Елинов Н.П. Основы биотехнологии

Подождите немного. Документ загружается.

Все этапы работы с куриными

эмбрионами после овоскопии

проводят в асептичных условиях

(см.

главу 6). Материалом для за-

ражения могут быть суспензия

растертой мозговой ткани (при-

менительно к вирусу бешенства),

печени, селезенки, почек (приме-

нительно к хламидиям орнитоза)

и т. д. В целях деконтаминации

_ .„ „ вирусного материала от бактерий

Рис. 156. Структурные части деся-

г]

г г

тидневного куриного

эмбриона:

-плод,

ил

в.

целях предотвращения его

2 - аллантоисная

полость,

з - хорионал- бактериального загрязнения

лантоисная оболочка,

4 - полость

амни-

можно использовать соответству-

ющие антибиотики, например,

пенициллин с каким-либо ами-

она, 5 - оболочка амниона, 6 - желточный

мешок, 7 - белочный мешок, 8 - воздуш-

ное пространство, 9 - скорлупа, 10 -

введение ви- ногликозидом порядка 150 ME

скорлупная оболочка, 11

русного материала в аллантоисную по

лость.

каждого на

мл суспензии виру-

сосодержащего материала. Для

борьбы с грибковым заражением

эмбрионов целесообразно воспользоваться некоторыми антибио-

тиками-полиенами (нистатин, амфотерицин В) или отдельными

производными бензимидазола (например дактарин и др.).

Чаще всего суспензию вирусного материала вводят в алланто-

исную полость или, реже, на хорионаллантоисную оболочку в

количестве

0,05-0,1

мл, прокалывая продезинфицированную скор-

лупу (например, иодированным этанолом) на расчетную глубину.

После этого отверстие закрывают расплавленным парафином и

эмбрионы помещают в термостат, в котором поддерживается

оптимальная температура для репродукции вируса, например 36-

37,5°С. Продолжительность инкубации зависит от типа и активно-

сти вируса. Обычно через 2-4 суток можно наблюдать изменение

оболочек с последующей гибелью эмбрионов. Зараженные эмбри-

оны контролируют ежедневно 1-2 раза (овоскопируют, поворачи-

вают другой стороной). Погибшие эмбрионы затем передают в

отделение сбора вирусного материала. Там их дезинфицируют,

аллантоисную жидкость с вирусом отсасывают и переносят в

стерильные емкости. Инактивацию вирусов при определенной

температуре проводят обычно с помощью формалина, фенола или

других веществ. Применяя высокоскоростное центрифугирование

18 т. 8524

545

или афинную хроматографию (см.), удается получать высокоочи-

щенные вирусные частицы.

Собранный вирусный материал, прошедший соответствующий

контроль, подвергают лйофильной сушке. Контролю подлежат

следующие показатели: стерильность, безвредность и специфиче-

ская активность. Применительно к стерильности имеют в виду

отсутствие: живого гомологичного вируса в убитой вакцине, бак-

терий и грибов. Безвредность и специфическую активность оце-

нивают на животных и только после этого вакцину разрешают

испытывать на волонтерах или добровольцах; после успешного

проведения клинической апробации вакцину разрешают приме-

нять в широкой медицинской практике.

На куриных эмбрионах получают, например, живую противо-

гриппозную вакцину. Она предназначается для интраназального

введения (лицам старше 16 лет и детям от 3 до 15 лет). Вакцина

представляет собой высушенную аллантоисную жидкость, взятую

от зараженных вирусом куриных эмбрионов. Тип вируса подби-

рают согласно эпидемиологической ситуации и прогнозам. Поэто-

му препараты могут выпускаться в виде моновакцины или дивак-

цины (напрмер, включающая вирусы А2 и В) в ампулах с 20 и 8

прививочными дозами для соответствующих групп населения.

Высушенная масса в ампулах обычно имеет светло-желтый цвет,

который сохраняется и после растворения содержимого ампулы в

прокипяченой остуженной воде.

Живые противогриппозные вакцины для взрослых и детей

готовят и для приема через

рот.

Такие вакцины представляют собой

специальные вакцинные штаммы, репродукция которых происхо-

дила в течение 5-15 пассажей (не менее и не более) на культуре

почечной ткани куриных эмбрионов. Их выпускают в сухом виде

во флаконах. При растворении в воде цвет из светло-желтого

переходит в красноватый.

Из других вирусных вакцин, получаемых на куриных эмбрио-

нах, можно назвать противопаротитную, против желтой лихорад-

ки.

Из прочих эмбриональных тканей используют эмбрионы мы-

шей или других млекопитающих животных, а также абортирован-

ные плоды человека.

Эмбриональные перевиваемые ткани доступны после обработ-

ки трипсином, поскольку в таких тканях еще не формируется

большого количества межклеточных веществ (в том числе небел-

546

ковой природы). Клетки разделяются и после необходимых обра-

боток их культивируют в специальных средах в монослое или в

суспендированном состоянии.

Ткани, изолируемые от животных после рождения, относятся

к разряду зрелых. Чем их возраст больше, тем с большим трудом

они культивируются. Однако после успешного выращивания они

затем "выравниваются" и мало чем отличаются от эмбриональных

клеток.

В целях репродукции вирусов особую роль сыграли почечные

и амниотические зрелые ткани. Из них первые получали от обезъ-

ян,

вторые

—

из амниотических оболочек от женщин-рожениц при

нормальных родах. Свежие почки от здоровых обезьян, например

макаки резус или африканских зеленых мартышек (сразу же после

экстирпации, от лат. extirpatio — полное вырезание, вылущение,

искоренение) декапсулируют, рассекают пополам, удаляют лохан-

ки,

нарезают паренхиматозную ткань на мелкие кусочки, трипси-

низируют и клетки (порядка 3

•

/мл) помещают в специальную

среду, термостатируют при 45°С в качающихся аппаратах. Спустя

сутки, культуру заражают, например, вирусом полиомиелита и

уже через 4-7 дней в надосадочной жидкости накапливается вирус.

Эту жидкость сливают, к ней добавляют формалин до получения

0,025%-й концентрации и смесь оставляют при 37°С на

дней для

полного обезвреживания

вируса.

После этого препарат подвергают

диализу с последующим контролем на отсутствие живых вирусных

частиц, токсичности, безвредности и на активность. Таков принцип

изготовления полиовакцины Дж. Солка. В случае приготовления

живых вакцин из ослабленных (аттенуированных) штаммов виру-

сов исключают' стадию обработки формалином. Так получают,

например, живую полиовакцину А. Себина (иммунологических

типов

И,Ш).

целях термостабилизации вакцины к ней добавляют

химически чистый магния хлорид. Вакцину выпускают в жидком

виде (по 5 мл) и в форме конфет-драже. Жидкая форма имеет

красновато-оранжевый цвет; цвет драже различен: розовый — для

первого иммунологического типа вируса, сиреневый

—

для второго

типа, голубой — для

третьего,

типа и белый — для смеси всех трех

типов.

Кроме полиомиелита специфическую профилактику живыми

вакцинами проводят при кори. Противокоревую живую сухую

вакцину изготавливают из вакцинного штамма, репродукция ко-

торого осуществлялась на клеточных культурах почек морских

свинок или фибробластах японских перепелок. Сухая вакцина

547

имеет желтовато-розовый цвет, который может сохраняться после

растворения ее в прилагаемом к упаковке растворителе. Выпуска-

ют во флаконах по 1,2,5 и 10 прививочных

доз.

После растворения

вакцину вводят в количестве 0,5 мл подкожно или по 0,1 мл

внутрикожно. Она предназначается для не болевших корью детей

в возрасте от 10 месяцев до 8 лет (по показаниям — до 14 лет).

Вакцина против клещевого энцефалита является формолвак-

циной, полученной из тканевой культуры фибробластов куриного

эмбриона и выпускаемом в жидком виде во-флаконах (по 10 мл)

или ампулах (по 5 мл) с гидроокисью алюминия (до 2 мг) в качестве

адсорбента или в лиофильно высушенном виде с желатином (до

1,5%),

и сахарозой (до 8%). Вакцину вводят подкожно (жидкую или

после разведения в дистиллированной воде сухого препарата).

По способам культивирования особое место занимает вирус

бешенства. Его репродукцию осуществляют на мозговой ткани

целостных организмов, используя для этого кроликов, крыс, овец.

А.

Пастер в 80-е годы XIX века выделил от больной собаки вирус

бешенства, и после ряда его пассажей через мозг кроликов он

добился того, что вирус приобрел свойства вызывать заболевание

у данных животных после определенного и постоянного инкуба-

ционного периода (4-6 дней). Такой вирус, в отличие от вируса

"уличного" бешенства, получил название Virus fixe (фиксирован-

ный вирус). Его-то и применяют для получения вакцин.

В целях профилактики бешенства используют сухие антира-

бические вакцины Ферми и МИВП. Первую из них готовят из

мозга овец возраста до

года, вторую — из мозга сосунков белых

крыс (возраст 4-8 суток) после заражения тех и других фиксиро-

ванным вирусом бешенства. Подобные вакцины представляют

собой суспензии мозговых тканей, содержащих указанный вирус.

В сухом виде вакцины выпускают в форме таблеток беловато-се-

рого цвета, которые суспендируют в прилагаемом растворителе

(дистиллированная вода) и сразу же вводят подкожно. Хранение

разведенных вакцин впрок запрещается.

Вакцина против краснухи содержит живой ослабленный (ат-

тенуированный, от лат. attenuare — уменьшать) вирус, репродуци-

ровавшийся на диплоидных клетках человека или на клетках почек

кролика. Используют для профилактики краснухи.

Клетки амниона человека должны быть получены не позднее

12 часов после родов. Для этого послед помещают в стерильный

контейнер без применения антисептиков и в ближайшие после

этого часы отделяют амнион от хориона, промывают специальным

548

солевым раствором и дважды последовательно трипсинизируют.

После этого клетки центрифугируют — примерно при 100д в

течение 10 минут, ресуспендируют осадок в среде и подсчитывают

образовавшиеся изолированные клетки (необходимо получить по-

рядка 106 клеток в

мл). Их суспендируют и переносят в большие

емкости до получения

клеток в

мл питательной среды, сменяя

ее каждые 5-7 дней. Полученные клетки можно использовать для

культивирования вирусов.

Перевиваемые опухоли животных, в частности, асцитные,

нашли широкое применение на практике. Они хорошо растут в

форме суспензии изолированных клеток в экссудате брюшной

полости, например, мышей и крыс. Опухолевые клетки размножа-

ются в асцитической жидкости, которую отсасывают из брюшной

полости с помощью шприца (или с помощью пипетки после

оперативного вмешательства). Такие клетки можно также выра-

щивать in vitro.

Перевиваемые опухоли животных представляют определенную

ценность при изучении противоопухолевых химиотерапевтиче-

ских

веществ.

Для выращивания опухолевых клеток могут оказать-

ся полезными так называемые кокарциногены — вещества, инду-

цирующие формирование опухолевой ткани, хотя сами не явля-

ются карциногенами. Среди известных кокарциногенов наиболее

сильным триггерным действием (от англ. trigger — спусковой

крючок, "собачка") обладает тиглиан — природный вторичный

метаболит у растений, относящихся к семействам Euphorbiaceae

(молочайные) и Thymelaeaceae (тимиановые). Он является природ-

ным сЪоооболом из толтпът тетрациклических дитерпенов с пер-

гидро-циклопропа-бензазуленовым

скелетом. В этом скелете содержится

7 хиральных атомов углерода, и, сле-

довательно, возможно существование

большого числа изомеров. Из всех

фороболов только производные 4(3-

форобола являются активными, но не

производные 4а стереоизомеров.

4р-форо л Предполагают, что их деградация про-

исходит замедленно и поэтому они

могут непрерывно активировать фермент протеинкиназу С. Это,

в свою очередь, стимулирует специфические протеазы, катализи-

рующие реакцию распада фермента с последующим серьезным

нарушением клеточной регуляции, сопровождающейся индукцией

549

опухолевого роста.

Необходимо также помнить, что фороболы еще стимулируют

клеточную пролиферацию, митогенез лимфоцитов, продукцию

простагландинов, дегрануляцию нейтрофилов, синтез ДНК, изме-

нения в свойствах мембран и др. Однако в связи с высокой

биологической активностью, эфиры форобола представляют опре-

деленную опасность для здоровья работающих

ними лиц. Поэтому

операторы должны надевать перчатки, защитные очки и прочую

одежду, чтобы защитить кожу и глаза от контакта с этими веще-

ствами.

Для инактивации эфиров форобола их необходимо растворить

в органическом растворителе, смешивающимся с водой, в равном

объеме

10%

водного раствора натрия гидроксида. Гидролиз эфиров

завершается в срок до одного часа выдержки, после чего щелочной

раствор становится безопасным.

Водные растворы эфиров форбола могут быть обезврежены

добавлением около 10

по объему натрия гипохлорита.

Способствует росту опухолевых клеток (-)-индолактам, являю-

щийся производным индола. Его эффективность в других биоло-

гических системах

различна*,

что может быть объяснено различным

аффинитетом к С-подтипам протеинкиназы; стереоизомер (+ )-ин-

долактам не обладает стимулирующим действием, но его можно

использовать в качестве субстанции для негативного контроля.

В таком же плане могут быть использованы новые, человече-

ского происхождения, гормоноподобные ростовые факторы: инсу-

лино-подобные (IGF

2),

тромбоцитарные (PDGF, от

англ.

Platelet

Derived-Growth-Factors), трансформирующие ростовые

(TGFoc

и р),

некроза опухолей (TNFoc).

IGF 1 — полипептид, состоящий из 70 аминокислотных остат-

ков,

спирально закрученный и удерживаемый в таком состоянии

благодаря трем S-S — мостикам между остатками цистеина (рис.

157).

Первый из них соединяет дисульфидной связью 6-й и 48-й

остатки, второй

— 18-й

и 61-й остатки, третий—47-й и 52-й остатки.

IGF 1 является пептидным гормоном, влияющим на рост и обмен

веществ организма после рождения. Его секреция находится под

влиянием уровня гормонов роста в сыворотке крови и характера

питания ребенка.. IGF

влияет на рост и дифференциацию многих

типов животных клеток, включая мышиные клетки — предшест-

венники эритроцитов последней стадии и эпителиальные клетки

млекопитающих, крысиные миобласты, олигодендроциты, клетки

черепа и клетки зобной железы; человеческие хондроциты и

550

адренергические нейробластные клетки.

Вариантом IGF 1 является укорочен-

ный на N-терминальный трипептид-моз-

говой

IGF,

изолированный из мозга плода

и взрослого человека. Этот пептидный

гормон важен для.роста и метаболизма

центральной нервной системы. Он в 4

раза сильнее IGF

по стимуляции синте-

Рисл57. полипептид

IGF-

за

нк в

фетальных мозговых клетках

1 (схема). крыс и более выраженно реагирует в

перекрестных реакциях с рецепторами

для IGF 1 на мембранах мозга у плода и взрослого человека.

IGF 2 — полипептид, состоящий из 67 аминокислот (ММ-7470).

Как и IGF 1 является сильным митогеном для многих клеток. Как

полагают, он — важный регулятор роста соматических клеток,

стимулирующий их размножение.

Тромбоцитарный ростовый фактор PDGF — гомодимерный,

мультифункциональный полипептид, который действует как силь-

ный митоген в отношении широкого набора эндотелиалъных кле-

ток фибробластов. Его рассматрвают как вещество, играющее

важную роль в восстановлении тканей и воспалении. PDGF —

хемоаттрактант для фибробластов, гладкомышечных клеток, моно-

цитов и нейтрофилов, что играет немаловажную роль в заживлении

ран.

В отвечающих на PDGF клетках индуцируются оборот фосфа-

тидилинозита, метаболизм простагландинов и активируются фос-

фолипазы.

человеческих фибробластах кожи, стимулированных

PDGF,

возрастает в три раза коллагеназная активность. Полагают,

что он принимает участие в трансформации клеток и вовлекается

в процесс атеросклероза.

Следует отличать PDGF от фактора активации тромбоцитов

(PAF,

от англ. platelet activating factor) — это фосфолипид, образу-

емый тромбоцитами, макрофагами, нейтрофилами и эозинофила-

ми под влиянием воспалительного стимула.

Он синтезируется из клеточ-

о ных мембран под влиянием фос-

/Ч,

—о—(сн ) —сн фолипазы А 2 вначале в форме

сн

V/ предшественника — lyso-PAF,

который затем превращается в

PAF под влиянием ацетил-транс-

феразы (этот же энзим катали-

RAF;

n может бы»

s или 17

зирует реакцию обратной транс-

формации PAF в lyso-PAF).

551

PAF — исключительно потентная субстанция. Она индуцирует

агрегацию тромбоцитов, будучи в фемтомолярных концентрациях

(10

После парентерального введения или вдыхания PAF вызы-

вает бронхоспазм и повышенную проницаемость микрокапилля-

ров;

количество кровяных пластинок и нейтрофилов в крови падает

при одновременном клеточном скоплении в легких. Введенный

внутрикожно он вызывает формирование пустулы и повышение

температуры при устойчивой клеточной инфильтрации. PAF обла-

дает сильным хемотаксическим эффектом, вызывая накопление

нейтрофилов и эозинофилов, активирует их в плане образования

других воспалительных компонентов (супероксидных анионов (¾

и эйкозаноидов).

С20Н11СООН; CHj-fCH^- СН -СН- СН

- СН= СН - СН

- СН= СН -СН

эйкозанкарбоновая HOOC-fCHj)^-СН = СН

эйкозантетраеи-5,8,11,14-овая кислота

(арахидоновая кислота)

кислота

Ингалированный PAF повышает экскрецию лейкотриёнов с

мочой, возможно потому, что он стимулирует повышенное накоп-

ление их в легких как медиаторов воспаления. Леикотриены ранее

называли "медленно реагирующими субстанциями" при анафилак-

сии (SPS-A).

соон

—CO-NH—СН

—С ООН

NH—СО—(СН

)

—СН—СООН

„CsH.

л«йкотриен В 4

СООН

S—СН

—СН—СО

—NH—СН,—СООН

NH-,

СООН

-СООН

мйкотрааи

Од

TGF — гормоноподобные вещества, которые могут индуциро-

вать временный неопластический рост и дифференциацию нор-

мальных клеток. Фибробласты в среде с TGF не нуждаются затем

в субстрате для роста и не отвечают на межклеточные контакты.

После удаления

TGF

из культуральной среды клетки возвращаются

к нормальному росту.

TGFa близко родственен эпидермальному ростовому фактору

(EGF) благодаря обладанию тем же клеточным рецептором.

552

TGFa — одиночный полипептид, содержащий 50 аминокислотных

остатков; он взаимодействует с тем же рецептором, что и EGF и

проявляет такую же потенцию в индуцировании тирозин-киназной

активности, связанной с EGF-рецептором. TGFa, в отличие от EGF,

"запускает" эмбриогенез и активацию протоонкогенеза в течение

регенерации поврежденных тканей.

TGFP — кислотостойкий полипептид, состоящий из двух иден-

тичных субъединиц со 112 аминокислотами в каждой. Его ММ-25

кДа; изолированы TGF|3 —

1и2с71%

гомологией между ними и

сходной функциональной активностью. В частности,

TGFp*

играет

важную роль в генезе опухолей, развитии эмбриона, тканевой

репарации и иМмунорегуляции. TGFp — ингибитор роста для

большинства типов клеток, но может стимулировать образование

внеклеточных матриксных белков типа фибронектина и коллагена.

TGFa и

выступают синергистами при трансформации различных

клеточных линий.

регуляции поведения клеток важную роль отводят семейству

из четырех синдеканов, являющихся поверхностными протеогли-

канами клеток. Из них более детально изучен синдекан- 1. В

его так называемом внешнем домене, или эктодомене содержатся

ковалентно связанные цепи гликозаминогликанов, состоящие пре-

имущественно из гепарансульфата, а также из хондроитинсульфа-

та. Синдекан - 1 селективно связывает различные внеклеточные

матриксные молекулы через его гепарансульфатные цепи. Одно-

временно он может связывать ростовые факторы и выступать

вектором сайта стимуляции роста; здесь (в месте взаимодействия

синдекана-1 с матриксом) иммобилизуется рецепторный комплекс

для тирозинкиназы (рис. 158).

• (а) (6) <У .

Рис.

158. Внеклеточный матрикс (а): ЭЦМ — экстрацеллюлярный матрикс, БМ

—

базальная мембрана, содержащая коллаген типа IV и ламинин, КН

—

коллагеновые

нити 1 типа, ФН — фиброниктин, ФБ — фибробласт; селективное связывание

внеклеточных матриксных молекул синдеканом-1 (б): 1 - фибронектин, 2 - фиброб-

ластный ростовой фактор - ФРБ, 3 - интегрин, 4 - протеогликан - синдекан, 5 -

рецептор ФРФ на тирозин -киназном комплексе, 6 - гепарансульфатные цепи, 7 -

димеризация рецепторов ФРФ, 8 - внутриклеточное фосфорилирование с последу-

ющим индуцированием сигнала, 9 - эффектор, 10 - клеточная мембрана, 11 -

структуры цитоскелета (по М. Ялканену, К. Элениусу и А. Раприджеру, 1993).

553

Плазматические клетки и ряд человеческих В-клеточных опу-

холевых линий экспрессируют синдекан-1 преимущественно в

виде гепарансульфат-протеогликана. Способность В-клеточных

ли-

ний связывать фибронектин и фибриллярные коллагеновые мат-

рицы четко коррелирует с их экспрессией синдекана-1 на клеточ-

ной поверхности. Экспрессия этого протеогликана также сопря-

жена с пролиферацией клеток и, как предполагают, с малигниза-

цией их (от лат. malignus — злокачественный).

Кроме стимуляции роста синдекан-1 также участвует в регуля-

ции морфологии клетки благодаря содействию организации эле-

ментов цитоскелета, прежде всего, эпителиальных клеток.

Менее изученными гепарансульфат-протеогликанами являют-

ся синдекан-2 (фиброгликан), синдекан-3 (N-синдекан) и синдекан-

4 (риудокан, амфигликан). Последнему приписывают внутрикле-

точную функцию возможного связывания других мембранных

белков или цитоскелета.

Более "многоликим" представляется TNPa — полипептид с ММ

17 кДа. Он — медиатор воспаления и играет выдающуюся роль в

патогенезе эндотоксического шока, вызванного грамотрицатель-

ными бактериями. TNPa стимулирует активность коллагеназы и

продукцию простагландина Е

синовиальными клетками, актив-

ность остеокластов и резорбцию костной ткани, способствует

ангиогенезу, стимулирует пролиферацию фибробластов, индуци-

рует высвобождение ИЛ

и 6, PDGF. Вместе с тем, он — цитоток-

сический и цитостатический ингибитор опухолевого роста, вовле-

кается в патологические процессы типа раковой кахексии, или

истощения (от греч. kakos — плохо, oexis — состояние) и цереб-

ральной малярии (от

лат.

cerebrum — головной мозг). Установлено,

что убитые клетки Staphylococcus aureus стимулируют продукцию

TNFa в культурах мононуклеарных фагоцитов или моноцитов

крови человека. Предварительная обработка клеток бисбензили-

зохинолиновым алкалоидом тетрандрином подавляет эту продук-

цию.

Поэтому высказано предположение о том, что тетрандрин

можно использовать для лечения воспал ительных заболеваний, при

которых TNFa играет основную роль.

С добавлением или без добавления фороболов и ростовых

факторов клетки опухолей теряют присущий нормальным клеткам

фибронектин, округляются и в таком виде продолжают размно-

жаться и существовать в ряду поколений. Привнесение к ним извне

фибронектина сопровождается восстановлением их способности

554