахаров (включая рафинозу) и быть устойчивыми к

повышенной температуре (до 35°С).

Чтобы приготовить затор, патоку разбавляют водой до получе-

ния 14—18%-й концентрации Сахаров, подкисляют серной кисло-

той (можно соляной или молочной) до рН

4—5,

при необходимости

добавляют 0,1% аммонийных и 0,01% фосфорных солей, а затем

2—4% по объему. суспензии активных дрожжей Saccharomyces

cerevisiae [в России чаще используют расы V-30 (рис. 129), а также

диплоидные гибриды 67 и 73, полученные в результате соматиче-

ской гибридизации расы Я и пивных дрожжей, образующих

а-галактозидазу].

Брожение ведут при темпе-

ратуре 21—27°С в начале про-

цесса, при 32—33°С — в после-

дующее время. Длительность

брожения зависит от качества

мелассы, в среднем продолжи-

тельность составляет 36—72 ча-

са, содержание этанола в браж-

ке составляет 6—9%.

Бактериальная контамина-

ция заторов, как правило, иск-

лючена благодаря их низким

значениям рН и высокому со-

держанию Сахаров (оба фактора

являются основными, определяющими ингибирование роста бак-

терий).

. Процесс брожения можно осуществлять в различных вариан-

тах — непрерывном, двухстадийном. На рис. 128 показан двухста-

дийный процесс, когда в дрожжегенераторах (позиция 6) среду

аэрируют 3—4 м

/м

«ч при 28—30°С и рН 4,2—4,5; дрожжи

наращивают до 2,5—6,5% на сухие вещества, затем передают в

бродильные аппараты (позиции 8,9), где в анаэробных условиях

протекает спиртовое брожение. Перегонку или дистилляцию спир-

та проводят с целью его отделения от примесей и последующей

ректификации до получения 96% этанола или абсолютного (100%)

спирта.

Спиртовое брожение можно интенсифицировать различными

путями:

402

Рис.

129. Дрожжи Saccharomyces

cerevisiae раса V-30 на мелассной среде,

Х7000.

1) использованием непрерывной ферментации вместо перио-

дической, что повышает продуктивность системы по этанолу более

чем в 2 раза; при этом желательно применение флокулирующих

рас активных дрожжей, осуществление рециркуляции биомассы,

иммобилизации клеток;

2) проведением вакуумной ферментации при разрежении

4265,6—4665,5 Па с целью удаления этанола и снижения его

ингибирующего действия (не забывать при этом о возможной

контаминации);

3) осуществлением флеш-ферментации,' то есть, когда часть

культуральнои жидкости периодически подают в вакуумную ка-

меру для удаления этанола;

4) благодаря селекции этанол-толерантных штаммов микроор-

ганизмов, способных в ходе брожения образовывать сравнительно

высокие концентрации спирта.

В различных странах мира названные пути интенсификации

спиртового брожения уже применяют на практике.

В последние годы реализованы усилия исследователей по не-

прерывному бессепарационному сбраживанию углеводсодержаще-

го сырья с использованием дрожжей, иммобилизованных на по-

верхности раздела фаз "газ-жидкость", то есть на пузырьках газа.

С этой целью используют определенные штаммы дрожжей, напри-

мер,

Candida tropicalis, выращиваемых в анаэробных условиях.

Коэффициент иммобилизации (K

) рассчитывают по формуле

Км,

= где Xi — концентрация в биореакторе абсолютно

сухих дрожжей в г/л, х

— концентрация таких же дрожжей (г/л)

в оттоке. Для различных дрожжевых организмов K

неравнозна-

чен. Для Saccharomyces cerevisiae и

S.uvarum

он равен

0,1;

для

S.vini

— 0,22, для Schizosaccharomyces sp. штамм ЛГС-1 — 0,07; для

С.tropicalis — от 0,62 до 1,0.

Основные условия реализации данного процесса: способность

клеток к флотации, работа ферментатора в режиме газожидкост-

ной эмульсии, осуществление отбора культуральнои жидкости в

зоне,

лишенной подвода энергии на перемешивание.

Приемлемый газо-эмульсионный режим возникает при интен-

сивном барботаже пенящихся субстратов. Для этой цели пригодны

ферментаторы с ярусными турбинными мешалками (рис. 130);

403

Рис.

130.

Ферментатор для не-

прерывного бессепарационного

сбраживания углеводсодержаще-

го сырья дрожжевыми организма-

ми,

иммобилизованными на по-

верхности раздела фаз в системе

"газ-жидкость": 1 — ферметатор,

—

слой пены с адгезированными

клетками, 3

—

зона, лишенная под-

вода энергии на перемешивание,

4 — ложное дно (карман), 5 —

мешалка, 6 — подвод питательной

среды,

7 —

насос,

8 —

компрессор,

9 — газ (подведение), 10 — газ

(отведение).

Описанный способ имеет следующие преимущества: отсутст-

вие диффузионного барьера между клетками и средой культиви-

рования, прочная адгезия клеток, нет необходимости регенериро-

вать носитель, возможность проведения процессов накопления

клеток, их иммобилизации и осуществление основного биотехно-

логического процесса получения спирта на одном и том же обору-

довании.

На примере спиртового брожения показано, что выход этанола

составляет 95% от используемого сахара.

Целенаправленное получение хлебопекарных дрожжей (расы

верхового брожения) реализуют на мелассной среде при аэрации

(рН 4,4—4,5) по так называемому приточному методу, когда среду

подают в биореактор преимущественно непрерывным, умеренно

возрастающим (по объему) потоком. На первом и последнем часе

ферментации аэрация равна 1:1, в период интенсивного размно-

жения дрожжей — 1,5—2 об/об «мин. Клетки при этом проходят

все фазы размножения. Выход прессованных дрожжей составляет

около 38% сухой, биомассы (порядка 150% от использованного

сахара).

Отсепарированные, промытые водой и спрессованные хлебо-

пекарные дрожжи хранят при 4—5°С в рефрижераторах. Требо-

вания к таким дрожжам следующие: влажность не более 75%,

быстрая реактивация в замесах муки, активное сбраживание Са-

харов (высокие подъемная сила и мальтазная активность), солето-

лерантность и устойчивость к примесям в мелассе.

Изготавливают также сухие хлебопекарные дрожжи, высуши-

вая прессованные до влажности

7—10%,

и так называемые "жидкие

дрожжи", представляющие собой полуфабрикат, содержащий хле-

404