Елинов Н.П. Основы биотехнологии

Подождите немного. Документ загружается.

Микроорганизм в виде суспензии определенной плотности

подают из инокулятора(-ов) в промышленный биореактор, или

ферментатор, в котором содержится стерильная жидкая питатель-

ная среда. При этом не должно произойти попадания каких-либо

посторонних микробов в питательную среду вместе с продуцентом

— все соединения системы должны быть герметично закрытыми.

Схема запорно-регулирующих устройств представлена на

рис.

127.

Рис. 127. Запорно-регулирующее устройство

в системе трубопроводов для засева промыш-

ленного ферментатора (2) из инокулятора (1);

3—10 — клапаны, 11 — ловушки конденсата;

АБ — отрезок трубопровода.

Исходя из этой схемы, последовательность операций заключа-

ется в следующем: открывают клапаны 4 и 7 (клапан 3 закрыт) и

стерилизуют участок трубпровода АБ паром под давлением 1,055

кг/см

20 минут; конденсат собирается в ловушках (11); закрывают

клапаны 7, 8, 9, 10 и открывают клапаны 4, 5, 6; ферментатор

охлаждают под давлением очищенного стерильного воздуха, сте-

рильная среда заполняет соединительный трубопровод; повышают

давление в посевном аппарате до 0,7 кг/см

при его снижении в

ферментаторе до 0,14 кг/см

; открывают клапан 3 и посевной

материал переводят в ферментатор, после чего отключают иноку-

лятор и ферментатор от системы подачи пара, закрыв клапаны 3

и 6; открывают клапаны 7 и 8, спускают пар и конденсат при

частично открытых клапанах 4 и 5.

Общий объем ферментатора заполняют инокулированной сре-

дой на 70—80%, 20—30% объема заполняют газами (инертным —

для анаэробов, воздухом — для аэробов).

Аэрация жидкости способствует пенообразованию, снижаю-

щему качество ферментации, поэтому используют пеногашение

либо механическое (установка в верхней части ферментатора

специальной дополнительной мешалки), либо физико-химическое

(использование ПАВ для снижения поверхностного натяжения на

границе раздела фаз "газ-жидкость").

13 т. 8524 385

Длительность ферментации колеблется в пределах от 4—5 до

14 суток и дольше, что зависит от особенностей физиологической

активности биообъектов. Применительно к биосинтезу антибио-

тиков и экзогликанов периодические ферментации проводят обыч-

но в течение 4—5 суток.

9.2.

Выделение конечных продуктов ферментации. В зависи-

мости от целей проведения ферментации конечным продуктом

может быть биомасса клеток или какой-либо внеклеточный мета-

болит. Тогда в первом случае отходом будет жидкая часть культу-

ральной среды, во втором — клетки (см. также главу 8). Культу-

ральная среда представляет собой смесь клеток биообъекта, его

растворимых продуктов метаболизма, нерастворимых компонен-

тов,

выделившихся после автолиза части клеток или вследствие

нарушения клеточных барьеров проницаемости, а также полно-

стью неиспользованных компонентов питательной среды. Исход-

ные характеристики культуральной среды (концентрация клеток

и продуктов метаболизма, вязкость, морфология клеток и клеточ-

ных элементов и др.) накладывают отпечаток на выбор способа

отделения биомассы клеток от жидкой фазы.

В зависимости от целевого продукта используют наиболее

приемлемый подход для его выделения:

Клетки Растворимый метаболит

Седиментация 1. Экстракция

и декантация 2. Сорбция

Фильтрование 3. Осаждение

Центрифугирование 4. Хроматография

Отстаивание 5. Выделение с помощью

Флотация мембран

Приближенная градация нерастворимых веществ и частиц

(включая микробные клетки) по размерам, сказывающаяся на

выборе методов их отделения и разделения, может быть представ-

лена следующим образом:

Крупные частицы — от 0,1 до 1 мм

Мелкие частицы — от 0,01 до 0,1 мм

Инфрамелкие частицы — от 0,001 до 0,01 мм

Высокомолекулярные вещества — от 10 до 1000 нм

(10 "

—10 -

мм)

Низкомолекулярные вещества — от 0,1 до 10 нм

(10 "

—10

мм).

Для отделения крупных и мелких частиц возможно использо-

вание: седиментации, тканевых и волокнистых фильтров, сит и

386

сетчатых фильтров, фракционирование в пене и пузырьках; для

отделения низкомолекулярных нерастворимых веществ—диализа

и электродиализа, ионного обмена, экстракции растворителями,

обратного осмоса.

Некоторые методы применимы к отделению частиц с более

широким диапазоном размеров, например, ультрафильтрация (для

частиц 2—5 групп), ионный обмен (для частиц 3—5 групп), гель-

хроматография (для частиц 2—4 групп), фракционирование в пене

и пузырьках (для частиц 1—4 групп), чем другие методы: ультра-

центрифугирование (длячастиц, в основном,

группы),

экстракция

растворителями (для частиц 4—5 групп), жидкостные и циклонные

сепараторы (для частиц 2—3 групп).

Седиментация происходит в поле гравитационных сил. Ею

пользуются для отделения конгломератов типа "кефирных зерен"

при некоторых видах молочнокислого или смешанного брожений

(молочнокислого и спиртового), а также при биологической обра-

ботке отходов с помощью активного ила.

Микробные клетки легко коагулируют под влиянием полика-

тионов или привносимых извне

полимеров.

Возникающие при этом

хлопья вместе с клетками достаточно легко отделяются седимен-

тацией. Известны легко флокулирующие производственные штам-

мы дрожжей, формирующие осадки.

Декантацию, или слив надосадочной жидкости (декантат, су-

пернатант) можно заменить вакуум-отсасыванием.

Фильтрование малых объемов культуральной жидкости можно

проводить на рамных фильтрах, при больших объемах — на

барабанных вакуум-фильрах. Процесс фильтрации можно суще-

ственно ускорить (в 10—100 раз), если культуральную жидкость

подвергнуть предварительной обработке — тепловой, добавление

флокулянтов (глинозема, кальция хлорида, полиэлектролитов, и т.

д.).

Если биомасса клеток оказывает выраженное сопротивление

фильтрованию, то прибегают к использованию фильтрующего слоя

на подкладке. Осадок микробных клеток относится к разряду

сжимаемых, то есть уплотняющихся, поэтому со временем скоро-

сть фильтрации будет заметно уменьшаться. Чтобы исключить

перепады в скоростях фильтрации, слой клеточной массы (напри-

мер,

мицелия) срезают с помощью ножа.

Центрифугирование— принудительное осаждение частиц (ве-

ществ) за счет скорости возрастания центробежных сил. В микро-

биотехнологии применяют различные типы центрифуг: осадитель-

ные шнековые, непрерывного действия с выгрузкой осадка через

387

сопла, саморазгружающиеся сепараторы и др. С помощью цент-

рифугирования удается отделять из культуральных жидкостей

бактерии, дрожжи, мицелиальные грибы. Однако например, в

случаях высоковязких культуральных жидкостей прибегают к их

предварительному разбавлению водой (иногда — теплой или горя-

чей) во много раз, после чего приступают к центрифугированию

— сепарированию. Это характерно для отделения продуцентов

высоковязких экзополисахаридов, например, некоторых грибных

гликанов типа аубазидана, пуллулана и др.

Отстаивание реализуют в традиционных процессах брожения,

а также в крупномасштабных процессах переработки отходов. Это

как бы продолжение процесса седиментации.

Флотацию (от англ. floatation — всплывание) используют,

например, для концентрирования мйкобактерий туберкулеза из

патологического материала в диагностических^ целях. В микроби-

отехнологии флотацию применяют в производстве белка некото-

рых одноклеточных микроорганизмов, в пивоварении. Пенная

флотация ответственна за образование устойчивой пены на пиве

за счет концентрирования растворенных белков на границе раз-

дела "воздух-жидкость".

Если целевой продукт представляет собой растворимый Мета-

болит или он синтезируется внутри клетки и не секретируется

вовне, то прибегают к другим методам выделения: экстракции,

сорбции, осаждению, хроматографии, выделению с помощью мем-

бран. Экстракцию проводят органическими растворителями из

клеток (твердая фаза), например, антибиотика гризеофульвина

ацетоном, или бензилпенициллина при рН 2,0—3,0 — бутил-аце-

татом из культуральной жидкости после отделения клеток проду-

цента (система "жидкость-жидкость"), или, наконец, экстракция

ферментов (в частности, пуллуланазы) в двуфазных водных систе-

мах, например, глюкана-декстрана и несовместимого с ним поли-

этиленгликоля (ПЭГ-6000).

Сорбция — это поглощение каким-либо телом газов, паров или

растворенных веществ из окружающей среды. Различают адсо-

рбцию, когда в сорбции принимает участие поверхность твердого

тела; абсорбцию — поглощение вещества всем объемом

жидкости поглотителя; хемосорбцию — поглощение газа,

при котором имеет место химическое взаимодействие между

поглотителем и

газом;

десорбция

—

процесс обратный сорбции,

то есть это выделение вещества, поглощенного твердым телом или

жидкостью. Из адсорбентов наиболее известны активированный

388

древесный уголь, кизельгур, силикагель, целлюлоза. Все адсорбен-

ты должны обладать большой удельной поверхностью. Так, 1 г

активированного угля имеет поверхность от 600 до 1700 м

, благо-

даря чему он обладает высокой поглотительной способностью.

Как осветлители адсорбенты широко применяют в микробио-

технологии.

Хорошо известна ионообменная сорбция, используемая, в ча-

стности, при выделении аминогликозидного антибиотика стрепто-

мицина на катионообменной смоле, содержащей карбоксильные

группы:

стрептомицин

п+

+п (смола)"Н

<=> п (смола)" стрептомицин

п+

+ Н

. Стрептомицин элюируют (десорбируют) подкисленной во-

дой, смола при этом регенерируется.

В ряде случаев ионообменники можно добавлять непосредст-

венно в культуральную жидкость для избирательной сорбции

несущего заряд действующего вещества.

Осаждение широко используют в микробиотехнологии при

получении белков (например, ферментов), полисахаридов, ряда

антибиотиков и других

веществ.

Белки выделяют при высаливании,

изменении рН до изоэлектрической точки, снижении диэлектри-

ческой проницаемости раствора, снижений степени сальватации

белковых молекул, и другими процедурами.

Наиболее часто используют метод высаливания белков концен-

трированными растворами солей. Еще в конце XIX в. было уста-

новлено, что различные ионы можно расположить по уменьшению

тп4+ м

т^

г> 2+ „ 2+ „ 2+

, 2+ + И-

катионы: Th , Al , H, Ba , Sr , Ca ,Mg ,Cs , Rb ,

NHt К+ Na

, Li+

анионыГООС - CH

-C(OH) - CH

-COO 7

СОО

-OOC-CH(OH)-CC^~F_,IOj, H2P0

, СН

СООТ

Вг^СГСО^ Вг~ N0

,C10

, I , CNS .

высаливающей активности в виде лиотропных рядов, или рядов

Гофмейстера:

Несмотря на то, что аммония сульфат наиболее часто приме-

няют в качестве высаливающего агента, его с успехом можно

заменить другими солями.

Высоковязкие экзополисахариды (аубазидан, декстран, ксан-

тан,

пуллулан и др.) выделяют осаждением этанолом или ацетоном,

то есть смешивающимися с водой органическими растворителями.

389

Альгинаты

—

полианионные биополимерные углеводы осаждаются

раствором кальция хлорида в виде геля.

Некоторые осадители образуют с растворенным действующим

веществом нерастворимые соли, выпадающие в осадок в присут-

ствии органического растворителя:

стрептомицин +H

+ органический растворитель —>

—» -I сульфат стрептомицина

Хроматографическое разделение БАБ используют в различных

вариантах: гель-фильтрация, или гель-проникающая хроматогра-

фия — хроматография на молекулярных ситах, ионообменная

хроматография.

Гель-фильтрацию успешно применяют для разделения смеси

веществ, различающихся по молекулярным

массам.

Это могут быть

различные метаболиты микроорганизмов, в том числе — полидис-

персные белки и полисахариды. Причем небольшие по размеру

молекулы разделяемых веществ способны проникать в гель-насад-

ку, и поэтому они движутся в хроматографической колонне более

медленно, тогда как большие молекулы не проникают в частицы

геля и движутся быстрее — они выходят из колонны в первую

очередь.

При ионообменной хроматографии ионообменная смола пред-

ставляет собой неподвижный слой, тогда как, например, раствор

смеси белков является подвижным слоем. Так, белки в катионной

форме связываются с катионобменной карбоксиметилцеллюлозой

(КМЦ), несущей отрицательные заряды на целлюлозной матрице.

Последующую элюцию белков проводят с помощью буферных

растворов возрастающей ионной

силы.

Первыми элюируют белки,

более слабо связанные с КМЦ.

Подобный процесс проводят и на анионобменниках. Наиболее

часто применяемым анионитом является диэтиламиноэтилцеллю-

лоза.

В случае афинной хроматографии используют высокую специ-

фичность таких природных веществ, как ферменты, антитела и

лектины. Ферменты образуют комплексы с ингибиторами, анти-

тела — с соответствующими антигенами (иммуносорбционная

хроматография), лектины — со специальными рецепторами кле-

точных стенок.

Метод выделения различных веществ или клеток с помощью

мембран все шире внедряется в биотехнологию. Диаметр молекул

или частиц является определяющим фактором в выборе обратного

осмоса или ультрафильтрации. Для примера можно привести

390

приближенные размеры (диаметр) некоторых молекул и клеток в

мкм:

вода (ММ 18 Да) — 0,0002, органические кислоты с ММ от 100

до 500 Да — 0,0004—0,0008, монозы и биозы с ММ от 180 до 400

Да — 0,0008—0,001, некоторые антибиотики с ММ от 300 до 100

Да — 0,0006—0,0012, протеины и гликаны с ММ от 10000 до

млн.

Да

—

0,002—0,01,

клетки ряда бактерий

—

0,3—

клетки некоторых

дрожжей и мицелиалъных грибов — 1—10.

Явление уравновешивания химических потенциалов какого-ли-

бо вещества в растворе и в чистом растворителе, разделенных

непроницаемой для вещества мембраной, называют осмосом.

Избыточное давление, приложенное к раствору и превышаю-

щее его осмотическое давление, побуждает перенос растворителя

против градиента концентрации (из разбавленного раствора в

чистый растворитель). При этом происходит возрастание концен-

трации растворенного вещества, то есть имеет место обрат-

ный осмос.

ряду с осмотическими процессами находится диализ, когда

происходит непрерывная диффузия малых молекул в циркулиру-

ющий растворитель с удерживанием больших молекул. При этом

отсутствует выраженный перенос растворителя против градиента

концентрации. Диализ применяют, например, при очистке анти-

генных препаратов, представляющих собой протеины, гликопро-

теины или более сложные комплексы. С помощью диализа через

раличные мембраны освобождаются от неорганических солей.

Ультрафильтрация (см.) применима для концентрирования и

очистки молекул

диаметром от

до

100

нм (отдельных ферментов)

от низкомолекулярных примесей. Растворитель при этом частично

удаляется.

На практике нередко используют комбинацию методов для

разделения клеток и молекул биологически активных веществ.

Процесс ферментации можно оценивать по различным пока-

зателям, используя для этого соответствующие расчетные форму-

лы:

1) продуктивность по биомассе (Q

г/л«ч):

а) для периодического процесса Q

——-^

б) для непрерывного процесса О

= DX, где Хо — концент-

рация биомассы (г/л) на период времени

(ч), X

— концентрация

биомассы (г/л) на период времени

(ч), D — коэффициент разбав-

ления или скорости протока, (1/ч), равный удельной скорости (ц)

391

для непрерывного процесса; D можно нарушить, если изменить

скорость протока среды или концентрацию субстрата в ней;

2) удельная скорость роста (1/ч):

*,(*,-

to)

3) концентрация биомассы:

Хов

ц (

''~

для log-фазы размножения е=2,718;

4) продуктивность по целевому продукту (О

, г/л

•

ч):

Р —

а) для периодического процесса: О

= —

ц—

б) для непрерывного процесса: Q

=DP, где Р — концентра-

ция продукта (г/л

•

ч);

5) удельная скорость образования целевого продукта (q

) в

г/г« ч:

Pi-Po

Яр

X^U-to)

6) удельная скорость потребления субстрата (q

, г/г'ч):

s =

~v~7*—7\

гл

^ — концентрация субстрата в г/л;

X-\(U—

)

7) выход биомассы из субстрата, или экономический коэффи-

циент (Y

x/S

) в г/г:

v - И

"*" *.~ 5

-S, '

8) выход целевого продукта (Ye/

) в г/г:

v ?Р Л" fl>

рЛ

~ q

~ So-Sr

9.3.

МИКРОБИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ

9.3.1.

Получение продуктов брожения. Брожение — это одна

из разновидностей биологического окисления субстрата у гетерот-

рофных микробов в целях получения энергии, когда акцептором

электронов или атомов водорода является органическое вещество.

Биотехнологические бродильные процессы изучены давно в срав-

нении, например, с биотехнологией антибиотиков, аминокислот и

других продуктов. Однако некоторые брожения реализованы на

практике относительно недавно, например, брожения с участием

Zymomonas spp.

В основе многих бродильных процессов лежит универсальная

реакция превращения глюкозы (источник углерода) в ключевой

392

промежуточный продукт (интермедиат) — пировиноградную кис-

лоту, или пируват, из которого синтезируются различные конечные

продукты.

По

метаболиту, образующемуся

наибольшем количе-

стве,

называют соответствующее брожение: спиртовое, масляно-

кислое, молочнокислое,

и т. д.

сн

сосн

ацетон

9Ь.

-Ац

соон

уксусная

киеяота.

КоА

Щ-

СН

<СН

)

ОН

бутаноп

СН

ОН

этанол

СН

СНО

У^ |

зСОСООН

сн

соон

СН

СООН

пропюноип

9.3.1.1.

Спиртовое брожение.

Оно

лежит

основе получения

этилового спирта, кормовых

пищевых дрожжей, пивоварения

виноделия. Возбудителями спиртового брожения могут быть дрож-

жи — сахаромицеты, некоторые мицелиальные грибы (Aspergillus

oryzae) и бактерии (Erwinia amylovora, Sarcina ventricula, Zymomonas

mobilis,

anaerobia). Среди названных организмов дрожжи зани-

мают ведущее место,

получение

с их

помощью этанола относят

к разряду наикрупнейших

мире. Этанол используют в различных

отраслях народного хозяйства:

то как

растворитель,

то как

сырье

для химического синтеза, широко используют

медицине,

и т. д.

Специальные штаммы Saccharomyces cerevisiae рекомендованы

как биообъекты

производстве этанола

(на

африканском конти-

нете чаще применяют Schizosaccharomyces pombe

S. octosporus).

Штаммы подразделяют

свою очередь

на

расы верхового

низового брожений,

а по

способности

флокуляции —

на

хлопь-

евидные

пылевидные. Расами верхового брожения являются

спиртовые, хлебопекарные

некоторые пивные дрожжи, расами

низового брожения

—

большинство винных

пивных дрожжей.

Клетки обеих

рас

могут быть подвержены флокуляции.

При

этом

следует помнить,

что

пылевидные дрожжи находятся

дисперги-

рованном состоянии

течение бродильного процесса.

Они

менее

стойки

автолизу,

но

более полно сбраживают сусло; хлопьевид-

ные — оседают

на

дно или всплывают

на

поверхность,

они

более

выраженные ароматизаторы.

393

Особенности некоторых продуцентов этанола приведены в

таблице 41.

В отличие от S. cerevisiae аэротолерантные бактерии Z. mobilis

меньше чувствительны к этанолу, у них отсутствует катаболитная

репрессия, а удельная скорость потребления глюкозы и образова-

ния этанола в 2—3 раза выше (qC

OH= 1,87 г/г*ч). Катаболизм

глюкозы протекает по Энтнеру-Дудорову. Однако скорость раз-

множения этой бактерии низка и продуктивность по спирту не

столь высока. Здесь остается резерв надежд на позитивные резуль-

таты генетико-селекционной работы с продуцентом.

Значительный интерес представляет S. rosei. Эти дрожжи спо-

собны образовывать этанол при использовании топинамбура (зем-

ляная груша), в котором из углеводов содержится преимуществен-

но инулин, сбраживаемый после гидролиза до этанола. Топинамбур

хорошо растет даже в северных регионах (Архангельская, Ленин-

градская и другие области) на бедных супесчаных почвах.

Таблица41.

Характеристика микроорганизмов — продуцентов этанола

Микроорганизм

Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces rosei

Kluyveromyces marxianus

Pachysolen tannophilus

Zymomonas mobilis

Zymomonas anaerobia

Оптимальные

параметры

культивирования

3-4

4,6

4,4

4,2

5,5

5,6

t°,

°С

Выход

этанола,

%от

макси-

маль-

ного

100

40-60

90-95

Макси-

маль-

ная

кон-

цент-

рация

этанола,

г/л

130

42,5

130

Примечание

Не использует

пентозы

Конвертирует

инсулин

в этанол

—"—

Растет

в смешанной

культуре.

Использует

ксилозу

Аэротолерантен

Термоустойчив

394