Елинов Н.П. Основы биотехнологии

Подождите немного. Документ загружается.

бопекарные дрожжи, выращенные на осахаренной мучной завар-

ке,

которая предварительно была заквашена молочнокислыми

бактериями — Lactobacillus delbrueckii.

Спиртовое брожение находится также в основе пивоварения.

Пиво относят к так называемым солодовым слабо алкогольным

напиткам, получаемым в результате сбраживания дрожжами экс-

трактов из проросших семян хлебных злаков (солода). В подобных

экстрактах содержатся сбраживаемые углеводы.

В различных сортах пива находятся этанол, углеводы (глюкоза,

мальтоза, мальтотриаоза, мальтотетраоза, декстрины), азотистые

вещества (амиды, аминокислоты, пептоны), диоксид углерода '—

продукты ферментативного гидролиза осоложенного зерна; горе-

чи,

смолы, танин, эфирные масла — из соцветий женских особей

хмеля, следы неорганических солей и жира. Окраска, аромат и

крепость пива в значительной степени зависят от штамма дрожжей

(Saccharomyces cerevisiae, S. carlsbergensis и

др.).

России наиболее

широко используют S. cerevisiae низового брожения, расы 776, 41,

44,

11, 8а(М),

PHF.

На практике чаще всего применяют ячменный солод. Для его

приготовления отсортированные зерна ячменя увлажняют, прора-

щивают при 15—25°С до тех пор, пока зародышевый листок

становится в 3—4 раза длиннее зерна, затем проросший ячмень

высушивают до конечной влажности солода

5%.

таком виде солод

может хорошо сохраняться, при этом он имеет специфические

окраску и аромат. Солод светлого цвета получается при более

низкой температуре высушивания, более темного цвета — при

повышенной температуре (светлые сорта пива содержат меньше

углеводов, чем темные сорта). Отделенный от проростков сухой

солод может быть использован не только в пивоварении, но и в

винокурении (получении спирта), в кондитерском производстве.

Если пиво изготавливают из солода, хмеля и воды (без каких-

либо "дополнителей"), то следующим этапом является затирание,

когда стремятся перевести в раствор наибольшую часть содержи-

мого солода. Затирание чаще осуществляют либо настаиванием,

либо вывариванием. По первому методу солод дробят, размешива-

ют в воде при температуре 38—50°С (выдерживают 1 час), когда

активизируются протеазы, затем температуру повышают до 65—

70°С и оставляют затор на несколько минут для гидролиза крахмала.

После этого температуру повышают до 75—77°С для денатурации

ферментов и затор фильтруют.

405

По второму методу (вываривание) размолотый солод вносят в

теплую (40°С) воду, размешивают и постепенно повышают темпе-

ратуру затора до 75°С; около 1/3 такого затора отбирают и непро-

должительно кипятят, после чего его возвращают в основной затор.

При этом ферменты разрушаются, клеточные стенки набухают,

крахмал "распускается" (разжижается), чем облегчается его гидро-

лиз в основном заторе. Кипячение и возврат части затора можно

повторять 2—3 раза.

Пиво, полученное на настоенном заторе, более ароматное,

поскольку в него переходит меньше горьких веществ.

Последующие этапы технологического процесса пивоварения

заключаются в следующем:

Дробина <-

(отход)

Затор

фильтрация

Осадок <-

(альбумины,

Хмелевы смолы,

неорганические

соли)

Осадок <-

(клетки дрожжей,

нерастворимые

фосфаты)

-> Сусло неохмеленное

кипячение

+ хмель

— Фильтрация

охлаждение

Сусло охмеленное

I + дрожжи

Сусло сброженное

(пиво неосветленное)

выдержка в лагер-

ных емкостях в

течение нескольких

недель

. Пиво осветленное

фильтрация

Пиво на розлив

(пастеризация)

Пивные дрожжи относят к разряду флокулирующих, оседаю-

щих при осветлении молодого пива и в конце дображивания; они

не сбраживают декстрины (эти полимерные углеводы вносят оп-

ределенный вклад в создание вкуса пива). Отсепарированные

пивные дрожжи иногда рекомендуют в качестве лекарственного

средства.

В последние годы удалось перенести ген Bac.subtilis, детерми-

нирующий Э-глюканазу в пивные дрожжи S.cerevisiae. Этот реком-

406

бинантныи штамм оказался способным перерабатывать крахмал

непосредственно в этанол (исключается стадия солодования ячме-

ня).

В этом направлении также перспективно использование бро-

дильных штаммов дрожжей S.cerevisiae, несущих киллер-плазми-

ды,

благодаря которым они могут быть устойчивы к "диким"

дрожжам.

Из алкогольных напитков можно упомянуть русский хлебный

квас,

содержащий менее 0,5% этанола, популярный в Японии

алкогольный продукт Саке

(12—24%

этанола), таэте

—

алкогольный

напиток, приготовляемый из молока и с давних пор применяемый

в Скандинавских странах — содержит менее

этанола, и другие.

Спиртовое брожение находится также в основе виноделия.

Вина обычно получают из сока спелого неиспорченного винограда,

отделенного или неотделенного от мезги (например, при изготов-

лении красных вин). Индукторами брожения являются различные ,

расы Saccharomyces cerevisiae.

винах, кроме этанола, содержатся:

белки, пигменты, неорганические соли, летучие и нелетучие орга-

нические кислоты, танин, в некоторых сортах — углеводы, глице-

рин.

Изготовление вин отрабатывалось веками, поэтому в техноло-

гии каждого сорта существуют особые подходы, хотя принципи-

альные стадии укладываются в следующую схему:

Отстой <—

(дрожжи)

Виноградный сок, или сусло

+ дрожжи (температура брожения

21-32,2°С)

Молодое вино

слив

Осадок <

[КС

(винный

камень), дрожжи]

Дображивание 7-11 дней,

t°=21,1-29,4°C

переливание

Хранение и созревание

в деревянных герметичных сборниках

осветление (при необходимости

- крепление виноградным спиртом),

охлаждение

Готовое вино, розлив

407

Вина классифицируют по-разному. Так различают: сортовые

— по сорту винограда, купажные — из смеси сортов; сладкие и

сухие — по содержанию сахара; натуральные и крепленые, столо-

вые и десертные

—

по содержанию спирта; игристые и неигристые

— по содержанию углекислоты; белые и красные — по цвету;

ординарные и марочные — по срокам выдержки.

Как пояснение к классификации можно отметить, что в сухом

вине сахар фактически полностью сброжен, а если он имеется, то

в таком количестве, что не ощущается на вкус. В сладких винах

сахар выраженно ощущается на

вкус.

Натуральные вина содержат,

как правило,

9—11%

этанола, реже —

13%.

крепленые сухие вина

добавляют коньяк или винный спирт. Столовые вина содержат

менее 14% спирта, десертные — более 14% (в среднем около 20%)

и некоторое количество сахара. Игристые вина содержат значи-

тельное количество диоксида углерода, образующегося при добра-

живании вина в толстостенных сосудах или добавляемого к нату-

ральным винам; к игристым относят шампанское — продукт

вторичного брожения вина, когда к недобродившему вину перед

розливом в герметизированные бутылки добавляют ликер до со-

держания сахара

2,2%.

России разработана технология производ-

ства шампанского непрерывным методом. В шампанском содер-

жится не только повышенное количество углекислоты, но и ряд

ценных метаболитов, сказывающихся на специфическом вкусе

этого вина.

Вина, выпускаемые в продажу на первом году после изготов-

ления, называют ординарными, а выдержанные не менее 1,5 лет и

сохраняющие свои высокие качества — марочными.

Известны так называемые плодовые вина (кроме виноградных),

получаемых при спиртовом брожении соков зрелых плодов: ягод-

ное,

яблочное и др.

На виноградных ягодах поселяются различные микроорганиз-

мы (дрожжи, нитчатые грибы, бактерии), которые необходимо

подавить, так как в противном случае будет трудно гарантировать

получение вина высокого качества. Как ингибитор микробов —

контаминантов давно и эффективно используют сернистый газ или

сульфит, например, в виде метабисульфита калия (примерно от 0,1

до 0,2% S0

), не подавляющих производственный штамм дрожжей

в его активную фазу. Пастеризация здесь оказывается менее

благоприятной.

Концентрация сахара в винограде — важный фактор для

ферментации (концентрация его в сусле выше

28%

будет тормозить

408

брожение). Определенную роль играют исходное значение рН и

температура. Чтобы избежать повышенной кислотности готового

вина, было предложено устанавливать рН сусла ниже 3,6; опти-

мальная температура для большинства рас дрожжей 27—29°С, но

есть и психрофильные виды, сбраживающие виноградное сусло

при 10°С. При низкой температуре и медленном брожении фор-

мируется более яркий букет вина, чем при кратковременном

брожении и повышенной температуре.

Аэрирование сусла возможно и целесообразно в самом начале

процесса, чтобы быстрее наросла биомасса клеток для ведения

последующего анаэробного процесса. Количество привносимой в

сусло суспензии дрожжей обычно составлет 1% по объему.

В случае применения биореакторов больших емкостей для

производства столовых вин бродящий сок принудительно охлаж-

дают, используя теплообменники, змеевики или другие устройства.

Мезга (оболочки виноградных ягод, семена, частички стеблей

т.

п.) привносит определенные сложности в связи

теплообменом

при брожений — образование "шапки".

Очистка вин при естественном хранении и созревании не

всегда завершается его полным осветлением. В этих случаях при-

бегаются к очистке путем осветления, старения и созревания до

розлива в бутылки. Дополнением к осветлению являются фильт-

рация (в том числе — стерилизующая), пастеризация, охлаждение

— для удаления винного камня и коллоидов.

9.3.1.2.

Ацетонобутиловое брожение. Ранее упоминаемые угле-

водные источники (крахмал, патока, гидролизаты целлюлозы раз-

личного происхождения и др.), применяемые для дрожжей при

спиртовом брожении, могут быть использованы при ацетонобути-

ловом брожении, протекающем в анаэробных условиях в процессе

жизнедеятельности спорообразующих бактерий — Clostridium

acetobutylicum. В результате образуются такие нейтральные про-

дукты, как ацетон и бутанол, а также уксусная и масляные кислоты,

диоксид углерода, водород. Нейтральные продукты представляют

большой интерес для промышленного органического синтеза (эфи-

ров для лакокрасочной промышленности), как экстрагенты и рас-

творители, и т. д. Несмотря на то, что синтетические и биотехно-

логические процессы получения ацетона и бутанола являются

конкурирующими, на практике реализуют оба вида производств,

так как все зависит, главным образом, от стоимости сырья (эконо-

мические проблемы). Очевидно "сосущестнование" синтетических

409

и биологических технологий получения одних и тех же продуктов

оправдано временем и жизнью общества.

Биосинтез ацетона и бутанола (в ФДФ-пути по Эмбдену-Мей-

ергофу-Парнасу) существенно зависит от рН сред — при низких

значениях активируются ферменты, участвующие в трансформа-

ции ацето-АцКоА в ацетон и, соответственно, больше расходуется

НАД

•

Н для восстановления бутирил-КоА в бутанол. Уксусная и

масляная кислоты выступают здесь в роли минорных компонентов,

причем, первая из них может подвергаться конденсации до бути-

рата, который, в свою очередь, через бутирил-КоА превращается

в бутанол (в незначительном количестве может образовываться

этанол). Таким образом, бутанол и ацетон являются основными

продуктами ацетонобутилового брожения.

—•-CHjCOCOOH

»-А*>А

—*

Адоде»

СН

С0ОН

jKjaunum

*>Адегащив

»CHjC0CH

Известно, что первичные алифатические спирты обладают

антимикробным действием, поэтому в питательных средах концен-

трация сбраживаемых углеводов не должна превышать

6%,

так как

CI.

acetobutylicum не будет их утилизировать, если концентрация

бутанола приближается к ингибирующей — 1,5%.

Сырьем для производства целевых продуктов обычно является

меласса или сульфитные щелока, смешиваемые с кукурузным и

ржаным мучным затором. Инокулят готовят из свежих спор (тем-

пература выращивания 37°С), активных по образованию бутанола,

на такой же среде. Основные ферментации проводят в периоди-

ческом, полунепрерывном и непрерывном режимах. Исходное

значение рН среды примерно

6,0.

Уже через

часов рН снижается

до 4,1—4,2 и на этом уровне остается до конца ферментации.

После окончания процесса сепарируют ацетонобутиловую бар-

ду, а дистиллят упаривают, примерно наполовину и ацетон отде-

ляют от этанола и бутанола перегонкой при различных темпера-

410

турах — ацетон кипит при 56,2°С, этанол — при 78,4°С, азеотроп

бутанола с водой — при 93,4°С, чистый бутанол — при 117,7°С.

Отходами производства являются газообразные водород и ди-

оксид углерода (порядка

30 м

на

100

кг сахарозы, из которых около

70%

составляет С0

) и плотная ацетонобутиловая барда. Газы

можно улавливать и применять для синтеза аммиака и метанола,

или применять как

таковые.

Барда—ценный продукт, содержащий

заметные количества рибофлавина; сухие вещества (преимущест-

венно — азотистые) в ней составляют

3—5%.

Ранее барду самосто-

ятельно использовали в высушенном виде для кормления скота, в

настоящее время ее применяют для выращивания кормовых дрож-

жей.

9.3.2. Получение органических кислот. Прежде чем рассмот-

реть конкретные биотехнологические процессы получения орга-

нических кислот, необходимо оговориться, что под рубрику "бро-

жения" должно быть отнесено образование в анаэробных условиях

только молочной и пропионовой кислот с помощью соответствую-

щих бактерий, тогда как биосинтез лимонной, глюконовой, итако-

новой и некоторых других органических кислот определенными

микромицетами представляет собой разновидность того или иного

окислительного (аэробного) процесса и поэтому отнесение их к

брожениям является условным.

9.3.2.1.

Бродильные процессы получения органических кислот.

Получение молочной кислоты. Образование молочной кислоты

(СН

СНОНСООН) лактобактриями происходит в естественных

условиях при скисании молока и молочных продуктов, а также при

ее целенаправленном получении в производственных условиях.

Молочнокислые бактерии относят к 4 родам: Lactobacillus,

Leuconostoc, Streptococcus и Pedicoccus. Род Lactobacillus включает

3 подрода — Thermobacterium, Streptobacterium и Betabacterium.

Представители первого из них не растут при 15°С, но могут

выдерживать температуры выше 50°С. Стрептобактерии не явля-

ются термофилами. Бетабактерии образуют DL-молочную кислоту

из глюкозы. Одни из них (термобактерии, стрептобактерии, стреп-

тококки и педикокки) являются гомоферментативными, образую-

щими при сбраживании гексоз преимущественно молочную кис-

лоту, другие (бетабактерии и лейконостоки) — гетерофермента-

тивными, образующими молочную и уксусную кислоты, диоксид

углерода, возможно — этанол; молочнокислые бактерии могут

использовать мальтозу, глюкозу, лактозу, осахаренныи крахмал и

пр.

В целом, лактобактерии — требовательны к питательным

411

средам — многие из них нуждаются в ряде витаминов из группы

В,

некоторых аминокислотах, пуринах и пиримидинах, отдельных

органических кислотах алифатического ряда (уксусной, лимонной,

олеиновой). Для сбраживания глюкозы и гидролизатов крахмала

на практике применяют обычно Lactobacillus delbrueckii, L.

bulgaricus, L. leichmanii (одни или в смеси между собой или со

Streptococcus

lactis),

для сбраживания мальтозы иногда используют

L. casei.

В промышленном производстве молочной кислоты обычно

используют термофильные гомоферментативные виды, активно

синтезирующие целевой продукт, например, при 50°С. Таким

видом яляется L. delbrueckii штамм

Л-3,

отличающийся высокими

стабильностью

активностью кислотообразования (выход молоч-

ной кислоты составляет

95—98%

от потребленной сахарозы). Этот

вид внедрен в промышленность еще в 1923 г. под руководством

В.

Н. Шапошникова.

Принципиальная технологическая схема получения

+ )-мо-

лочной кислоты состоит в следующем: мелассную среду, содержа-

щую 5—20% сахара, вытяжку солодовых ростков, дрожжевой

экстракт, витамины, аммония фосфат, засевают L. delbrueckii.

Брожение протекает при 49—50°С при исходном рН 6,3—6,5. По

мере образования молочной кислоты ее периодически нейтрали-

зуют мелом. Весь цикл ферментации завершается за 5—10 дней;

при этом в культуральной жидкости содержатся 11—14% лактата

кальция и 0,1—0,5% сахарозы (80—90 г лактата образуются из 100

г сахарозы). Клетки бактерий и мел отделяют фильтрованием

(отход), фильтрат упаривают до концентрации 30%, охлаждают до

25°С и подают на кристаллизацию, которая длится 1,5—2 суток.

Кристаллы лактата кальция обрабатывают серной кислотой при

60—70°С, гипс выпадает в осадок, а к надосадочной жидкости

добавляют желтую кровяную соль при 65°С для удаления ионов

железа, затем натрия сульфат для освобождения от тяжелых

металлов. Красящие вещества удаляют с помощью активирован-

ного угля. После этого раствор молочной кислоты подвергают

вакуум-упариванию (при остаточном давлении 800—920 кПа) до

50%

или 80%. Оставшийся не до конца очищенный раствор молоч-

ной кислоты используют для технических

целей.

Более очищенную

кислоту можно получать при перегонке ее сложных метиловых

эфиров, при экстракции простым изопропиловым эфиром в про-

тивоточных насадочных колоннах.

412

С помощью L. bulgaricus получают молочную кислоту из мо-

лочной сыворотки; гидролизаты пентозанов в кукурузных коче-

рыжках, соломе и других видах пентозного сырья можно исполь-

зовать для сбраживания клетками L. brevis.

конце

80-х

годов разработана технология получения молочной

кислоты с помощью клеток Streptococcus thermophilus, адгезиро-

ванными на микросферах из активированного угля и помещенны-

ми в биореактор, работающий по принципу "кипящего" или псев-

доожиженного слоя, через который перемещаются микросферы.

В нижней части они сорбируют субстрат, в верхней — молочную

кислоту, благодаря чему нет надобности в регуляции рН в процессе

ферментации. Продуктивность системы — 12 г/л«ч'' молочной

кислоты.

Необходимо помнить о том, что молочная кислота является

выраженным коррозирующим агентом. В то же время она быстро

полимеризуется, а большинство ее солей хорошо растворимо в

воде,

благодаря чему молочную кислоту широко используют в

пищевой, текстильной и фармацевтической промышленности, в

изготовлении растворителей и пластификаторов в лаках, олифах

и т. п.

Гомо-

и гетероферментативные молочнокислые бактерии давно

используются в хлебопечении. Их ассоциации с дрожжами, благо-

приятные для создания аромата, вкуса, пористости, окраски и

свежести, называют заквасками.

Ъ России, особенно — в сельской местности, где хлеба выпе-

кают в домашних условиях, закваски поддерживаются длительное

время более или менее стабильными. Это обусловлено антагони-

стическим влиянием лактобактерий на гнилостные, уксуснокислые

и маслянокислые бактерии, энтеробактерии и

др.,

но не на дрожжи,

содержащиеся в заквасках. Тем не менее, специально приготов-

ленные закваски из чистых культур предпочтительнее спонтанных

(не контролируемых) ассоциаций, так как первые предсказуемы в

своем "поведении" и легче управляемы.

Молочнокислое брожение находится в основе силосования

кормов и квашения овощей (капусты, огурцов),

плодов,

ягод (маслин,

яблок) и т. д. Эти процессы протекают за счет естественных

микроорганизмов, находящихся на заквашиваемом объекте. В

последнее время используют специальные закваски, обеспечива-

ющие проведение процессов в прогнозируемых режимах и с

ожидаемыми результатами.

413

Молочнокислыми продуктами являются различные сыры, пол-

учаемые из обезжиренного или цельного молока. Такое молоко

под влиянием лактобактерий и молочной кислоты створаживается

— творог отделяют от сыворотки и засевают специальными мик-

роорганизмами (в соответствии с сортом изготавливаемого сыра)

с последующим выдерживанием его от нескольких недель до 8

месяцев (например, сыр "Чеддер") для созревания.

Створаживание молока проводят также с помощью реннина

—

сычужного фермента из желудка (сычуга) молодых телят, или

реннина микробного происхождения.

Молочнокислые бактерии включают в разные композиции

профилактических и лечебных препаратов: бифидумбактерин, би-

фикол, колибактерин, лактобактерин. Первый из них состоит из

живых высушенных бифидобактерии определенного штамма, вто-

рой — из живых бифидобактерии (штамм 1) и кишечной палочки

(штамм М-17), третий содержит живые кишечные палочки штамма

М-17,

четвертый представляет собой сочетание лиофильно высу-

шенных лактобацилл (L.fermenti и L.plantarum).

За рубежом изготавливают так называемый пробиотик "Фер-

лак-5",

содержащий молочнокислые бактерии с добавками вита-

минов

Е.

Его смешивают с кормом из расчета

млн. клеток

бактерий на 1 г корма. Этот пробиотик рекомендуют поросятам,

телятам и птицам.

Получение пропионовой кислоты. Пропионовокислое броже-

ние характерно для пропионовых бактерий, культивируемых в

средах, где глюкоза является источником углерода. Из трех молекул

глюкозы образуется

молекулы пропионовой кислоты,

молекулы

уксусной кислоты, 2 молекулы диоксида углерода и 2 молекулы

воды:

ЗС

-> 4СН

СН

СООН + 2СН

СООН + 2СО

+ 2Н

Фактически механизм образования пропионовой кислоты значи-

тельно сложнее; ключевыми интермедиатами здесь являются пи-

руват, метил-малонил-КоА, пропионил-КоА, сукцинил-КоА, окса-

лоацетат.

Пропионовые бактерии представляют собой грамположитель-

ные,

бесспоровые, неподвижные палочки, подразделямые на "кож-

ные"

(P.acnes, P.avidum, P.granulosum) и "классические"

(P.freudenreichii, P.thoenii, P.jensenii, P.acidipropionici) в едином

семействе Propiombacteriacae. "Кожные" обитают на кожных по-

кровах человека и в желудке жвачных животных — они могут

414