Елинов Н.П. Основы биотехнологии

Подождите немного. Документ загружается.

2) тип ткани — эмбриональная или зрелая,

3) принадлежность ткани — вид животного,

4) источник ткани — орган,

5) тип клетки (если известно),

6) наименование штамма (буквенное — не более

букв и серия

цифр нумерации),

7) номер клона, если штамм клонировался,

8) источник информации (ссылка на оригинальную публика-

цию).

Все способы выращивания клеток животных могут быть соот-

несены либо к интактным (нетрансформированным с помощью

вирусов), либо к вирусотрансформированным клеткам. Успех куль-

тивирования первых во многом обусловлен наличием и плотностью

адгезинов, благодаря которым они проявляют эффект "заякорива-

ния" на подлежащей поверхности стекла, металла или пластика.

Однако такие клетки не растут в суспензионных культурах.

Вирусотрансформированные клетки животных, напротив, хо-

рошо растут в виде суспензионных культур и хуже или совсем не

растут в адгезированном состоянии.

Имеются такие штаммы животных клеток, которые могут расти

и в прикрепленном состоянии, и в виде суспензии. Прикрепивши-

еся клетки размножаются, растут и развиваются до тех пор, пока

не сольются в монослой, то есть плотность клеток выступает

тормозным сигналом. Однако при смене питательной среды на

новые порции наблюдается дальнейшее разрастание клеток в

форме нескольких слившихся слоев. Подобного результата можно

добиться при использовании других факторов воздействия на

клеточные культуры (гормоны, ферменты, рН и

т.

д.).

Тем не менее,

на практике широко пользуются монослойными культурами.

11.1.1.Глубинное выращивание клеток

монослое. Рост клеток

в виде монослоя зависит от адгезивных белков — фибронек-

т и н о в (от лат. fibra — нить, nectere — связывать или соединять),

обеспечивающих межклеточную адгезию, прикрепление клеток к

подложке и направляющих их перемещения.

животном организ-

ме клетки, способные к перемещениям (особенно в период эмбри-

онального развития, при заживлении ран), и связанные с базаль-

ными мембранами, содержат на своей поверхности крупномоле-

кулярные гликопротеиновые молекулы фибронектина, открытого

535

в 1973 г. Р.О.Хайнсом (Англия), К. Гамбергом и С.-И. Хакомори

(США) при изучении нормальных и опухолевых клеток. Фибро-

нектин, полимеризуясь, образует длинные нити вокруг клетки,

которые контактируют с клеточной мембраной и связываются с

цитоскелетным белком-актином (см.). Топология фибронектина в

экстрацеллюлярном матриксе схематично представлена на рис.

158.

Молекула фибронектина состоит из двух субъединиц с ММ

около 250 кДа, содержащих небольшие по размеру домены и

соединенных на одном конце двумя S—S-мостиками. Размеры

одной субъединицы 60—70x2—3 нм; на эту длину приходится от

2145 до

2445 остатков аминокислот. Каждый домен отвечает за одну

функцию фибронектина, например, за соединение с фибрином,

другой домен — за прикрепление к пластику и т. д. (рис. 152).

Доказано, что

фибронектин имеет-

ся у всех представи-

телей царства

Animalia. Амфотер-

ный гликопротеин-

фибронектин в изо-

лированном виде вы-

раженно стимулиру-

ет адгезию, если ДО-

Рис

152.

Схематичное изображение молекулы

фиб-

бавлять его К пита-

ронектина с доменами, обеспечивающими связь с фиб-

TeAbHQ

еде

в КО

н-

рином (1), с коллагеном (2), с клеткой (3).

центрации порядка

1—5 мкг/мл. Амфолит в данном случае выступает мостиком между

отрицательно заряженной поверхностью животной клетки и суб-

стратом, несущим отрицательный или положительный заряд. Сво-

бодная энергия поверхности твердого носителя может быть высо-

кой (чистые поверхности стекол, металлов, металлических окислов)

или низкой (поверхности из органических полимеров), хотя понят-

но,

что при соответствующих обработках низкоэнергетические

поверхности трансформируются в высокоэнергетические.

В качестве связующих мостиков можно применять ионы каль-

ция или магния (рис. 153).

536

клетка

дрот

подложка

I l i I i I

! ! ГО ' ГА1

подложка

АС

а б

Рис.

153. Механизм адгезии животной клетки к субстрату (например, к

подложке), несущему положительные (а) и отрицательные (б) заряды (А

—

гликоп-

ротеиновый адгезии, стрелки — электростатические взаимодействия, пунктиры —

связывание при участии двухвалентных катионов; АС — адсорбционный слой,

равный приблизительно 5 нм).

Наряду с плотностью заряда в прикрепляемое™ клеток боль-

шое значение имеют характеристики субстрата: гидрофильность

его поверхности (смачиваемость), протяженность и горизонталь-

ность. Распластываемость клеток на подложке будет выше, если

число отрицательных зарядов оказывается не ниже 5 на площади

10 нм

. Адгезивные свойства более выражены для смачиваемых

поверхностей в сравнении с гидрофобными, по протяженности

они должны быть больше нормальной длины клеток; субстраты с

искривленной поверхностью хуже гладких — растущие клетки

распространяются в направлении наименьшей кривизны субстра-

та (здесь существен вклад цитоскелета, см.). Если, например,

прикрепление клеток к агар-агару принять за единицу, то к тефлону

они прикрепляются в 5 раз лучше, к полиэтилену — в 8 раз, к

полипропилену — в 9 раз, к резине — в 12 раз, к алюминию — в

15 раз, к стеклу — в 16 раз, а к стали и полистирену — в 20 раз.

В 1993 г. поступил на рынок пронектин

— продукт белковой

инженерии, созданный в Великобритании. Он напоминает ранее

названный фибронектин, но пронектин F включает

мест связы-

вания на молекулу (в сравнении с нормальным комплементом). Его

потенциал к клеточной адгезии в 13 раз выше потенциала фибро-

нектина, полученного от млекопитающих. Пронектин F рекомен-

дуют для выращивания клеток в бессыворочных средах.

Крупномасштабное культивирование животных клеток в мо-

нослое нацелено на получение наибольшей концентрации клеток

в наименьшем объеме газовой фазы.

537

Выбор клеток не столь велик, но некоторые из них вполне

адаптированы к условиям выращивания in

vitro.

В 1964 г. впервые

были получены линии соединительнотканных клеток — фиброб-

ластов ВНК 21 от сирийского хомяка. Эти клетки пассируются

неограниченно долго и первоначально использовались для репро-

дукции вируса ящура для приготовления соответствующих вакцин.

Следует иметь в виду, что нормальные диплоидные клетки челове-

ка, например, линии

WI-38,

могут делиться ограниченное число раз

(50 + 10) и проявляют феномен старения (см. раздел 3.2.4.). В то

же время такие клетки, как HeLa, выделенные из раковой опухоли

шейки матки человека, оказались бессмертными при пассирова-

нии.

При доступности донорской ткани используют клетки почек

кроликов, обезьян, собак (линия МДСР), 10—14-дневных куриных

эмбрионов, клетки из миндалин, амниона, легких эмбриона чело-

века 12—16-недельного возраста, клетки эпидермиса взрослого

человека, мышиные фибробласты (линия

LS),

диплоидные фиброб-

ласты человека (линия MRC-5) и другие.

Выбранные клетки выращивают в строго, асептичных условиях

в специальном оборудовании

(см.

главу

при медленном вращении

роллерной системы или покачивании для омывания большей пло-

щади культуральной среды. Клетки то погружаются в жидкую

•

фазу, то в газообразную. При этом с избытком обеспечиваются их

дыхательные потребности в кислороде.

Во время цикла культивирования клеток должны учитываться

разные параметры. Одни из них относятся к числу константных,

другие

—

к числу вариабельных. Константными являются качество

материала, форма и объем культиватора, вариабельными — ско-

рость вращения или покачивания, качество и объем среды, тип

клеток и размер (величина) посевного материала, рН и температура

среды, снабжение кислородом и содержание С0

в культиваторе,

окислительно-восстановительный потенциал и концентрация ос-

новных источников питания. Первые три вариабельных показателя

можно поддерживать постоянными, переводя их в разряд констан-

тных.

Естественно ожидать, что среды для клеток животных должны

отличаться от сред, используемых, например, для прокариот. На

начальных этапах развития зообиотехнологии обязательным было

добавление сывороток к средам, применяемым в лабораторных и

производственных условиях. Сыворотки обеспечивали клетки не-

обходимыми гормонами (глюкокортикоиды, инсулин, половые гор-

538

моны, простагландины и

др.)*

ростовыми факторами (эпйдермаль-

ным, фибробластным, Т-клеточным, тромбоцитарным, опухоленек-

ротическим и др.), факторами адгезии (коллаген, фибронектин,

ламинин*), белками (альбумин, трансферрин, фетуин**), микроэле-

ментами и липидами, для выживания in vitro. Обычно используют

фетальную бычью сыворотку (ФБС). Высоким качеством отлича-

ются сыворотки, рекомендуемые фирмой Sigma

(США).

Некоторые

из них по качеству (для отдельных линий клеток) превосходят ФБС,

например, сыворотка крови новорожденных телят в возрасте до

дней и менее, сыворотка от телят возраста менее 10-месячного,

лошадиная сыворотка от жеребцов, кастрированных за год до

взятия крови.

Вместо натуральных сывороток фирма IBF biotechnics (Герма-

ния) предлагает высококачественные заменители, в частности,

ultroser G — для иммобилизованных клеток. Эта среда содержит

мало белка, благодаря чему упрощается очистка биопродукта и

достигается стабильность компонентного состава.

Оптимальные показатели рН и температуры зависят от проис-

хождения и качества клеточных линий. Так, для клеток млекопи-

тающих концентрацию водородных ионов поддерживают в преде-

лах рН от 7,2 до 7,4, а температуру — в пределах + 36—+ 37,5°С.

Поддержание рН осуществляют обычно за счет буферных систем

[(С0

—NaHC0

), трис- и др.], а температуру— с помощью термо-

регуляторов.

Контроль за развитием клеток проводят с помощью прямых

(подсчет) и непрямых методов (по мутности, по подсчету ядер, по

определению общего белка).

Посевной материал (инокулят, от

лат.

inoculatio — прививание)

заметно сказывается на скорости роста клеток в монослойной

культуре. В случае применения первичных клеток необходимо

иметь их в более высокой плотности на

см

внутренней (рабочей)

поверхности культиватора.

Если же используют клеточные линии (а не первичные клетки),

то плотность инокулята может быть несколько меньшей, так как

они почти все 100% адгезируются на поверхности культиватора.

* ламинин получают из базальной мембраны мышиной саркомы Englebreth-

Holm-Swarm;

" трансферрин — плазменный белок теплокровных животных и человека,

содержащий железо. Фетуин — белок из сыворотки плода теленка, содержащий

около 0,2% свободной N-ацетилнейраминовой кислоты.

539

Покачивание или вращение омываемых средой клеток несомненно

сказывается на их прикреплении.

11.1.2.

Глубинное выращивание клеток

суспензионных куль-

турах. Площадь выращиваемых клеток можно существенно уве-

личить при использовании микроносителей, суспендируемых в

питательной среде и на поверхности которых клетки закрепляются,

а затем разрастаются в виде монослоя. Такие суспендированные

микроносители с клетками моделируют глубинные культуры, на-

пример, микроорганизмов. Следовательно, в таких системах со-

вмещаются монослойные и суспензионные культуры животных

клеток.

В качестве микроносителей применяют положительно заря-

женные ДЕАЕ-сефадексы, сефадексы с коллагеновым покрытием,

отрицательно заряженный полистирол, полые стеклянные сферы

и др. Так, например, отдельные фирмы предлагают микросферы

из пористого шлачного стекла (рис. 154), которые могут быть

использованы для иммобилизации клеток млекопитающих. Поры

их доступны для пенетрации (от лат. penetratio — проникновение)

клеток внутрь матрикса, облегчая трехмерную колонизацию внут-

ренней поверхности носителя, что способствует взаимодействию

метаболизирующих соседствующих клеток и поддержанию их

возросших жизнеспособности и продуктивности. Пористые сферы

пригодны для иммобилизации прилипающих и суспензионных

клеток (например, гибридом).

Рис.

154.

Микросферы для иммобилизации клеток млекопитающих из микро-

пористых, биологически инертных, стекла (а) и стеклошлака (так называемого

Cultispher-G) (б) увеличение хЮООО.

540

Рекомендуемый размер сферических микроносителей порядка

200± 25 мкм оценивают оптимальным с удельной плотностью

1*,03.

Требуемое количество их примерно равно

мл, а для инокуляции

необходимо порядка 10

клеток. При увеличении количества мик-

роносителя возрастает доза клеток в инокуляте.

Подход к выбору сред и контролируемого параметра культи-

вирования остается прежним. Клетки после выращивания отделя-

ют от микроносителей центрифугированием (в том числе — в

градиенте плотности), фильтрованием,

или,

чаще,

обработкой трип-

сином с последующими промыванием и сепарированием.

Суспензионные клетки на микроносителях применяют в целях

получения вирусных вакцин (против бешенства, полиомиелита,

ящура).

Возможности переноса генетической информации из эукари-

отических клеток в прокариотические сняло проблему массового

культивирования животных клеток для получения таких продук-

тов,

как интерферон, гормоны, лимфокины и другие. Здесь успеш-

но развивается рДНК-биотехнология.

Клеткам животных в глубинных культурах .почти во всех

случаях требуется защитная матрица, функцию которой берут на

себя белки сыворотки крови, добавляемой в среду культивирова-

ния. Этим еще раз подтверждается более высокая ранимость

животных клеток по сравнению с микробными и растительными

клетками. Тем не менее, основные подходы к выбору оборудования

и к реализации биотехнологических процессов с использованием

животных клеток во многом аналогичны с таковыми в микробной

биотехнологии. Например, системы культивирования в обоих слу-

чаях могут быть хемо- или турбидостатными, циклическими, не-

прерывными или полунепрерывными.

В противоположность суспензионным культурам клеток на

микроносителях разработаны способы инкапсулирования их в

полимерные сферы (полилизиновые, агарозные, из полимерных

смол),

когда клетки, по-существу, не испытывают того механиче-

ского напряжения, которое они должны проявлять в свободном

виде. Эти способы оказались выгодными для культивирования

гибридом в целях получения моноклональных антител. Диаметр

микрокапсул, размер пор в них и их толщина могут быть незави-

симо проконтролированы в процессе изготовления и оптимизиро-

ваны для конкретного типа гибридом. Например, согласно данным

фирмы Damon Biotech (Германия) гибридомные клетки человека

или животных вначале суспендируют в биосовместимом растворе

541

натрия альгината. Образовавшиеся капельки затем пропускают в

раствор кальция хлорида, где они становятся желированными

микросферами. На поверхности таких сфер затем формируют

полилизиновую мембрану. После этого гель разжижают, оставляя

гибридомные клетки в нормальном физиологическом состоянии

внутри "дырчатых" микросфер.

процессе культивирования таких

инкапсулированных гибридом продукция моноклональных анти-

тел возрастает в сотни-тысячи раз по сравнению с обычным

культивированием гибридомных клеток. После завершения био-

синтеза антител микрокапсулы подвергают диализу для удаления

примесных веществ, а затем физически их "раскрывают", гибри-

домные клетки и фрагменты капсул легко сепарируются от иско-

мых моноклональных антител, которые могут быть подвергнуты

дальнейшей очистке или использованы по назначению. Схема

описанных процедур представлена на рис. 155.

Полилизиновая мембрана

обеспечивает диффузию неболь-

ших молекул питательных ве-

ществ внутрь микросфер, но не

позволяет выходить иммунным

глобулинам. Кроме физического

удаления полилизиновой мембра-

ны можно воспользоваться фер-

ментативным гидролизом.

В описанные микросферы

возможно инкапсулировать не

только клетки, но и ферменты,

индукторы каких-либо процессов,

а также мультисистемы.

Таким образом, глубинное вы-

ращивание животных клеток реализуют в трех вариантах:

1) монослой клеток статичен, культуральная среда подвижна,

2) среда культивирования статична, монослой клеток подвижен,

3) клетки (например, на микроносителях, в мйкросферах) и

среда культивирования подвижны. Эти варианты выращивания

клеток должны приниматься в расчет при выборе или проектиро-

вании соответствующего оборудования.

11.1.3.

Другие способы выращивания клеток. В настоящее

время в опытно-промышленных условиях получают интерферон,

542

о о°

о о

Рис.

155. Получение моноклональ-

ных антител с помощью инкапсулиро-

ванных клеток гибридомы (схема): 1 —

клетки-гибридомы,

— клетки-гибридо-

мы в растворе натрия альгината, 3 —

клетки-гибридомы в желированном

рас-

творе натрия альгината, покрытые пол-

илизиновой мембраной,

4 —

клетки-гиб-

ридомы, в "дырчатых" микросферах, 5

— антитела и клетки-гибридомы после

разрушения полилизиновой мембраны.

выращивая лимфобласты человека в виде отъемно-доливных куль-

тур,

то есть когда определенная часть клеточной суспензии заме-

щается свежей средой, например, ultroser HY (Германия), а оста-

ющаяся часть "старой" культуры выполняет роль инокулята.

Интерфероны можно получать в периодической культуре, ког-

да часть ее отбирают через определенные интервалы времени при

непрерывной подпитке свежей питательной средой и при посто-

янной скорости ее подачи. Тогда объем культуры прогрессивно

возрастает, равно как прогрессивно снижаются скорости ее роста

и разбавления.

Как бы долго не удавалось поддерживать клетки в циклических

культурах с подпиткой, в конечном итоге они погибают и весь цикл

приходится начинать сначала.

Неопределенно длительное время можно выращивать клетки

млекопитающих в непрерывных хемостатных культурах, когда

удается добиваться постоянства концентрации лимитирующего

субстрата и плотности клеток (см. главу 7). Теория и практика

непрерывного культивирования впервые сформулированы в 1950

г. Ж. Моно, и, независимо от него, А. Новиком и Л. Сцилардом,

предложившими термин "хемостат".

хемостатах скорость подачи

свежей среды и отбора культуры равны (как и объем

их).

Скорость

роста, развития и размножения клеток контролируется скоростью

подвода лимитирующего компонента, а численность

—

его концен-

трацией. В качестве лимитирующего рост агента чаще всего ис-

пользуют глюкозу, реже — фосфат и другие вещества. При

правильном подборе условий выращивания в хемостатах удается

на порядок увеличить выход клеток по сравнению с периодическим

культивированием. Причем, хемостатные культуры отличаются

накоплением физиологически однотипных клеток. Это можно

показать на примере с клетками лейкемии мышей — L 1210

(таблица 55), которые засевали (инокулят) в концентрации 2« 10

клеток/мл для периодического культивирования, длившегося 3

суток до получения максимальной плотности 2,5

•

клеток/мл

(суспензионные культуры). При хемостатном культивировании

скорость подачи среды и отъема культуры составляла 0,3 сут"

543

Т а б л и ц а 55. Накопление клеток

1210 при периодическом и непрерывном

культивировании (по М. Ж. Тови, 1985)

Способ

выращивания

Периодический

Непрерывный

(хемоетатный)

Объем

среды,л

0,3

Урожайность клеток

на

1 мг

глюкозы

х10

3,5

6,2

мкг

524

60!

на

мл

среды

х 10

2,3

6,2

в неделю

1,38-10

1,12 -Ю

Естественно, что время, затрачиваемое на подготовку смежных

циклов

и их

реализацию

при

периодическом культивировании,

является непроизводительным.

11.2.

Эмбриональные

другие ткани

для

репродукции вирусов

и получения вирусных вакцин.

Из

эмбриональных тканей наибо-

лее широко используемыми являются эмбриональные ткани цып-

ленка, мыши и человека. Особенной выгодой отличаются куриные

эмбрионы (по доступности) десяти-двенадцатисуточного возраста,

используемые преимущественно

для

репродукции вирусов

и по-

следующего изготовления вирусных вакцин. Куриные эмбрионы

введены

вирусологическую практику

1931

г.

Г.

М.

Вудруфом

Е. У. Гудпасчером. Такие эмбрионы рекомендуют также для выяв-

ления, идентификации

определения инфицирующей дозы виру-

сов,

для получения антигенных препаратов, применяемых

серо-

логических реакциях.

Инкубированные

при

38°С куриные яйца овоскопируют (про-

свечивают), отбраковывают, "прозрачные" неоплодотворенные эк-

земпляры и сохраняют оплодотворенные, в которых хорошо видны

наполненные кровеносные сосуды хорионаллантоисной оболочки

и движения эмбрионов.

Заражение эмбрионов можно проводить вручную

автомати-

зированно. Последний способ применяют

крупномасштабном

производстве, например, противогриппозных вак-

цин. Материал, содержащий вирусы, вводят

помощью

шприца (батареи шприцов)

различные части эмбриона (эмбрио-

нов) (рис.

156).

544