Хаусман К., Хюльсман H., Радек Р. Протистология

Подождите немного. Документ загружается.

378 Избранные главы общей протистологии

градиентными сигналами. Каждая

структура закладывается в том месте,

которое предопределено величиной

сигнала и, соответственно, удаленнос-

тью от его источника. Эта модель хоро-

шо объясняет формирование паттерна у

Tetrahymena, а также у разноресничных

и брюхоресничных инфузорий. Вторая

гипотеза основана преимущественно

на работах с Paramecium. Согласно

этой гипотезе, поверхность клетки раз-

делена на достаточно четко очерченные

зоны, которые обособлены по молеку-

лярным и структурным характеристи-

кам. Кинетосомы и связанные с ними

цитоскелетные элементы предположи-

тельно играют важную роль в размеще-

нии вновь образованных структур.

Сможет ли одна модель объяснить все

явления формирования паттерна у ин-

фузорий, покажут дальнейшие исследо-

вания.

Молекулярная биология 379

Молекулярная биология

(Гюнтер Штайнбрюк)

В настоящее время значительно

усовершенствованы методы ведения

культур, например, культивируются

даже такие организмы, как паразити-

ческие трипаносомы и малярийный

плазмодий. Вместе с тем, метод поли-

меразной цепной реакции (ПЦР) позво-

ляет проводить многие молекулярно-

биологические исследования, имея в

наличии всего одну клетку. Эта методи-

ка дает возможность получить милли-

оны копий определенного участка ДНК.

При этом нам достаточно знать всего

несколько пар нуклеотидов в начале и

в конце выбранного участка генома,

который может насчитывать более

10 ООО пар нуклеотидов. Информация о

таких фланкирующих последовательно-

стях необходима для искусственного

синтеза олигонуклеотидов, которые

служат праймерами для синтеза ДНК in

vitro. Метод ПЦР крайне чувствителен:

одна-единственная молекула ДНК в

пробе может стать основой для высоко-

специфичной реакции амплификации.

Внедрение этого метода позволило ре-

шить многие проблемы молекулярной

биологии и достичь значительных успе-

хов в понимании молекулярных ме-

ханизмов. В будущем молекулярные

исследования протистов выведут на об-

наружение новых феноменов и будут

вносить все более весомый вклад в ре-

шение общих молекулярно-биологиче-

ских проблем.

В последние десятилетия было по-

казано, что по сравнению с высшими

организмами протисты демонстрируют

поразительное многообразие не только

в морфологии и экологических адапта-

циях, но также в биохимических и мо-

лекулярных механизмах. Развитие мо-

лекулярно-биологических методов и

интенсивное изучение протистов оказа-

лось взаимообогащающим:

• Несколько видов протистов стали

модельными объектами в молекулярно-

биологических исследованиях эукариот.

• Обнаружение уникальных моле-

кулярных особенностей, присущих не-

которым группам протистов, принципи-

ально изменило наше понимание путей

молекулярной эволюции.

В этой главе представлены наибо-

лее яркие открытия молекулярной био-

логии протистов.

Вариабельные

поверхностные

гликопротеины

трипаносом

Африканские трипаносомы

вызы-

вают такие серьезные заболевания, как

сонная болезнь человека и нагана круп-

ного рогатого скота. Жизненный цикл

наиболее исследованного вида Trypano-

soma brucei состоит из нескольких пос-

Их часто называют секция Salivaria или саливарные трипаносомы. —

Прим. ред.

380 Избранные главы общей протистологии

ледовательных стадий (см. рис. 51). У

млекопитающих паразит обитает пре-

имущественно в кровеносной системе.

Когда муха це-це поглощает жгутико-

носцев при кровососании, паразиты

дифференцируются в так называемые

проциклические формы. Поверхность

клетки у такой трипаносомы покрыта

единственным типом гликопротеина —

проциклином. Затем паразиты переме-

щаются из задних отделов кишечника в

слюнные железы мухи, где они превра-

щаются в неделящиеся метацикличе-

ские формы.

Муха це-це инфицирует млекопита-

ющее метациклическими формами три-

паносом со слюной при кровососании.

Поверхность клетки этой формы пара-

зита покрыта «вариабельными поверх-

ностными гликопротеинами» (variant

surface glycoproteins — VSG). В этот

момент у паразита обнаруживается

лишь 14 или около того гликопротеи-

нов, причем отдельная особь несет

только один VSG. Замена одного гли-

копротеина на другой у этих форм про-

исходит очень быстро. Таким образом,

«шуба» из VSG преадаптирует метацик-

лических трипаносом к обитанию в

млекопитающем-хозяине. Уже находясь

в кровяном русле млекопитающего, па-

разит единовременно экспрессирует

одну из 1000 или более имеющихся у

него копий VSG гена.

В млекопитающем паразиты под-

вергаются атаке со стороны иммунной

системы хозяина. Стратегия ухода от

иммунной атаки состоит в изменении

антигенных свойств шубы гликокалик-

са. Новые VSG экспрессируются с ча-

стотой 10~

-10~

на одно деление клет-

ки. Иммунная система хозяина перио-

дически сталкивается с новыми анти-

генными эпитопами разделившихся

клеток, поэтому заражение проявляет-

ся в виде характерных паразитемиче-

ских волн. Иммунная система успеш-

но истребляет большинство паразитов,

но те клетки, которые при делении

изменили VSG гликокаликса, ускольза-

ют от иммунного ответа и вызывают

вспышку следующей паразитемичес-

кой волны.

Молекулярные механизмы, стоящие

за изменчивостью VSG, изучались весь-

ма интенсивно и относительно неплохо

известны. Замена антигена осуществля-

ется различными путями. Упрощенная

схема, иллюстрирующая два наиболее

часто встречающихся, приведена на

рисунке 327. Геном Т. brucei состоит

примерно из 20 больших и 100 мини-

хромосом. В них обнаружено более

1000 различных, транскрипционно пас-

сивных копий гена VSG. Эти копии тан-

демами расположены во внутренних,

удаленных от теломер, участках хромо-

сом

. Несколько сайтов экспрессии ге-

на VSG располагаются субтеломерно.

О сайтах экспрессии будет сказано

ниже. Транскрибируется всегда только

одна из VSG-копий, находящихся в суб-

теломерной позиции (ELC-VSG см. рис.

327). В этой связи интересно отметить,

что была обнаружена необычная моди-

фикация ДНК в генах VSG: в ДНК

Т. brucei был обнаружен 3-глюкозил-

гидроксиметилурацил. Это основание

Идет речь о больших хромосомах. Кроме того, молчащие VSG-копии расположены субтело-

мерно во всех или части минихромосом. — Прим. ред.

Молекулярная биология 381

„ BC-VSG 1 ;

BC-VSG 2

liiitiimiunmni

H#i

BC-VSG 2

liiitiimiunmni

Wtti

BC-VSG 3

б =§=

ESAG 1 ESAG2 ELC-VSG a ESAG 1 ESAG2 ELC-VSG a

Полицистронный транскрипт

; BC-VSG 1

ЩГГ11ПГНТ11Т1ТП'

BC-VSG 2

1 llll

ВГ VSG

Удвоение и перенос

всайт экспрессии

VSGa

r==Jp|=:

ESAG

1 =J

ESAG 2

IIIHIIIInllHnm

ELC-VSG 2

IIIHIIIInllHnm

ELC-VSG 2

1111

ЩЩ

III

111

Полицистронный транскрипт

Рис. 327. Упрощенная схема механизма замены антигенов у трипаносом. Антигенные пе-

реключения обеспечивают несколько различных механизмов. Здесь приведен наиболее

часто встречающийся вариант так называемой дупликативной транспозиции. I: ситуация

до антигенного переключения: а — тандемы так называемых пассивных копий гена VSG

(basic copy VSG, или BC-VSG; в прямоугольных рамках) расположены во внутренних учас-

тках хромосом. Короткие вертикальные линии представляют 70 фланкирующих пар нук-

леотидов, которые маркируют гены VSG; б — потенциально экспрессируемая копия гена

VSG (expression linked copy, ELC-VSGa) расположена в составе полицистронного участка

на конце хромосомы рядом с теломерой (обозначена большой черной стрелкой); литера

«а» означает, что этот сайт в данный момент транскрипционно активен, в — ELC-VSGa

транскрибируется полицистронно вместе с «генами, связанными с сайтом экспрессии»

(expression site associated genes) ESAG 1 и ESAG 2 под контролем единого промотора (р).

II: антигенное переключение происходит следующим образом: а — пассивная копия VSG 2

удваивается и переносится в субтеломерную позицию, где становится активной; б — преж-

няя же активная копия VSGa удаляется и замещается дубликатом VSG 2; в — активиро-

ванная копия VSG 2 считывается в полицистронный транскрипт.

до сих пор не было найдено ни у одно-

го другого организма

. Предполагается,

что это уникально видоизмененное ос-

нование задействовано в регуляции ак-

тивации копий гена VSG, находящихся

в субтеломерной позиции.

' Гидроксиметилурацил в трех модификациях присутствует в ядерной ДНК динофлагеллят, но

ни одна из этих модификаций не идентична видоизмененному основанию трипаносоматид. —

Прим. ред.

382 Избранные главы общей протистологии

Замена активной копии VSG-гена

идет либо за счет контроля транскрип-

ции субтеломерных сайтов, либо путем

различных перегруппировок ДНК

Один из возможных механизмов пока-

зан на рисунке 327. Альтернативный,

реже встречающийся механизм замены

активной копии VSG-гена — это обрат-

ная замена

В отличие от большинства эукари-

отных генов, активная VSG-копия счи-

тывается полицистронно совместно с

расположенными перед ней генами —

так называемыми генами, ассоцииро-

ванными с сайтом экспрессии

. Промо-

тор этого полицистронного участка рас-

положен на расстоянии около 50 т.п.н.

выше VSG-гена.

Другая уникальная особенность

трипаносом состоит в том, что гены

VSG и проциклина считываются РНК-

полимеразой I. У всех других эукариот

эта полимераза транскрибирует только

рибосомные гены. При такой транс-

крипции первичные транскрипты этих

генов не кэпируются на 5'-конце. Кэпы

эукариотных мРНК играют важную

роль в инициации трансляции, а также

в транспортировке и обеспечении ста-

бильности молекул мРНК. У трипано-

сом мРНК приобретают кэпы в резуль-

тате уникального процесса созревания,

который называется транс-сплайсингом.

Короткая РНК-донор (mini-exon donor

RNA) считывается с повторяющихся

последовательностей, расположенных в

другом участке генома, и кэпируется.

Эта РНК-донор сшивается с кодирую-

щим экзоном, полученным при полици-

стронном считывании (рис. 328).

Значительные успехи были достиг-

нуты в анализе структуры белков VSG

и способа их прикрепления к плазмати-

ческой мембране. Для нескольких VSG

известна полная последовательность

аминокислот. Цепи VSG располагают-

ся на поверхности клетки трипаносомы,

как колосья на поле. В состав VSG вхо-

дят олигосахариды. Структура их раз-

личается у разных трипаносом. Тополо-

гически олигосахариды подразделяют

на наружные, которые венчают пептид-

ную цепь, и внутренние, которые распо-

ложены в глубине гликокаликса. Удиви-

тельно, но наружные олигосахариды не

служат иммуногенетическими эпитопа-

ми; иммунодетерминантами являются

только наружные белковые части VSG.

Примечательно, что на трипаносомах

впервые было четко показано, что по-

верхностные белки гликокаликса кова-

лентно связаны через этаноламин с гли-

козилсульфатидилинозитолом, который

служит мембранным якорем (рис. 329).

Под первым вариантом автор, по-видимому, подразумевает переключение экспрессии на суб-

теломерную позицию в другой большой хромосоме; второй вариант включает два субварианта,

перечисленные далее в абзаце. — Прим. ред.

Вероятно, речь идет о следующем механизме. Копии VSG-гена, находящиеся в минихромосо-

мах, хотя и расположены субтеломерно, остаются транскрипционно пассивными. Активизация

такой молчащей копии произойдет, если она, за счет обмена концевыми участками хромосом,

перейдет в транскрипционно активную субтеломерную позицию на большой хромосоме. —

Прим. ред.

Несмотря на предпринимаемые усилия, функция этих генов и по сей день остается неизвест-

ной. — Прим. ред.

Молекулярная биология 383

—г~]—гп—ГП—

транскрипция I

—Щ 1ESAG 11 [ESAG 2| 1 VSG

|транскрипция

РНК-доноры r~j

ESAG 1

ESAG 2 r

VSG

транс-сплаисинг и .

присоединение поли-А

полицистронная пре-мРНК

[ j ESAG 11 А

I JESAG2|A

VSG

функциональные мРНК в

Рис. 328. Транс-сплайсинг у трипаносом. Гены, кодирующие РНК-доноры, транскрибиру-

ются на соответствующие РНК (а). Гены вариабельных поверхностных гликопротеинов

(variable surface glicoproteins — VSG) и двух «генов, связанных с сайтом экспрессии»

(expression site associated genes — ESAG 1 и ESAG 2), транскрибируются с общего промо-

тора (Р) на длинную полицистронную пре-мРНК (б). РНК-доноры затем сшиваются с транс-

криптами индивидуальных генов в составе полицистронной пре-мРНК (в). Таким образом,

функциональные 5'-концы присоединяются к экзонам транскриптов ESAG и VSG, а поли-

адениновые (поли-А) хвосты формируются на их З'-концах (по нескольким авторам).

Сейчас установлено, что многие мемб-

ранные белки других клеток заякорива-

ются в мембране ковалентными связя-

ми с гликолипидным якорем.

Кинетопластная ДНК

и редактирование РНК

В дополнение к стратегии антиген-

ной изменчивости, трипаносомы обла-

дают и другой особенностью, которая

была впервые обнаружена в митохонд-

риях трипаносом: феноменом редакти-

рования РНК. Позднее этот феномен

был найден и у других организмов.

Клетка Trypanosoma обладает одной

гигантской митохондрией, у которой

имеется особый участок, называемый

кинетопластом (см. рис. 47-50). Кине-

топласт содержит необычайно большое

количество ДНК. Эта митохондриаль-

ная ДНК состоит из кольцевых моле-

кул: около 50 максиколец и 10 ООО ми-

николец. Кольца сплетены в сложную

сеть (см. рис. 50д, е). Максикольца со-

держат информацию митохондриаль-

ных генов. Функция миниколец долгое

время оставалась загадкой. Казалось,

что многие митохондриальные гены в

ДНК максиколец не функциональны: у

них нет кодонов начала трансляции или

сдвинута рамка считывания. Однако

выяснение последовательностей соот-

ветствующих мРНК показало, что их

кодирующие области функциональны.

384 Избранные главы общей протистологии

Наружные олигосахариды

Внутренние

не экспонированные

олигосахариды '

С-концевой домен

-N-концевой домен

Чувствительная к

' протеазе область

Этаноламин

Фосфатидилинозитол

Олигосахаридный или

гликолипидный якорь

1ИЛИ/ \\\\»'

Плазматическая мембрана

Рис. 329. Схема стро-

ения VSG Trypano-

soma congolense (по

Рису).

Это означает, что лишенная смысла

последовательность ДНК преобразует-

ся в осмысленную в мРНК. Этот про-

цесс называется редактированием РНК

(или иногда РНК-редактированием).

У трипаносом уридин-монофосфатные

(УМФ) основания вставлены в пре-

мРНК после транскрипции. У некото-

рых генов более 50% кодирующих об-

ластей не найдены в самом гене, но

появляются в результате редактирова-

ния. В ряде случаев удаляется также и

уридин. Степень редактирования одно-

го и того же гена различна у разных

видов. Так, у одного вида определенная

мРНК подвергается кардинальным из-

менениям, а тот же ген у другого вида

вовсе не редактируется. Было показано,

что необходимая для корректной встав-

ки или удаления уридина информация

кодируется в миникольцах. Это и есть

дотоле неизвестная функция минико-

лец. Короткая РНК, так называемая на-

правляющая РНК (guide RNA, гид-

РНК), транскрибируется с миниколец

ДНК и снабжает информацией процесс

редактирования. Необходимо, чтобы

комплементарное спаривание пре-

мРНК и направляющей РНК произош-

ло вплотную к сайту начала редактиро-

вания. Гипотетическая эдитосома, веро-

ятно, стабилизирует этот комплекс и

участвует в добавлении и удалении

УМФ (рис. 330).

Редактирование РНК теперь обна-

ружено и у других организмов. Оно

идет в митохондриях Physarum и расте-

ний, у вирусов и даже в ядрах млекопи-

тающих. Однако механизм редактиро-

вания и его особенности у этих организ-

Молекулярная биология 385

ДНК

Транскрипция J Транскрипция^

3'-*СААС— 5'

гид-РНК

Эдитосома

Отредакти-

рованная

мРНК UGU ААС CUG UUG CUU AAC GUC

Рис. 330. Редактирование РНК в митохондрии трипаносом (по Шустер и Бренике).

мов отличаются от тех, что найдены у

трипаносом.

Является ли процесс редактирова-

ния РНК реликтом времен пребиоти-

ческой РНК (что кажется маловероят-

ным), или он дает дополнительную эво-

люционную пластичность, или имеет

другое неизвестное значение? Ответ

еще предстоит найти.

Специфика

молекулярных

процессов у инфузорий

В результате интенсивного изучения

методами молекулярной биологии ин-

фузории стали предметом особого ин-

тереса с общебиологических позиций

сразу в нескольких аспектах.

Структура генома

и его преобразования

Самая яркая особенность инфузо-

рий — ядерный дуализм. Каждая клет-

ка содержит от одного до нескольких

мелких микронуклеусов, которые вы-

полняют генеративную функцию, и от

одного до нескольких крупных и содер-

жащих большое количество ДНК мак-

ронуклеусов, которые отвечают за сома-

тические, или вегетативные функции.

Микронуклеус содержит нормальные

эукариотные хромосомы и делится пу-

тем митоза или мейоза. Макронуклеу-

сы, наоборот, не имеют классических

хромосом и делятся при помощи ами-

тоза. Наличие генеративного и вегета-

тивного ядер в одной клетке, а также

подозрительное несходство двух типов

386 Избранные главы общей протистологии

SI Pb Ld Lc Sc Т, Т

Рис. 331. Разделение фрагментированной

макронуклеарной ДНК Tetrahymena мето-

дом пульс-электрофореза. Макронуклеар-

ная ДНК двух клонов Т. thermophila (T

)

и близкородственной Т. pyriformis (Т

) ра-

зогнаны на агарозном геле. Для сравнения

в форез включены: макронуклеарная ДНК

Stylonychia lemnae (SI) и Paramecium

bursaria (Pb), а также хромосомы дрожжей

{Saccharomyces cerevisiae, Sc), конкатеме-

ры

фага лямбда (Lc) и ДНК фага лямбда,

обработанная гидролазами (Ld). Длина по-

втора в конкатемерах фага лямбда состав-

ляет 49 т.п.н. Размеры фрагментов макро-

нуклеарной ДНК Tetrahymena варьируют от

20 до более 1000 т.п.н. Гораздо меньшие

по размеру молекулы ДНК других видов ин-

фузорий уходят за пределы геля при этих

условиях.

Конкатемер ДНК образован тандемно повто-

ряющимися единицами генома. — Прим. пер.

ядер давно заинтересовали исследова-

телей, которые стали активно изучать

организацию генома и структуру гена

инфузорий.

Из тысяч видов инфузорий деталь-

но изучены лишь немногие из подклас-

са Hymenostomata (преимущественно

представители родов Tetrahymena и

Paramecium) и ряд видов из подклассов

Stichotrichia и Hypotrichia (главным об-

разом, Stylonichia, Oxytricha и Euplotes).

Сравнения геномов микро- и макронук-

леуса у этих видов привели к обнаруже-

нию удивительных и совершенно нео-

жиданных различий в их молекулярной

организации.

Новый макронуклеус начинает раз-

виваться из микронуклеуса после поло-

вого процесса (в форме конъюгации

или автогамии). Незрелый макронукле-

ус называют макронуклеарным зачат-

ком. В ходе развития макронуклеуса его

геном претерпевает глубокие измене-

ния. В макронуклеарном зачатке Tetra-

hymena 10-20% нуклеотидов исходного

генома удаляется в ходе сложных пере-

строек. Микронуклеарная ДНК предпо-

ложительно хромосомного размера

фрагментируется примерно на 200 от-

дельных молекул ДНК, размер которых

варьирует от 20 до 1 500 т.п.н. (рис.

331). Самые мелкие молекулы ДНК в

макронуклеусе представлены димерамн

генов рРНК. Одиночный ген рРНК мик-

ронуклеарного генома вырезается и уд-

ваивается, и эти две копии сшиваются

в палиндромный димер, то есть «голо-

ва к голове». В ходе фрагментации к

концам всех молекул ДНК присоединя-

ются специальные теломеры. За

идет амплификация; количество копий

разных фрагментов неодинаково.

Молекулярная биология 387

У некоторых цилиат происходит

более кардинальная реорганизация мак-

ронуклеуса. В результате нескольких

циклов репликации исходных хромосом

в зачатке макронуклеуса этих видов

формируются политенные хромосомы

(см. рис. 302). Иногда репликация идет

избирательно, и тогда разные гены по-

лучают неодинаковое количество ко-

пий. У Stylonychia удаляется до 98%

нуклеотидов микронуклеарной ДНК, у

других видов меньше. Причем удаляют-

ся как уникальные, так и повторяющи-

еся последовательности, и в первую

очередь элиминируются транспозон-

подобные элементы. Наконец, ДНК

фрагментируется на мелкие участки

размером в один ген, насчитывающие

от 100 до 15 ООО п.н. (рис. 332). У Tetra-

hymena каждый фрагмент снабжается

особыми теломерами и амплифицирует-

ся до специфичного для каждого гена

количества копий, которое варьирует от

немногих сотен до более чем миллиона.

Общая организация макронуклеарных

молекул ДНК размером в ген у стихот-

рих и гипотрих показана на рисунке

333.

К настоящему времени более 50 ге-

нов инфузорий клонированы и полнос-

тью секвенированы. Для ряда генов уда-

лось прочесть полную последователь-

ность нуклеотидов и в микронуклеусе,

и в макронуклеусе. Сопоставление этих

двух версий одного и того же гена вы-

явило очередную странную черту гено-

ма инфузорий: микронуклеарные вер-

сии некоторых генов гипотрих содер-

жат так называемые внутренние элими-

нируемые последовательности (internal

eliminated segments, или internal eliminated

sequences — IES), которые вырезаются

А В С D E F G

Рис. 332. Макронуклеарные и микронукле-

арные ДНК различных видов инфузорий ра-

зогнаны обычным электрофорезом на ага-

розном геле. Гель окрашен бромидом эти-

дия. Дорожка А — маркер; дорожки В-Е со-

держат макронуклеарную ДНК гипотрих;

дорожка F — макронуклеарную ДНК Para-

mecium и дорожка G — микронуклеарную

ДНК гипотрих. Длина фрагментов макро-

нуклеарной ДНК гипотрих варьирует от ме-

нее 0,5 т.п.н. до более 10 т.п.н. Тонкая

структура паттерна полос макронуклеарной

ДНК гипотрих (дорожки В-Е) различна у

различных видов. Макронуклеарная ДНК

других инфузорий и микронуклеарная ДНК

имеет много больший молекулярный вес и

потому не фракционируется этим методом.

при формировании макронуклеарной

версии этого гена. Еще более поразите-

лен тот факт, что фрагменты исходного

кода, которые не элиминируются и со-

ставляют макронуклеарную версию

гена — так называемые последователь-

ности, предназначенные для макронук-

леуса (macronuclear destined sequen-

ces — MDS), — в исходной версии гена

расположены в ином порядке, а некото-

рые фрагменты даже записаны сзади

наперед. Первый расшифрованный ген