Елинов Н.П. Основы биотехнологии

Подождите немного. Документ загружается.

Фарми-лиуос включает

25%

НСООН,.

25%

СН

СООН,

50%

добавки,

содержащей 35% "Финфермекса" (лигносульфонаты, пентаозы,

гексаозы, соли кальция, магния, серы, железа, другие органические

кислоты) и

15%

других веществ.

10.5.3.

Получение удобрений на основе ассоциации растений

и микроорганизмов. Круговорот веществ в природе в значительной

степени обусловлен и поддерживается за счет деятельности мик-

роорганизмов, обеспечивающих доступность для растений азота,

фосфора и других элементов. Запасы азота в природе практически

безграничны и возобновляются благодаря микробам-азотофикса-

торам. В то же время запасы фосфора менее богаты и легче

истощаются, а для растений (как и для любого живого организма)

данный элемент относится к разряду органогенов. Установлено,

что фосфор в виде ортофосфата легче освобождается из трудно-

доступных для растений соединений при действии микроорганиз-

мов,

потребляющих органические вещества. Здесь важны свобод-

ноживущие азотофиксаторы, клубеньковые бактерии и грибы-ми-

коризообразователи. При их рациональном использовании удается

существенно повысить плодородие почвы для культивирования

важных растений. В регионах земного шара с теплым климатом

удается получать ценные удобрения на основе водяного папорот-

ника (Azolla pinnata) и цианобактерий (Anabaena spp.). Подобная

симбиотическая ассоциация характеризуется тем, что она фикси-

рует молекулярный азот из воздуха и обогащает почву раствори-

мыми соединениями.

Показано, что подобное "зеленое удобрение" повышает уро-

жайность риса на 50%, если его вносят в почву перед следующим

посевом. Такой эффект, аналогичный использованию 60 кг азот-

ного удобрения на 1 га, пролонгируется и в течение второго года.

Из представителей царства Mycota базидиальные грибы-мак-

ромицеты связаны трофическими связями с различными растени-

ями; прежде всего — древесными. Поэтому возможна и полезна

искусственная микоризация (от греч. mykes — гриб, rhiza —

корень) древесных культур макромицетами, например, при посад-

ках. Около 40% всех видов макромицетов (порядка 5000) образуют

эктомикоризу.

Поглощаемые корнями растения питательные вещества посту-

пают также и в гифы грибов, где фосфор переходит в связанное

состояние и в таком виде поступает в ткани деревьев. Фосфор

возвращается в почву после отмирания "микоризных корней".

Динамика содержания фосфора в подстилке { по лат.

525

stramentum — солома; в лесу она состоит из опада и чаще —

многолетнего)

дерново-подзолистом горизонте почв коррелирует

в фенологическом смысле (фенология — наука о сезонных явле-

ниях в живой природе) с динамикой плодоношения макромице-

тов-микоризообразователей. Наибольшее количество плодовых тел

и "подвижного" фосфора совпадают во времени и пространстве.

Макромицеты-симбиотрофы имеют большое экономическое и

экологическое значение. Некоторые из них, например, из родов

Laccaria, Paxillus, Suillus и др. используют для восстановления

природных ценозов.

О симбиотрофии ризобактерий и растений (в частности, бобо-

вых),

об изготовлении ряда препаратов для удобрения почв см.

главу 9.

10.6.

Коллекционные центры сохранения генофонда растений.

Обычно для селекции использовали древние культурные растения

и их сородичей. С ростом народонаселения на нашей планете и

существенно возросшими потребностями в продуктах питания

происходили сдвиги в сторону преобладания в севооборотах вы-

сокопродуктивных современных сортов, например, злаковых рас-

тений. К тому же включение все новых и новых площадей под

посевы (особенно — на территории России) подвинуло нас ко

времени, когда популяции диких предков, адаптировавшихся к

конкретным условиям обитания, стали исчезать с "лица Земли". А

это привело к оскудению генофонда растительного мира. Вот

почему сегодня проблема его сохранения стала наиважнейшей.

В 1974 г. был образован Международный Совет по генофонду

растений (IBPGR), поддерживаемый

FAO,

Международным банком

и за счет программы развития при ООН (UNDP). Цель этого совета

— создавать и координировать международное сотрудничество по

сохранению генофондов, и организовывать финансовую поддер-

жку такого рода программ. В этой связи IBPGR координирует

работу по сбору, сохранению, документированию, оценке и ис-

пользованию генофонда.

Генофонд растений можно сохранять в естественных условиях,

то есть в местах их произрастания. Здесь важную роль играют

природоохранные мероприятия, опирающиеся на соответствую-

щие законодательства и законодательные акты, принятые в меж-

дународном и региональном масштабах.

Другой путь сохранения генофонда

—

поддержание материала

в так называемых банках генов. Такие банки могут быть рабочими

и законсервированными. Первые используются генетиками и се-

526

лекционерами для своих непосредственных нужд и поэтому в них

не всегда предусмотрено длительное хранение материала; они, как

правило, небольшие по ассортименту растительных видов. Вторые

относят к разряду крупных банков генов — в них сохраняют

большой набор генотипов, включая и такие, ценность которых еще

не определена, но над которыми нависла угроза исчезновения. Из

законсервированных генофондов могут пополняться рабочие кол-

лекции.

Особенно с т и банков генов: их целесообразность

и широкий видовой набор сохраняемого материала, надежность

способов хранения, своевременность обновления материала, фун-

кциональный динамизм.

Что касается широты видового набора сохраняемого материала,

то под этим понимают спектр сохраняемых генотипов, и чем он

больше, тем богаче возможность человечества жить в прекрасном

мире различных растительных сообществ, чем и определяется

целесообразность создания банков генов. В этой связи можно

отметить, что в генобанке (коллекции) в ВИРе (Всероссийский

институт растениеводства) хранится 380000 генотипов растений.

Надежность способов хранения генофонда зависит от вида

растения и сохраняемости материала (семена, вегетативная форма

ткани, искусственные посадки), а также методов обработки

и/или

подготовки материала для хранения. В отношении большинства

видов сельскохозяйственных культур приемлемым оказалось кри-

осохранение семян в течение длительного времени. Если растения

не образуют жизнеспособных семян или семян, не выдерживаю-

щих длительного хранения (многолетние древесные растения), то

стремятся сохранять относительно долго живые ткани в вегетатив-

ной форме. При этом необходимо помнить

возможности возник-

новения микробных болезней, обусловленных вирусами, бактери-

ями, грибами. При ежегодном хранении вегетативных отводков

травянистых растений существенная выбраковка происходит из-за

легкости их повреждений.

Хранение в виде искусственных посадок, например, древесных

растений, необходимы большие площади пригодных для этого

земель и достаточно внимательный уход за посадками.

Из сказанного вытекает, что универсального способа сохране-

ния генофонда не существует и, очевидно, его не может быть,

учитывая разнокачественность видов в царстве растений. Наибо-

лее надежным для семян признают криосохранение (от

греч. krios — мороз). Изучение влияния низких температур на

527

живые организмы составляет предмет науки "Криобиология". Кри-

осохранение в буквальном смысле Означает хранение в заморо-

женном состоянии. Точка замерзания чистой воды соответствует

0°С,

точка переохлаждения, или образования однородных центров

кристаллизации соответствует -38°С. На практике используют

температуры значительно ниже, чем температура замерзания во-

ды,

например, -79°С (температура сухого льда), -80°С и ниже

(температура в специальных морозильниках), -150°С (температура

паров жидкого азота), -196°С (температура жидкого азота). Сохра-

няемый биообъект переходит в анабиотическое состояние, когда

метаболизм замедляется или приостанавливается на время хране-

ния. При этом также не происходят какие-либо генетические

изменения за исключением повреждающего действия ионизиру-

ющей радиации.

В практике работы коллекций может наблюдаться так называ-

емый холодовый шок, или повреждение от охлаждения,

когда сохраняемый материал проявляет чувствительность к пони-

женным температурам. При этом жидкая часть цитоплазмы выхо-

дит из клеток из-за структурных нарушений в клеточной мембране.

К счастью, холодовый шок не проявляется при криосохранении

большинства типов растительных клеток.

При охлаждении клеток важную роль играет кристаллообра-

зование льда вокруг внутриклеточных гетерогенных центров кри-

сталлизации, когда образующиеся кристаллы могут физически

повреждать, например, клеточные мембраны.

Методический подход к выбору способа замораживания зави-

сит от качества материала (семена, вегетативная ткань, уровень их

обезвоживания и пр.) На рис. 150 представлены данные Дж.

Фарранта (1980) по выживаемости клеток при охлаждении.

Ь:

t°c

-20

-40

-60

-80

О,

£f

"Т(время)

сг

Рис.

150. Выживаемость

клеток при быстром и мед-

ленном охлаждении; 1 — не-

замерзшая клетка, 2 — точка

замерзания, 3 — выход внут-

риклеточной воды, 4 — быс-

трое охлаждение

—

клетка не

сжата, внутриклеточный лед,

клетка не выживает, 5 - мед-

ленное охлаждение

—

клетка

сжата, нет внутриклеточного

льда, клетка выживает.

528

Чтобы уменьшить образование внутриклеточного льда в про-

цессе охлаждения клеток, используют криопротекторы

(в концентрации около 2 М) с разным механизмом действия. Они

снижают точки замерзания (точку плавления) и переохлаждения

воды (температура, при которой происходит гомогенная кристал-

лизация льда), поднимают точку девитрификации раствора (тем-

пература, при которой происходит исключение аморфности, стек-

ловидное™ и когда начинается внезапная кристаллизация). Рас-

твор остается аморфным, когда он охлаждается быстро, то есть

время, необходимое для роста кристаллов, ограничено. В этом

случае говорят, что раствор витрифицируется. При

медленном нагревании такого раствора происходит выделение

тепла, совпадающее по времени и внезапной кристаллизацией или

девитрификацией.

К числу криопротекторов относят глицерин, гликаны, гликоп-

ротеины, ДМСО, сахарозу, ПВС, сыворотку крови и др. Их можно

использовать по отдельности или в смесях. Лучший способ стери-

лизации растворов криопротекторов — мембранная фильтрация.

При получении культуры после криосохранения в парах азота

(-150°С) или в жидком азоте (-196°С) их оттаивание проводят

достаточно быстро в водяной бане при 35—40°С. После оттаивания

необходим тщательный уход за каждым образцом.

Установлено, что при криосохранении протопластов из многих

видов растений достигают 70—90%-й их выживаемости. При соче-

тании медленного и ступенчатого замораживания и быстрого

оттаивания в качестве криопротектора рекомендуют 10% ДМСО.

Для криосохранения каллусов обычно применяют двух- или

трехкомпонентную смесь криопротекторов: 8% глюкоза, 10%

ДМСО и 10% ПЭГ (ММ 6 кДа).

В таблице 54 приведены различные типы культур растений и

применяемые условия их хранения.

Среди факторов, лимитирующих рост отдельных растений,

могут быть и ретарданты (от лат. retardatio — замедление), что

отмечено, например, для меристематических тканей паслена.

529

Т а б л и ц а 54. Способы хранения некоторых культур растительных тканей

Растение

Береза

обыкновенная

(Betula vulgaris)

Дурман (Datura

stramonium)

Красавка (Atropa

belladonna)

Кукуруза(Zea

mays)

Морковь

(Daucus carota)

Паслен (Solanum

spp.)

Тип культуры

Кончики побегов

Суспензия клеток

Зародыш из пыльцы

Пыльник

Суспензия клеток

Зародыш из зиготы

Каллус

Суспензия клеток

Каллус

Кончики побегов

Криосохранение

—196

Условия

хранения,

лимитирующие

рост

Хранение при

низких

температурах

Высушивание

ткани перед

хранением +

хранение

в условиях

недостатка

сахарозы

Хранение под

маслом

минеральным

Хранение при

низкой

температуре или

(и) в

присутствии или

после

Зародыш соматический

Зародыш

соматический/

клональныи регенерант

—196

применения

ретардантов

530

Продолжение табл. 54

Перец горький

(Capsicum

annuum)

Рис (Oryza sativa)

Табак (Nicotiana

tabacum)

Тип культуры

Каллус

Суспензия клеток

Каллус

Суспензия клеток

Зародыш из пыльцы

Каллус

Кончики побегов

Пыльник

Суспензия клеток

Криосохранение

ГС)

—

—196

—

—196

Условия

хранения,

лимитирующие

рост

Хранение при

. низких

температурах

—

Хранение

в условиях

недостатка

снабжения Ог

—

Из таблицы 54 видно, что криосохранение в жидком азоте

приемлемо для преобладающего числа указанных видов культур

тканей растений.

Для суспензионных культур клеток нередко рекомендуют трех-

компонентную двухмолярную смесь криопротекторов, включаю-

щую глицерин (0,5 М), ДМСО (0,5 М) и сахарозу (1 М).

Необходимо иметь в виду, что методы криосохранения до сих

пор остаются трудоемкими и дорогостоящими, однако "цели оп-

равдывают средства".

Охлаждение суспензионных, каллусных и различных органи-

зованных культур проводят обычно медленно (1—2°С в минуту),

меристематические ткани, напротив, охлаждают очень быстро (от

50° до более чем

1000°С

в минуту); также быстро проводят завер-

шающее охлаждение изначально медленно охлаждаемых образцов.

Материалом для первичного хранения образцов выбирают

стекло, полипропилен, фольгу. К сожалению, стекло разных сортов

нередко растрескивается, и поэтому оно уступает полипропилену

531

и фольге. Полипропиленовые ампулы с завинчивающимися крыш-

ками стерилизуют заранее отдельно или их поставляют в стериль-

ном виде. Из фольги готовят пакеты, поддающиеся стерилизации

в автоклаве. К сожалению, абсолютно надежный способ сохране-

ния любых образцов еще не разработан.

Глава 11.

ЗООБИОТЕХНОЛОГИЯ

Зообиотехнология является ветвью биотехнологии. Принципи-

альное отличие ее от микробной биотехнологии и фитобиотехно-

логии состоит в том, что объектами зообиотехнологии являются

клетки животных и человека. Наипростейшими животными суще-

ствами клеточной организации являются протозойные организмы,

или Protozoa (от греч. protos — первый, zoon — животное, живое

существа), составляющие самостоятельный отдел в царстве

Animalia (таблица 55).

Таблица 55. Представители царства Animalia

№№

п/п

Отдел

Protozoa

(простейшие)

Parazoa (губки)

Metazoa

(многоклеточные

гетеротрофные

животные)

Типы или классы

Типы: Acanthariae

—

акантарии, Ascetospora —

асцетоспоровые, Ciliophora —

реснитчатые, ' Cnidosporida —

книдоспоридевые, Mastigophora —

жгутиконосцы, Microsporida —

микроспоридевые, Opalinidomorpha —

опалинидоформные, Sarcodina —

ложноножки, Sporozoa — споровики.

Классы: Calcarea — известковые губки,

Demospongiae — обыкновенные губки,

Hexactinellida — кремниевые

шестилучевые губки.

Типы: Annelida

—

кольчатые черви, Arthropoda

—

членистоногие, Chordata

—

хордовые,

Coelenterata — кишечнополостные,

Echinodermata

—

иглокожие, Mollusca

—

моллюски, или мягкотелые, Nematoda

—

круглые черви, Platyhelminthes —

плоские черви.

532

Из 65 тысяч видов Protozoa 55 тысяч являются свободно живу-

щими в природе, а 10 тысяч ведут паразитический образ жизни.

Среди выделяемых ныне 9 типов простейших организмов

жгутиковым отводят место пограничных существ, являющихся

ближайшими предками многоклеточных животных и растений и

образующих мост между ними.

Поддержание Protozoa в культуре - дело достаточно сложное, •

однако многие виды удается выращивать на относительно простых

средах или на более сложных, рекомендованных для культивиро-

вания клеток и тканей животных (например, среда № 199 и др.).

Для некоторых протозоиных видов целесообразно добавлять в

среды споровые бактерии (Вас. subtilis) и/или дрожжи

(Saccharomyces cerevisiae и

др.).

Это обусловлено их фагоцитарной

активностью.

С биотехнологических позиций попеременный интерес был

проявлен к препаратам круцин (Н. Г. Клюева, Г. И. Роскин) и его

аналогу — трипанозе (Ж. Кудер, Ж. Мишель-Брэн и др.), получа-

емым с помощью Trypanosoma (Schizotrypanum) cruzi, астазилиду

(Н.

Н. Сухарева-Немакова)

—

полусинтётическому продукту, вклю-

чающему комплекс эфиров сахарозы и жирных кислот, выделен-

ных из жгутиконосца Astasia longa, полисахаридам. В доклиниче-

ских и клинических испытаниях они проявляли больший или

меньший противоопухолевый эффект. Однако из-за нестабильно-

сти клинических результатов, неосвоенности крупномасштабного

культивирования Protozoa и некоторых других причин зообиотех-

нология в этом разделе мало продвинулась вперед.

Из всех других представителей царства животных наибольший

интерес представляют хордовые. Их подразделяют на два подтипа

— бесчерепные (Protochordata, или Acrania) и черепные, или

позвоночные (Craniata, или Vertebrata).. Всех черепных объединяют

в следующие классы: Cyclostomata (круглоротые), Pisces (рыбы),

Amphibia (земноводные), Reptilia (пресмыкающиеся), Aves (птицы)

и Mammalia (млекопитающие).

Значимость представителей царства животных в зообиотехно-

логии далеко неравноценная. Это связано с теми обстоятельствами,

что во многих случаях еще не разработаны способы культивиро-

вания клеток не только в производственных, но и в лабораторных

условиях, или, как говорят, "еще не дошли руки" до конкретных

биообъектов животного происхождения, хотя техника однослой-

ной культуры клеток впервые разработана еще в 1950 г. Ф. К.

Роббинсом и Дж. Ф. Эндерсом.

533

В настоящее время в промышленном масштабе освоены лим-

фобласты человека, продуцирующие интерферон, клетки-гибри-

домы, образующие моноклональные антитела; монослойные кле-

точные культуры различных тканей, использующиеся, например,

для репродукции вирусов и т. д. Даже из этих немногочисленных

примеров можно заключить, что первостепенной задачей для

зообиотехнологических процессов является получение клеток и

клеточных культур.

11.1.

Способы выращивания клеток животных. Любые клетки

животного организма происходят из оплодотворенной яйцеклетки,

которая со временем развивается и дифференцируется (рис. 151).

Зародышевый диск вклю-

чает эктодерму, эндодерму

и мезодерму, из которых

впоследствии образуются

все ткани макроорганизма.

Но как только какую-либо

ткань перевести в культу-

ру, то наступает дедиффе-

ренциация клеток и разли-

чить их становится делом

трудным или невозмож-

Рис.

151.

Эмбрион млекопитающего на ран-

НЫМг и

поэтому регистра-

ней стадии развития: 1 — зародышевый диск, 2 ц

ИЮ

^ ведут ПОЧТИ ИСКЛЮ-

- эктодерма, 3 - эндодерма, 4 - первичнвя

чительно по

происхожде-

мезодерма, 5 - трофобласт.

нию HanpHMepi

д^

иссле

дования в области онкологии важны культуры раковых клеток, о

которых имеются сообщения в научной литературе. Такие клетки

получены от больных раком легкого и щитовидной железы. В 1986

г. в Японии впервые получен в культуре штамм клеток рака

желчного пузыря. Он был стабилен после 103 пассажей in vitro,

сохранил прежнее число хромосом в пределах

76—101.

Индуциру-

емый им опухолевый процесс и первичный рак желчного пузыря

оказались тождественными по гистограмме. Подобный штамм

оказался полезным при оценке противоопухолевых средств.

Любой штамм, представляющий определенную ценность для

научно-практического использования, должен иметь следующие

характеристики:

1) качество исходной ткани - нормальная или опухолевая (для

опухолевой необходим показатель доброкачественности или 3ATF

качественности),

534