Елинов Н.П. Основы биотехнологии

Подождите немного. Документ загружается.

быть причиной определенных патологических процессов (опти-

мальная температура для их роста 37°С); "классические" прЪпио-

новые бактерии обитают, как правило, в молоке и молочных

продуктах. Температурный оптимум для них 37°С, анаэробы, но

образуют каталазу, пероксидазу и супероксиддисмутазу (СОД),

фиксируют С0

, некоторые виды фиксируют молекулярный азот,

утилизируют элементарную серу, нуждаются в витаминах группы

В — биотине, пантотенате и тиамине.

При контакте с 0

у пропионовых бактерий образуются супер-

оксидные радикалы, превращающиеся благодаря СОД в пероксид

водорода, а этот последний разлагается под действием каталазы и

пероксидазы.

Перспективными для производства пропионовой кислоты ока-

зались виды P.freudenreichii и P.acidipropionici, а для получения

витамина В

— P.freudenreichii и Р.аспе.

Биосинтез кислоты проводят на достаточно простых средах,

например, такого состава (в

%):

углевод — 1—2; аммония сульфат

—

0,3;

гидрофосфат калия —

0,2;

кобальта хлорид

—

0,0001;

б'иотин

— 0,00001; пантотенат — 0,1; тиамин — 0,01.

Заметный прогресс наблюдается в совершенствовании процес-

сов биосинтеза пропионовой кислоты иммобилизованными клет-

ками в фиксированном слое, например, в ПЛАТ в колоннах. Так,

в случае с P.acidipropionici при

= 0,05 ч'

удается получать до 15

г/л целевого продукта.

Биосинтетическая пропионовая кислота может конкурировать

с пропионатом "нефтяного происхождения", особенно в случае ее

применения в пищевой и фармацевтической промышленности в

качестве консерванта.

Конечные продукты ферментации (пропионат и ацетат) можно

не разделять, поскольку обе кислоты обладают консервирующими

свойствами. Клетки, отсепарированные от культуральной жидко-

сти,

могут быть экстрагированы соответствующими растворителя-

ми в целях извлечения СОД, каталазы, пероксидазы и витамина

высушенный экстракт в виде порошка используют в пищевой

промышленности как антиоксидант и витаминизированный пре-

парат.

9.3.2.2.0кислительные процессы. Получение уксуса. Известны

различные виды и подвиды уксуснокислых бактерий, включенных

в роды Acetobacter и Gluconobacter. Форма их непостоянна (пол-

иморфизм)

—

от эллиптических до палочковидных, молодые клетки

не окрашиваются по Граму (грамотрицательны). Одни из них

415

подвижны — имеют жгутики, другие неподвижны. Ацетобактерии

окисляют этанол в уксусную кислоту по схеме:

ОН + 1/20

-> СНзСОН + Н

СН

СОН + 1/20

—» СНзСООН

Некоторые штаммы могут содержать порфирины (биомасса

клеток приобретает розовую окраску) или продуцируют водораст-

воримый коричневый пигмент. Большинство анетобактерии обхо-

дится без витаминов в питательных средах.

естественных услових

их находят на овощах, фруктах и скисших фруктовых соках, в

уксусе и в некоторых слабоалкогольных налитках. Типовой вид

—Acetobacter aceti.

Уксус (4—9%-й) непосредственно используют как приправу к

различным блюдам, а также при изготовлении майонеза, горчицы,

маринадов, соусов, хрена. Поэтому уксус, ранее получаемый из

сахарных и фруктовых сиропов, вин, ягод и других аналогичных

продуктов, предварительно сбраживаемых дрожжами до этанола,

отличается высокими вкусовыми качествами. Однако в настоящее

время основное количество уксусной кислоты получают синтезом

ее из ацетилена:

CHSCH + нон—^ сносной—>сн

сон±^^сн

соон

или выделением из продуктов сухой перегонки древесины (свя-

зывание известью с последующим разложением серной кислотой

до уксусной кислоты и гипса); полученная таким способом кислота

называется "ледяной" (77—80%-й концентрации). Разбавляя "ледя-

ную"

уксусную кислоту, в 10—20 раз, можно получить близкий к

столовому уксус. Качество уксуса не изменяется и в случае при-

готовления его из чистого эталона.

то же время уксус, полученный

из фруктовых сиропов, вин, ягод и т. п., способен созревать,

улучшая свои потребительские качества при хранении (прежде

всего — за счет образования эфиров уксусной кислоты).

Поскольку уксуснокислые бактерии не превращают углеводы

непосредственно в уксусную кислоту, постольку исходное сырье

должно подвергаться спиртовому брожению (рис. 131). Самой

старой технологией получения столового уксуса лучшего качества

был так называемый медленный, или орлеанский (французский)

процесс, в котором исходным сырьем было легкое виноградное

вино,

которым на 3/5 заполняли плоские деревянные чаны и туда

же наливали столовый уксус, заполняя оставшиеся 2/5 объема (в

416

уксусе содержатся уксуснокислые бактерии). На поверхности

смеси развивалась пленка ацётобактерий.

Эта

Патока Виноград!

Разбав-

ление до

содержа-

ния са-

хара не

менее 8%

- *

4ЫЙ СОК Яблочный сок

Зерновой затор

(+ дрожжи - сахаромицеты) Спиртовое брожение (3-7 суток)

Г+ СН

СООН (в соотношении

1:100)

Выдерживание в анаэробных

условиях нескольких недель

Сепарирование

(уксусная смесь)

-"- Осадок дрожжевых

клеток, (отход)

Получение уксуса

по орлеанскому

(французскому), или

медленному способу

Получение уксуса

по немецкому, или

быстрому способу

Рис. 131. Технологическая схема получения уксуса из различного сырья.

После завершения окисления этанола отбирали из чана 10%

жидкости, а взамен добавляли столько же вина. Вместо плоских

чанов можно использовать деревянные бочки, например, дубовые,

емкостью до 20

дкл.

них должны быть отверстия для поступления

воздуха и сливной кран. Процесс можно вести полунепрерывно,

отрегулировав подачу свежих порций вина и слив готового уксуса.

В настоящее время почти везде "пищевой" уксус получают

согласно так называемому "генераторному", или немецкому (быс-

трому) процессу, впервые^ализованному в 1832 г. Особенность

его — создание максимальной поверхности для снабжения возду-

14 т. 8524 417

хом уксуснокислых бактерий и, как следствие, быстрое окисление

спирта в уксусную кислоту. Названную технологию осуществляют

так же в деревянных емкостях — трехсекционных генераторах (из

дуба, пихты, красного дерева и пр.) В верхней секции размещено

распылительное устройство для разбрызгивания 3—10% водного

раствора этанола (например, сегнерово колесо), в средней —

наполнитель для создания хорошо аэрируемой поверхности

(стружки — буковые, березовые; стержни кукурузных початков;

виноградные выжимки; керамические материалы и др.), в нижней

— собирается готовый уксус. Секции в генераторах разделены

дырчатыми перегородками. Воздух подается снизу и выходит через

негерметично закрытый верх.

Генераторы могут быть рециркуляционного типа на 30—60 м

в которых воздух перекачивается с относительно постоянной

скоростью и регулирование температуры (27—29°С) осуществляют

путем охлаждения уксусной смеси.

При получении уксуса необходимо хорошо контролировать

температуру и подачу воздуха, чтобы избежать заметной потери

спирта и уксусной кислоты за счет их сгорания (полного окисления)

до С0

и Н

0. Питательные вещества (кроме спирта) в уксусной

смеси будут влиять на жизнеспособность ацетобактерий.

Необходимо иметь в виду, что качество используемой воды для

разбавления этанола могут заметно сказываться на снижении

активности микробов в этом процессе (медь, железо, олово, цинк).

Уксус, получаемый из разведенного этанола, обычно не под-

вергают "старению", так как оно не прибавляет каких-либо прият-

ных вкусовых и обонятельных ощущений. Готовый уксус осветля-

ют фильтрованием, разливают в стеклянные емкости и пастеризу-

ют.

Выход уксуса оценивают по массе уксусной кислоты, содержа-

щейся в целевом продукте, наработанном за сутки (кг/м

/сут.).

Обычно эта величина довольно постоянна и равна 1,4 кг/м

/ сут.

для обычных генераторов, 5—12 кг/м

/ сут. — для рециркуляци-

онных генераторов.

Уже в течение четверти века совершенствуют метод глубинного

культивирования селекционированных штаммов ацетобактерий с

целью получения большего количества уксусной кислоты. Так, при

периодическом выращивании Aaceti в глубинных условиях при

25—30°С на среде, содержащей

10—11%

этанола, 1% уксусной

кислоты и минеральные соли выход уксусной кислоты повышался

до 18—23 кг/м

/сут. Более производительным стал непрерывный

418

процесс, реализуемый в батарее ферментаторов (например, из пяти

емкостью 6 м

каждый и соединенных последовательно). Исходная

среда с

этанола, 1,5% уксусной кислоты и минеральными солями

(моногидрофосфат аммония, дигидрофосфат калия, магния суль-

фат),

непрерывно поступает в первый ферментатор, обогащается

спиртом в последующих ферментаторах. Таким образом происхо-

дит обогащение среды уксусной кислотой при снижении концен-

трации этанола (таблица 44).

Таблица 44. Содержание уксуса при непрерывной глубинной ферментации

Acetobacter acetl в батарее из пяти ферментаторов

I Концентрация, %

| Этанола

| Уксусной кислоты

2,6

3,0

1,8

5,9

№ ферментатора

1,6

8,0

0,9

9,3

0,2—0,15

10,0

Из последнего ферментатора непрерывно вытекает уксус. Вы-

ход уксусной кислоты достигает 30 кг/м

/ сут. и более.

Получение лимонной кислоты. Около 60 лет назад лимонную

КйСЛОТу

БЫДеляли преимущественно из плодов цитрусовых расте-

ний. Теперь же основную массу 66 прснззодят с помощью опре-

деленных штаммов плесневого гриба Aspergillus niger.

настоящее

время ведущими производителями лимонной кислоты являются

КНР,

США, Франция, Россия и некоторые другие страны. Ранее,

начиная с 1917 г., производство было основано на поверхностном

культивировании микроба-продуцента; в 1938—1942 гг. освоено

также глубинное культивирование в герметичных ферментаторах

(см.

главу 7). Благодаря этому удалось механизировать и автома-

тизировать процесс, эффективнее использовать производственные

площади и снизить себестоимость целевого продукта, сократить

общую продолжительность технологического цикла, облегчитьпод-

держание асептичности в производственных условиях.

Ныне в производстве применяют селекционированные штам-

мы A.niger (например Р-3), дающие выход лимонной кислоты

98—99%

в расчете на потребленную сахарозу и обладающие повы-

шенной осмотолерантностью" (при начальных концентрациях са-

хара в питательной среде порядка 12%).

419

Лимонная кислота, как трехосновная оксикарбоновая кислота,

наряду с глюконовой, фумаровой и другими, является интермеди-

атом метаболизма в цикле трикар-

ОН боновых кислот, когда имеет место

НООС

сн

(L Q_| СООН неполное окисление соединений

углерода в аэробных условиях. Ее

соон

сверхсинтез возможен при лимити-

ровании гриба — продуцента по

железу и фосфору, при одновременном избытке в среде источника

углерода и при низких значениях рН.

Лимонная кислота накапливается вначале в клетках продуцен-

та, а затем выделяется в культуральную среду.

Вышеперечисленные факторы ингибируют такие ферменты,

как аконитат-гидратазу, изоцитратдегидрогеназу и, возможно, а-

кетоглутаратдегидрогеназу. Поэтому не происходит полного мета-

болизма лимонной кислоты в ЦТК и ее можно получать в доста-

точно больших количествах с коммерческими целями.

Поскольку основным сырьем для производства лимонной кис-

лоты является меласса, в которой содержится много железа, то на

стадии предферментации необходимо его осадить с помощью

желтой кровяной соли — К4 [Fe(CN

)]. К тому же доказано, что

эта соль и лимонная кислота в клетках выступают ингибиторами

изоцитратдегидрогеназы.

Известны два способа ферментации A-niger — поверхностный

и глубинный. Первый из них реализуют на предприятиях малой и

средней мощности в виде жидкофазной ферментации на жидкой

среде (например, в ряде стран Европы и Америки) и в виде

твердофазной ферментации (например, в Японии) на уплотненной

среде. Технологическая схема жидкофазной ферментации пред-

ставлена по Р. Я. Карклиныпу и А. К. Пробоку (1972) на рис. 132.

В отдельном цехе осуществляют наработку спор (конидий)

гриба в виде трехстадийной схемы. В первую стадию A.niger

выращивают на скошенной агаризованнои среде (например, на

сусло-агаре) в пробирках, во вторую и третью стадии его размно-

жают на плотной или жидкой среде соответственно в колбах

Эрленмейера или в алюминиевых кюветах площадью

8,5—12

дм

и с высотой бортиков от 7 до 20 см. Продолжительность каждой

стадии — от 2 до 4 суток при температуре 32°С. При образовании

и созревании конидий вначале бесцветный мицелий становится

затем черным; конидии собирают по принципу аспирации (по лат.

aspiratio — вдыхание, надувание) специальным вакуумным насо-

420

сом, подсушивают в термокамере при 28-30°С, смешивают со

стерильным активированным углем (1:2), фасуют в стерильные

флаконы (колбы) и хранят в течение от полутора до двух лет. С 10

дм

питательной среды в кюветах можно получить до 4—5 г сухих

конидий. Подобный посевной материал может быть самостоятель-

ным коммерческим продуктом, поставляемым на заводы лимонной

кислоты.

Поверхностный способ жидкофазной ферментации A.niger для

промышленного производства лимонной кислоты реализуют в

"бродильных камерах", где размещают на стеллажах названные

выше кюветы (8—10 штук на один стеллаж;) одну над другой. На

дне каждой кюветы имеется сливной штуцер. "Бродильные каме-

ры"

оборудованы приточно-вытяжной вентиляцией, обеспечиваю-

щей равномерный приток стерильного воздуха заданной темпера-

туры и влажности (3—4 м

/м

мицелия

•

ч"

Температура в камерах

поддерживается на уровне 34—36°С, высота питающего слоя жид-

кой мелассной среды 6—12 см. Максимальное тепловыделение

(500—550 кДж/м

• ч)

имеет место к 5 суткам; исходная концентра-

ция сахаров в питательной среде в среднем порядка

12%;

начальное

значение рН

6,8—7,0

снижается до 4,5 в течение первых трех суток

и до 3,0 — к концу процесса (8—9 сутки). Максимальное кислото-

образование в таких условиях происходит на 5—6 сутки (100—105

г/м

пленки гриба

•

ч'

а затем стабильно удерживается на уровне

50-60 г/м

«ч

Из трех вариантов проведения технологического процесса

(периодический, или бессменный; сменный и доливнои) наилуч-

шим оценивают доливнои, когда через 6—7 суток от начала

процесса ферментации (концентрация сахара снижается до 3—4%)

подливают стерильный раствор мелассы без питательных солей —

30—35%

начального объема (не забывать рационально использо-

вать объем кювет при первоначальном заполнении питательной

средой

учетом ее

испарения).

Таким путем добиваются продления

цикла ферментации до 12 суток, а с этим на 30—35% возрастает

количество перерабатываемой среды для получения целевого про-

дукта. При сменном (одно- и многосменном) методе культуральную

жидкость в конце ферментации сливают из-под пленки, пленку

снизу промывают стерильной водой и под нее же заливают свежую

стерильную питательную среду, содержащую только углевод и

лишенную минеральных солей. Ферментацию продолжают еще

4—6 суток.

421

В собранной культуральной жидкости содержится смесь орга-

нических кислот — лимонная, глюконовая, щавелевая и неисполь-

зованный сахар в примерном соотношении 45—50:3:1:7, то есть

лимонная кислота составляет от 80 до 90%. Ее выделяют химиче-

ским путем — добавляют к нагретой до 100°С культуральной

жидкости известковое молоко

—

Са(ОН)

или мел — СаСОз, доводя

рН до 6,8—7,0; это количество составляет примерно

2,5—3%;

трехзамещенный кальция цитрат, хуже растворимый в горячей

воде,

чем в холодной, выпадает в осадок вместе

кальция оксалатом

(кальция глюконат остается в растворе); осадок отфильтровывают,

промывают горячей водой и гидролизуют серной кислотой. Сво-

бодная лимонная кислота остается в растворе, а негидролизован-

ный кальция оксалат и образовавшийся гипс — CaS0

остаются в

осадке. Раствор лимонной кислоты очищают, подвергают вакуум-

упариванию и кристаллизуют. Кристаллы кислоты высушивают и

фасуют (рис. 132).

Рис.

132.

Технологическая схема

получения лимонной кислоты из ме-

лассы поверхностным способом

(жидкофазная ферментация): 1 —

цистерна для мелассы, 2 — центро-

бежные насосы, 3 — реактор для

разбавления мелассы, 4 — стерили-

затор, 5 — бродильная камера, 6 —

сборник сбраживаемых растворов, 7

—

нейтрализатор,

10 —

нутч-филь-

тры, 9 — расщепитель, 11 — сбор-

ник-монтежю, 12

—

вакуум-аппарат,

— дисольвер, 14 — фильтр-пресс,

15 — кристаллизатор, 16 — прием-

ник, 17 — сушилка, 18 — готовая

продукция,

19 —

сборник фильтрата.

«J

Мицелий продуцента либо используют для выделения фермен-

та пектиназы, либо высушивают и поставляют на корм скоту и

домашней птице (желательно — в обезвреженном

—

убитом виде);

наконец, он может быть использован, как источник флавинов.

Твердофазная ферментация на уплотненных средах для пол-

учения лимонной кислоты — наиболее простой способ из всех

известных. Ферментацию определенного штамма A.niger, рези-

стентного к высоким концентрациям металлов (особенно — желе-

за),

содержащихся в семенах злаковых растений, проводят на

увлажненных отрубях риса или пшеницы, находящихся в кюветах.

Условия биосинтеза кислот при этом аналогичны условиям на

422

агаризованных или в жидких питательных средах. После оконча-

ния процесса отруби экстрагируют

водой,

куда переходят кислоты,

а затем выделяют цитрат кальция и чистую лимонную кислоту

согласно схеме, изложенной выше.

Глубинный способ производства базируется на использовании

специальных культур A.niger ( в России применяют селекциони-

рованный штамм № 288/9). Способ подготовки посевного матери-

ала в виде конидий описан ранее. Инокулят подращивают сначала

в инокуляторе, затем — в посевном аппарате (примерно в 1/10

объема основного ферментатора) на среде с 3—4% сахара. Спустя

1—1,5 суток инокулюм передают из посевного в основной фер-

ментатор, где процесс ведут в течение

5—7—10

суток на аналогич-

ной среде с трехразовым доливом 25-28% (по сахару) раствора

мелассы с целью доведения конечной концентрации сахара в

культуральной жидкости до 12—15%. После окончания фермента-

ции (контроль — снижение кислотообразования) мицелий гриба

отфильтровывают, а культуральную жидкость подвергают обра-

ботке, как это описано выше.

Общая технологическая схема получения лимонной кислоты

при глубинной ферментации А-niger приведена на рис. 133.

Рис.

133. Технологическая схема

получения лимонной кислоты при

глубинной ферментации продуцента:

1 — емкость с мелассой, 2— прием-

ник мелассы,

3 —

весы,

4 —

варочный

котел, 5 — центробежный насос, б —

промежуточная емкость, 7 — стери-

лизующая колонка, 8 — выдержива-

тель,

9—холодильник,

10 —

посевной

аппарат,

11 —

головной ферментатор,

12 — стерилизующие фильтры,

—

емкость для хранения мелассы, 14 —

промежуточный сборник,

— бара-

банный вакуум-фильтр, 16 — прием-

ник для мицелия, 17 — вакуум-сбор-

ник для мицелия, 18 — вакуум-сбор-

ник фильтрата культуральной жидко-

сти.

Согласно подсчетам глубинный метод экономически выгоден

в тех случаях, когда мощность завода превышает 2,5 тыс. тонн

лимонной кислоты в

год,

в противном случае поверхностный метод

оказывается предпочтительнее из-за меньших энергозатрат и се-

бестоимости продукции.

423

Лимонную кислоту широко используют в пищевой, медицин-

ской, фармацевтической, лакокрасочной промышленности и в

некоторых других отраслях народного хозяйства.

Лимонную кислоту можно получать из н-парафинов с помощью

дрожжевых организмов рода Candida — C.lipolytica, C.tropicalis,

C.parapsilosis, С.о1еорпДа, C.guilliermondii, Czeylanoides. Наиболее

активными из них являются дрожжи C.lipolytica. К тому же другие

виды (кроме Qoleophila) относят к разряду условно патогенных.

Кроме лимонной дрожжи образуют на н-алканах Tpeo-Ds-изо-

лимонную, представляющую собою геометрический изомер ли-

монной кислоты.

СН,—СООН ОН—С—СООН

I I

НО—С—СООН НС—СООН

I I

сн

—соон

с—соон

лимонная кислота Tpeo-Ds-изолимонная

кислота

При лимитировании продуцента в азоте, фосфоре, сере и

магнии, но при избытке в среде парафина, можно наблюдать

сверхсинтез равных количеств обоих изомеров. Методами генети-

ки и селекции получены мутанты, синтезирующие лишь один

какой-либо изомер лимонной кислоты. Накопление целевого про-

дукта может достигать 200 г/л и выше при выходе кислоты от

использованного парафина более чем 140%.

Культивирование C.lipolytica проводят в ферментаторах при

интенсивных перемешивании и аэрации среды. В нашей стране

отработаны методы получения лимонной и изолимонной кислот

на н-алканах. Большая заслуга в этом принадлежит Т. В. Финоге-

новой. Получаемые технические соли цитраты и изоцитраты имеют

важное значение при изготовлении, например, моющих и других

веществ.

Получение глюконовой кислоты. Используют селекционирован-

ные штаммы Aspergillus niger, культивируемые в ферментаторах

при интенсивных аэрации и перемешивании, поддерживая посто-

янными температуру (30°С) и рН среды 6,0-7,0. Технологический

процесс можно проводить в одном из двух вариантов нейтрализа-

ции среды при ее закислении в ходе биосинтеза целевого продукта

— мелом или раствором едкого натра. В первом случае исходная

питательная среда должна содержать

10—15%

глюкозы, поскольку

кальция глюконат ограниченно рас гворим в воде при 30°С (порядка

424