Елинов Н.П. Основы биотехнологии

Подождите немного. Документ загружается.

10.4.2.

Использование методов геномной и хромосомной ин-

женерии в фитобиотехнологии. Объединение геномов клеток

разных особей можно осуществлять при половой и соматической

гибридизации. Первая из них способна реализоваться в природных

и искусственных условиях, тогда как вторая — только в искусст-

венных. Половая гибридизация давно известна человеку, и он с

тех пор использовал ее для выявления новых сортов растений и

для повышения их продуктивности.

Соматическая гибридизация базируется в основном на приме-

нении растительных протопластов, впервые полученных Дж. Клер-

кером в 1892 г. из листьев Stratiotes aloides (водное растение,

именуемое телорезом).

Соматические клетки растений, как и интактные клетки бак-

терий или грибов (по лат. intactus — нетронутый), в обычных

условиях не сливаются друг с другом. Все они предварительно

должны быть лишены клеточной стенки и трансформированы в

протопласты.

Протопласты (от греч. protos—первый, plastos

—

вылепленный,

образованный) — это клетки, лишенные клеточных стенок, спо-

собные сохраняться и метаболизировать, равно как и реконстру-

ировать клеточную стенку в подходящих условиях. Протопласты

можно получать с помощью механических и биохимических (эн-

зиматических) методов.

первых случаях добиваются плазмолиза

растительных тканей, например, с помощью 0,1% раствора саха-

розы с последующим разрезанием эпидермиса и освобождением

протопластов в окружающую питательную среду. Энзиматические

методы по-разному эффективны в получении протопластов. Здесь

необходимо подбирать ферменты для каждого вида растений,

однако наиболее часто используют целлюлазы, пектиназы, геми-

целлюлазы как индивидуально, так и в комбинациях. Например,

для получения протопластов из листьев Nicotiana tabacum листовую

ткань без эпидермиса погружают в смесь ферментов, включающую

0,5%

пектиназы и 2% целлюлазы в 0,7 М растворе маннита или

сорбита; для получения протопластов из листьев клевера и люцер-

ны используют 2—5% смесь гликаназ с пептидазами, и т. д.

В сравнительном плане более подходящим является энзимати-

ческий метод получения протопластов как более щадящий. Однако

при любом способе важен подбор осмотического стабилизатора,

515

без которого может наступить быстрый плазмоптиз* протопластов

(по

лат.

plasma — плазма, option — альтернатива).

качестве таких

стабилизаторов могут быть применены растворы неорганических

солей

(СаС1

КС1, Na

HP0

), органических гликолей (маннита,

сорбита), моно- и дисахаридов (глюкозы, ксилозы, сахарозы) в

ориентировочных концентрациях

0,3—0,8

М/л. Однако примени-

тельно к виду растения, из которого получают протопласты, необ-

ходимо подбирать индивидуальные условия для "протопластирова-

ния" (осмотический стабилизатор, рН среды, t°C). Эти требования

сохраняются и в случаях получения протопластов из каллусных

культур и клеточных суспензий.

В жизнеспособности выделенных протопластов большую роль

играет физиологическая полноценность исходного растительного

материала. Суспензионные культуры наиболее приемлемы для

этих целей, будучи в конце логарифмической фазы роста (размно-

жения).

Полученные тем или иным путем протопласты либо используют

для регенерации растения (см. тотипотентность), либо их можно

подвергнуть слиянию с образованием гетерокариотических гибри-

дов.

Из растений, относительно легко регенерирующих из протоп-

ластов, можно назвать картофель, люцерну, маниок, рапс, табак.

Для получения растений — регенерантов, высаженных в грунт,

требуется, как минимум, 16—J 8 недель.

Растения, полученные из протопластов, могут отличаться до-

статочно выраженной изменчивостью по ряду интересующих нас

признаков: урожайности, величине (размеру), морфологии отдель-

ных частей, фотопериодичности и др. Как правило, это связывают

с изменением числа и перестройками хромосом. Поэтому протоп-

ласты растений представляют собой интересные объекты и для

изучения процессов мутагенеза.

Гибридизация протопластов удается не только в тех случаях,

когда исходные растения (источники клеток для протопластирова-

ния) способны гибридизоваться половым путем, но и тогда, когда

заведомо известно, что клетки, подлежащие слиянию, относятся к

организмам с половой несовместимостью. Тем не менее, во в_сех

случаях соматической гибридизации один из партнеров должен

нести какой-либо маркерный признак (биохимический или дру-

Явление, обратное плазмолизу.

516

гой),

по которому возможно подтвердить достоверность получения

гибрида. В этом смысле удобны ауксотрофные мутанты.

Гетерокариотические соматические гибриды выделяют либо

вручную с помощью микроманипулятора, капиллярной пипетки и

шприца, либо автоматически на основе применения флуоресцен-

тных систем.

Для биотехнологии также важна цибридизация, когда возника-

ют гетерозиготы по внеядерным (цитоплазматическим) генам,

определяющим, например, устойчивость к гербицидам или признак

цитоплазматической мужской стерильности (рис. 148).

Рис. 148. Слияние

растительных протопла-

стов и возможная сегре-

гация хлоропластов: 1 и

—

протопласты разной

видовой принадлежно-

сти,

—

гетерокарион, 4

— гибриды, Г и 2' —

цибриды.

К настоящему времени из ряда растительных протопластов

получены их безъядерные фрагменты — микропласты, окружен-

ные тонопластнои мембраной и включающие часть внеядерного

генетического материала. Используя приемы соматической гибри-

дизации, микропласты можно сливать с реципиентными протоп-

ластами. Таким образом, микропласты являются резервным мате-

риалом для расширения возможностей клеточной инженерии в

фитобиотехнологии. Более того, теперь удается гибридизация рас-

тительных протопластов с протопластами микроорганизмов и жи-

вотными клетками.

Применительно к хромосомной инженерии

удалось доказать проникновение изолированных метафазных хро-

мосом в обработанные полиэтиленгликолем реципиентные протоп-

ласты таких однодольных растений, как пшеница и кукуруза.

517

Открываются пути привнесения дополнительной генетической

информации по желанию экспериментатора в целях создания

трансгенных растений. Прямой перенос чужеродной ДНК в про-

топласты возможен также с помощью микроинъекции, трансфор-

мации, упаковки в липосомы с последующим их эндоцитозом

растительными протопластами, и электропорации (высоковольт-

ных электрических импульсов).

10.4.3.

Генная инженерия и биологическая фиксация азота.

Азотистые удобрения, вносимые в почву (наряду с другими пита-

тельными веществами) стимулируют рост и развитие растений.

Обогащению почвы азотом помогают особые микроорганизмы,

фиксирующие молекулярный азот из воздуха. Такие микробы

подразделяют на две группы — свободноживущие в почве (напри-

мер,

Azotobacter chroococcum) и микробы - симбионты с корневой

системой растений (например, Rhizobium meliloti). Те и другие

осуществляют биологическую азотофиксацию. Число азотофикса-

торов невелико, но от них в буквальном смысле слова зависит

жизнь на нашей планете. С помощью микробов - азотофиксаторов

ежегодно фиксируется около 17,5

•

т N

из воздуха. Основные

компоненты системы азотофиксации являются сильными восста-

новителями: ферментный комплекс — нитрогеназа, ферредоксин

или флаводоксин и АТФ. Микробы — азотофиксаторы трансфор-

мируют молекулярный азот в аммиак по следующей схеме:

•2Н

»>

МН +2 Н

Р^.

Ассоциация клубеньковых бактерий из рода Rhizobium с бобо-

выми растениями является наиболее эффективной по фиксации

из воздуха. Ответственными за это являются nif-гены. Соответ-

ствующие биопрепараты бактериальных удобрений (см. главу 9)

выпускают в различных странах мира.

К настоящему времени практически решена проблема увели-

чения nif-генов в микробах — азотофиксаторах, являющихся сим-

бионтами донника (Rh. meliloti). За счет этого заметно усиливается

азотофиксация и, как следствие, повышается урожайность расте-

ния — хозяина (рис. 149).

518

Рис.

149. Схема получения клеток

Rhizobium meliloti, несущих дополнитель-

ные гены азотфиксации:

— плазмидная

ДНК, 2 — рестриктаза, 3 —• клетка

Rh.meliloti, 4 — хромосома клетки, 5 —

nif-гены, 6

—

лигаз'а,

—

рестриктирован-

ная плазмидная ДНК, 8 — плазмидная

ДНК с nif-геном, 9 — трансформация, 10

— клетка Rh.meliloti с nif-генами.

Имеются также предпосылки к созданию методами генной

инженерии злаковых растений — азотофиксаторов. Это сулит

большие выгоды агрохозяйствам, занимающимся выращиванием,

например, зерновых культур.

Прибегают и к простым искусственным ассоциациям азото-

фиксирующих бактерий с растениями, дающими ощутимые ре-

зультаты по урожайности (например, цианобактерии Anaboena

variabilis и табака).

10.4.4.

Другие прикладные аспекты фитобиотехнологии. В

начале 80-х годов текущего столетия удалось создать подсолнечник,

несущий гены бобов фасоли, кодирующих белок фазеолин. Такое

химерное растение получило название "Санбин" (от англ. sun —

солнце, bean — боб), оно способно синтезировать во многом

полноценные белки. Каллусная культура санбина также обладает

этой способностью.

Кроме генов фазеолина локализованы и выделены гены таких

запасаемых белков, как зеин — белок кукурузы и легумин — белок

гороха. Эти гены удается переносить в отдельные негомологичные

растения.

Создан трансгенный рапс, содержащий гены отдельных ней-

ропетидов человека, например, лей-энкефалина, связанного

геном

альбумина семян рапса. С одного гектара земли, засеянного таким

рапсом, можно получать до 3 кг нейропептида.

Важное значение имеют работы по созданию гербицидоустой-

чивых растений, не боящихся сорняков. Удалось перенести из

представителей актиномицетов ген устойчивости к фосфинотри-

ацину в клетки сахарной свеклы; получены также устойчивые к

гербицидам определенные сорта табака.

Токсические белковые кристаллы, образующиеся в клетках Вас.

thuringiensis на основе матричного синтеза, убивают личинок

листо грызущих насекомых. Поэтому генноинженерная разработка

по переносу гена бактериального токсина в геном табака увен-

чалась успехом в 1987 г. Экспрессия такого гена сопровождалась

519

биосинтезом токсина, и личинки насекомых, поедающие листья,

погибали в сравнительно короткий промежуток времени. По тако-

му же принципу был создан инсектицидный трансгенный хлоп-

чатник, содержащий ген ингибитора трипсина гороха коровьего;

этот ген обусловливает синтез белка, блокирующего протеолити-

ческую активность в пищеварительной системе у насекомых.

Создан новый сорт помидоров, длительно сохраняющийся без

размягчения вследствие подавления активности фермента полига-

лактуронидазы. Методом генной инженерии получен ген, опреде-

ляющий биосинтез анти-мРНК, которая ингибирует природную

мРНК.

Благодаря удачному переносу генов фермента хальконсинте-

тазы (в антисмысловои ориентации) в петунию удалось получить

растение с белыми цветами.

Сконструированы такие генноинженерные сорта

сои,

которые

проявляют устойчивость к насекомым, гербицидам, вирусам и

образуют больше запасных белков, обогащенных метионином.

На основе методов геномной инженерии получены межвидо-

вые гибриды капусты, картофеля и табака с турнепсом, картофеля

с помидором ("Помат"), помидора дикого вида, устойчивого к

некоторым вирусам, и культурного сорта.

Успешными оказались работы по созданию морозоустойчивых

растений на основе их обработки культурой клеток Pseudomonas

syringae, из которой элиминирован ген, ответственный за синтез

специального белка, ускоряющего кристаллизацию воды с образо-

ванием льда. Обработка клубйей картофеля таким "лед-минус"

микробом приводит к возрастанию их морозоустойчивости.

10.5.

Получение биогаза и удобрений на основе использования

растений. Традиционные методы гибридизации растений помогли

достигнуть резкого повышения их урожайности (особенно —

зерновых культур); наступила так называемая "зеленая револю-

ция", с которой, например, в странах Юго-Восточной Азии связы-

вают полное самообеспечение продуктами питания.

Возрастание урожайности культур растений сопряжено с уве-

личением их отходов. Одна часть таких отходов может быть

использована в качестве корма для сельскохозяйственных живо-

тных, другая — для биотрансформации в какие-либо полезные

продукты (биогаз, удобрения и пр.). Рациональное использование

растительных отходов помогает решать отдельные экологические

и энергетические проблемы.

520

10.5.1.

Получение метана из растительных отходов. Метан

(СН,) входит в состав природных газов (на него приходится

97—98%

в природных газовых месторождениях). Так называемые "попут-

ные нефтяные газы" из буровых скважин содержат

39—85%

мета-

на, остальные газы представлены, в основном, этаном, пропаном,

бутанами, пентанами.

В воздухе каменноугольных шахт всегда присутствует метан в

примерных количествах

3,5—7,5%.

Смесь метана

воздухом сильно

взрывается от пламени.

Метан образуется также в природе при бактериальном разло-

жении клетчатки или в рубце жвачных животных (метановое

брожение), при окислении молекулярного водорода до СН

(анаэ-

робное дыхание).

Метановое брожение происходит в анаэробных условиях под

влиянием смешанной микрофлоры, включая метанобразующие

бактерии, или бактерии — метаногены (археобактерии, см. главу

2)..

В настоящее время миллионы биогазовых установок в Индии,

Китайской Народной Республике, в странах ЕЭС рассчитаны на

проведение метанового брожения в одном биореакторе (метантен-

ке) емкостью от одного до нескольких тысяч кубометров.

10.5.2.

Получение кормового белка на основе биоконверсии

целлюлозосодержащих растительных материалов. Давно изве-

стен биотехнологический процесс получения дрожжей на гидро-

лизатах древесины хвойных растений. В такой древесине содер-

жатся гексозаны, тогда как в древесине лиственных растений —

преимущественно пентозаны, почти совсем не сбраживаемые по-

сле гидролиза дрожжевыми организмами.

В качестве гидролизующих агентов используют кислоты или,

реже, ферментные комплексы.

любом случае матричный лигнин

остается негидролизованным и от него стремятся избавиться пред-

варительной делигнификацией целлюлозных материалов различ-

ными способами, в том числе — паракрекингом, или обработкой

водяным паром под давлением 7—8 ати. Можно использовать

биологический способ делигнификации, когда на целлюлозосодер-

жащем материале выращивают дереворазрушающие грибы из

класса базидиомицетов. Эти последние делают целлюлозный ма-

териал доступным в качестве корма для жвачных животных (со-

держание лигнина в нем не должно превышать 18—20%).

Делигнифицированная целлюлоза становится более доступной,

например, для целлюлазного комплекса гриба Trichoderma viride,

521

обогащающей белком этот продукт при твердофазной фермента-

ции.

Получение кормовых дрожжей на гидролизатах древесины и

сульфитных щелоках (отходах целлюлознобумажной промышлен-

ности), приведено в главе 9. Здесь рассмотрены биотехнологиче-

ские процессы использования растительной массы.

Технология получения ферментированного сока и белкового

коагулята из зеленой массы растений.

Названная технология может быть реализована по так называ-

емой схеме

ТПФ-1,

предложенной М. Е. Бекером (Латвия). Для

этого используют свежескошенную зеленую массу клевера и

люцерны, которую измельчают лацератором, прессуют на прессе

(например,Т1-ВПО-30), жом передают на приготовление травяной

муки с добавлением антиоксидантов, либо — на силосование.

Натуральный травяной сок подают в биореактор для непрерывной

анаэробной ферментации, где он обогащается белком и за счет

органических кислот консервируется естественным путем.

Сухие вещества в ферментированном соке составляют 5—10%,

сырой протеин — 1—3%, общее количество органических кислот

— 1—2%, рН 3,9—5,4.

Кислотообразующие бактерии дополняют сок метионином.

Вместе с тем в соке снижается количество сапонинов и ингибитора

трипсина.

Кроме ферментированного сока по этой биотехнологии пол-

учают белковый коагулят, содержащий 10—20% сухого остатка (в

сухом остатке содержится 25% сырого протеина).

Из нижнего штуцера биореактора коагулят отбирают периоди-

чески (1 раз в 1—2 суток) в количестве 20—30% от поданного

натурального растительного сока. На сброженный сок приходится

70—80%

объема от натурального сока. Его подают по трубопрово-

дам либо в кормушки животным (прежде всего имеющим однока-

мерный желудок), либо в другой биореактор, где на нем выращи-

вают специальные расы кормовых дрожжей из родов Hansenula и

Trichosporon, с помощью которых конечный продукт вдвое обога-

щается истинным белком.

Способ ТПФ-1 пригоден для мелких и крупных агрохозяйств,

располагающих электроэнергией; он нетрудоемок и экономически

выгоден, а получаемый сброженный сок представляет собой вы-

сококачественный кормовой продукт (таблица 53).

522

Т а б л и ц а 53. Состав кислого коричневого сока люцерны до и после

выращивания на нем Trlchosporon cutaneum A52/S1,

(по У. Э. Виестуру и др., 1987)

Компонент

Сухие вещества

том

числе:

растворимые

нерастворимые

Сырой протеин

(% от

сухих

веществ)

Истинный белок

(% от

сухих

веществ)

Кислоты:

молочная

уксусная

До (рН

5,4)

4,57

4,22

0,35

3,5

0,47

0,84

0,37

После

(рН 8,8)

3,99

2,78

1,21

45,2

11,82

0,39

Силосование кормов давно используют

на

практике

силос

занимает важное место

рационе сельскохозяйственных живо-

тных. На первых порах использовали примитивные силосные ямы,

куда вносили свежескошенную траву (нередко грубую, плохо

поедаемую

естественном виде жвачными животными).

Ямы

герметизировали

и за

счет природной эпифитной микрофлоры

происходила твердофазная ферментации травы. Нередко такие

ферментации были неудачными из-за нерегулируемости желатель-

ной микрофлоры (молочнокислых бактерий)

преобладания гни-

лостных процессов.

В последующем были сконструированы

внедрены

сельско-

хозяйственную практику силосные башни или процесс силосования

начали вести в специальных траншеях, в которых стало возможным

осуществление направленных процессов

помощью специальных

бактериальных заквасок. Используемые закваски различаются

по

содержащимся

них видам. Например, препарат "Казахсил ПБК"

включает только пропионовые бактерии, латвийская закваска

—

чистую культуру Lactobacillus plantarum

и т. д. По

консистенции

закваски подразделяют

на

три группы: сухие, уплотненные, жид-

кие.

Содержание сухих веществ

в них

составляет для первых

—

523

более 90%, для уплотненных — 45—65% и для жидких — 5—10%.

Наилучшими из них признают жидкие закваски, в которых кон-

центрация живых клеток равна

• 10

/мл. Тогда для траншейного

силосования растительной массы в количестве 500 т необходимо

от 500 до 1000 л закваски.

Недостатки жидких заквасок: температура хранения должна

быть в пределах 4—8°С; малый срок хранения при указанной

температуре — не более двух недель; необходимость больших

емкостей в случае силосования большого количества растительной

массы, и, в этой связи, заметные транспортные расходы для

перевозки жидких заквасок (особенно — на дальние расстояния).

Поэтому сухие и уплотненные закваски выгоднее жидких, если

реактивация микробных клеток при рекомендуемых температурах

(чаще при 20—25°С) происходит в короткие сроки и полностью

(т. е> почти 100% клеток).

Молочнокислые бактерии индуцируют соответствующее бро-

жение с накоплением молочной кислоты при снижении рН до 4,3

и ниже; это предотвращает развитие нежелательной микрофлоры *

(в том числе — эпифитной) и силос обогащается "природными"

органическими кислотами — молочной и уксусной. С этим улуч-

шается качество силоса, хотя и происходит определенная утрата

Сахаров, расходуемых в течение первой (спонтанной аэробной) и

второй (индуцируемой анаэробной) фаз силосования.

До герметизации башни (траншей) трансформация углеводов ?

протекает под действием не только вносимой закваски, но и

естественной микрофлоры растений, закладываемых на силосова-

ние.

В первую фазу имеют место гомо- и гетероферментативное

брожение, во вторую — преимущественно гомоферментативное,

когда меньше образуется "побочных" продуктов (диоксида углеро-

да, маннита).

В приготовлении силоса важное значение приобретает также

равномерное распределение молочнокислых бактерий закваски в

толще закладываемой растительной массы, а также применение

таких химических консервантов, как муравьиная и бензойная

кислоты, другие вещества. Консерванты предотвращают потери

углеводов, (особенно — в первую фазу), а во вторую при рН 4,0

ингибируются нежелательные ферментативные реакции (в том

числе — гниение). Более того, подобные консерванты улучшают

качество конечного продукта — возрастает усвояемость корма. Из

химических консервантов известны препараты АИВ-2, Фарми-ли-

уос и др. АИВ-2 содержит 80% НСООН, 2% — Н

Р0

и 18% Н

524