Иванов А.Т., Петрова В.С., Кенигсберг Я.Э. Ветеринарная токсикология

Подождите немного. Документ загружается.

вую фракцию экстрагируют 25 мл хлороформа. Содер-

жимое перемешивают 1—2 мин и оставляют для разде-

ления слоев.

После разделения слоев хлороформную фракцию

(нижний слой) пропускают через хроматографическую

колонку при отсасывании водоструйным насосом. Ско-

рость прохождения экстракта через колонку равна 1—

2 каплям в 1 с (в момент переноса экстракта в колонку

вакуум не применяют). Очищенный от примесей экстракт

собирают в колбу для отгона. Экстракцию водно-ацето-

новой фракции хлороформом проводят еще два раза,

порциями по 20 мл и пропускают каждую порцию экс-

тракта через хроматографическую колонку. Полученные

экстракты присоединяют к экстракту в колбе для отгона.

Затем колонку три раза промывают хлороформом по

30 мл с последующим присоединением промывных пор-

ций к основному экстракту.

Колбу для отгона соединяют с перегонным аппаратом

и содержимое ее концентрируют на кипящей водяной

бане до 2—3 мл, затем переносят в центрифужную про-

бирку. Колбу трехкратно ополаскивают хлороформом

по 1—1,5 мл, присоединяя эти порции к основному рас-

твору в пробирке. Пробирку нагревают на водяной бане

при температуре 80—85

C, а затем по мере уменьшения

объема раствора температуру снижают.

Остаток в пробирке растворяют в 0,1 мл ацетона и

наносят микрошприцем на стартовую линию хромато-

графической пластинки силуфол. Пробы наносят по

10 мкл (по 2 мкл 5 раз в одну точку на линии старта)

на расстоянии 1,5 см друг от друга и нижнего края пла-

стинки. Одновременно с исследуемыми растворами на

пластинку наносят 2 мкл стандартного спиртового или

ацетонового раствора токсина Т-2, содержание которого в

пробе должно быть 1 мкл. Пластинку с нанесенными про-

бами помещают в насыщенную парами растворителей

хроматографическую камеру таким образом, чтобы стар-

товая линия располагалась на 0,5 см выше уровня по-

движного растворителя. Первое хроматографирование

проводят в системе этилацетат—гексан (1 : 1). Когда

фронт растворителя продвинется на высоту 14,5 см от

нижнего края пластинки, хроматограмму извлекают из

камеры, 7—10 мин подсушивают на воздухе, затем 1 мин

в сушильном шкафу при температуре 100 °С. После это-

го ее повторно помещают в камеру с системой раствори-

телей хлороформ — этилацетат — уксусная кислота

'161

(17 : 3 : 1) или толуол — этилацетат — муравьиная кис-

лота (6:3: 1).

После продвижения фронта смеси растворителей на

высоту 14,5 см хроматограмму извлекают из камеры, под-

сушивают на воздухе, обрабатывают 20%-ным спирто-

вым раствором серной кислоты, помещают в сушильный

шкаф с температурой 120° и выдерживают 5—10 мин до

небольшого ее потемнения. Затем пластинку извлекают,

охлаждают и просматривают в исследуемой пробе ток-

сина Т-2. На хроматограмме обнаруживают пятно с го-

лубой флуоресценцией, соответствующее по положению и

флуоресценции пятну токсина Т-2 в стандартной пробе.

При использовании в повторном хроматографирова-

нии системы толуол — этилацетат — муравьиная кислота

Rf токсина Т-2 составляет 0,23—0,24, при применении си-

стемы хлороформ — этилацетат — уксусная кислота —

0,20—0,23.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЗЕАРАЛЕНОНА (Ф-2)

Принцип метода определения микотоксина Ф-2 в фу-

ражном зерне и комбикормах основан на извлечении

зеараленона ацетоном, очистке эстракта на колонке с

окисью алюминия, элюировании токсина 0,005 н. водным

раствором щелочи с последующим хроматографирова-

нием элюата в тонком слое силикагеля и обработкой

хроматограмм красителем прочным красным ЖЖ.

Чувствительность определения Ф-2 на пластинках силу-

фол составляет 0,1 мкг. Минимально определяемое ко-

личество Ф-2 в исследуемом материале по данной мето-

дике составляет 250 мкг/кг. Время проведения анали-

за — 7 ч.

Ход анализа. 10 г измельченного образца помещают

в колбу емкостью 250 мл с притертой пробкой, вносят

60 мл ацетона и экстрагируют, встряхивая в течение 2 ч.

Экстракт фильтруют через бумажный фильтр в фарфо-

ровую чашку № 10. Извлечение токсина повторяют еще

раз, используя 60 мл ацетона. Полученный экстракт вы-

паривают на водяной бане досуха и очищают с помощью

колоночной хроматографии.

В нижнюю часть колонки помещают тампон ваты

1см, вносят 7 г окиси алюминия и пропускают через ко-

лонку 20 мл ацетона. Остаток в чашке растворяют аце-

тоном и вносят в колонку. После поглощения экстракта

'162

адсорбентом через колонку пропускают последовательно

300 мл ацетона и 100 мл смеси ацетон — дистиллирован-

ная вода, взятых в соотношении 99 : 1, для удаления при-

месей. Токсин элюируют 200 мл 0,005 н. водного раствора

гидроокиси натрия (NaOH) в фарфоровую чашку и элю-

ат выпаривают на кипящей водяной бане досуха.

Полученный после выпаривания щелочного раствора

остаток в чашке тщательно смывают (3—4 раза) пор-

циями ацетона по 10 мл и фильтруют через бумажный

фильтр. Фильтрат выпаривают на водяной бане досуха.

Остаток растворяют в 0,5—1,0 мл ацетона и переносят

в пробирку небольшого объема. Из этого раствора на

пластинку силуфол наносят 50—100 мкл пробы и стан-

дартный раствор Ф-2 в количестве 0,1; 0,25; 0,5; 1,0; 2,5;

5,0; 10 мкг. Объем нанесенной пробы должен соответст-

вовать объему наносимого стандартного раствора. Мес-

та нанесения проб располагают на расстоянии 1,5—2,0 см

друг от друга и от нижнего и боковых краев пластины.

Диаметр пятен не должен превышать 0,5 см.

В камеру для хроматографирования вносят 100 мл

системы растворителей, состоящей из гексана и диэтило-

вого эфира (1:3) и спустя 30 мин помещают пластинку

в вертикальном положении. После того как фронт раство-

рителя поднимется на высоту 10—12 см, пластинку вы-

нимают, отмечают фронт растворителя и помещают в

сушильный шкаф на 3 мин при IlO

C. Затем пластинку

опрыскивают свежеприготовленным раствором красного

прочного ЖЖ и помещают в сушильный шкаф на 5—

7 мин. Микотоксин проявляется в виде желтых пятен на

белом фоне с Rf 0,5 ±0,03.

Количество токсина в пробе определяют, сравнивая

интенсивность окраски и площадь пятен свидетеля и об-

разца. В случае, если содержание микотоксина в иссле-

дуемом образце превышает 10 мкг, тонкослойную хрома-

тографию повторяют, уменьшая нанесенный объем ис-

следуемого раствора.

Расчет результатов анализа. Концентрацию микоток-

сина Ф-2 в пробе вычисляют по формуле

_ 2

•

ВС

•

1000

~ АД

где X — содержание Ф-2 в исследуемой пробе, мкг/кг;

А — объем пробы, наносимый на пластинку силуфол при

хроматографировании, мкл; В — концентрация Ф-2 в

объеме пробы, нанесенном на пластинку, мкг; С — общий

'163

объем пробы, мкл; Д — масса исследуемой пробы, г; 2 —

коэффициент, учитывающий потери вещества в ходе ана-

лиза.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АФЛАТОКСИНОВ B

И G

Принцип метода основан на экстракции токсинов из

кормов водным ацетоном, очистке экстракта от сопутст-

вующих примесей гексаном, переэкстракции токсинов в

хлороформ или бензол, очистке их на хроматографиче-

ской колонке с силикагелем и окисью алюминия. Иден-

тификация и количественное определение основано на

методе хроматографии экстракта в тонком слое с исполь-

зованием пластинок силуфол.

Чувствительность метода составляет 10 мкг/кг, время

анализа — 3 ч.

Полученный для исследования образец тщательно из-

мельчают и перемешивают. Для анализа отбирают про-

бу массой 50 г в колбу емкостью 500 мл с притертой проб-

кой. Навеску заливают 150 мл смеси ацетон — вода

(85: 15), закрывают пробкой и встряхивают в течение

45 мин, затем отфильтровывают через бумажный фильтр

в мерный цилиндр емкостью 100 мл и отбирают первые

75 мл фильтрата.

75 мл фильтрата переносят в делительную воронку на

500 мл. Цилиндр ополаскивают 5 мл ацетона и сливают

в ту же делительную воронку. К фильтрату приливают

50 мл гексана, закрывают пробкой и энергично встряхи-

вают 1,5—2 мин. Затем в делительную воронку прили-

вают 120 мл 4 %-ного раствора NaCl, аккуратно переме-

шивают содержимое воронки и дают слоям разделиться.

После этого нижний водно-ацетоновый слой сливают во

вторую делительную воронку и в ней проводят переэкс-

тракцию токсинов из водного ацетона в бензол или хло-

роформ.

При использовании хлороформа в делительную ворон-

ку приливают 25 мл его, аккуратно перемешивают и

дают слоям разделиться. Затем нижний слой сливают в

колбу емкостью 200—250 мл через бумажный фильтр со

слоем безводного сульфата натрия. Переэкстрагирова-

ние повторяют еще трижды, каждый раз сливая нижний

слой в ту же колбу. После этого промывают фильтр 10 мл

хлороформа, полученный объединенный экстракт упари-

вают на водяной бане до 5 мл и используют для очистки

на хроматографической колонке.

'164

При переэкстракции афлатоксинов из водного ацето-

на в бензол в делительную воронку с экстрактом после

обезжиривания гексаном вносят 25—30 мл бензола,

встряхивают и после разделения слоев нижний слой от-

брасывают, а бензольный экстракт, оставшийся в ворон-

ке, сливают в колбу емкостью 100 мл. Делительную во-

ронку ополаскивают 10 мл бензола и сливают в ту же

колбу. Объединенный бензольный экстракт упаривают

на водяной бане, перерастворяют в 5 мл хлороформа и

используют для очистки на хроматографической ко-

лонке.

В нижнюю часть хроматографической колонки поме-

щают ватную пробку, вносят силикагель (высота стол-

бика 1 см) и на него наслаивают окись алюминия (вы-

сота столбика 2—2,5 см), затем наносят слой безводного

сульфата натрия 3 см.

В колонку количественно переносят упаренный до

5 мл экстракт, дают ему впитаться и элюируют токсины

100 мл смеси хлороформ — ацетон (9:1) под слабым

разрежением, собирая элюат в колбу Бунзена. Затем

элюат количественно переносят в колбу Эрленмейера

емкостью 200 мл и упаривают на водяной бане до 4—

5 мл. Упаренный элюат количественно переносят в мер-

ную пробирку емкостью 10 мл хлороформом и доводят

объем до метки (основной раствор). Полученный экс-

тракт используют для тонкослойной хроматографии.

На пластинке отмечают линию старта в 1,5—2,0 см

от нижнего края пластинки и наносят 20, 5, 2, 1 и 20 мкл

испытуемого раствора (пробы 1, 2, 3, 4, 5 соответствен-

но). На ту же пластинку в пятно испытуемого раствора

пробы 5 вносят 5 мкл стандартного раствора смеси афла-

токсинов и рядом наносят на пластинку пробу стандарт-

ного раствора в количестве 5 мкл (концентрация афла-

токсинов B

и G

в стандартном растворе должна быть

по 1 мкг/мл каждого и по 0,5 мкг/мл для афлатоксинов

и G

). Пластинку подсушивают на воздухе до удале-

ния растворителя и проводят последовательную хрома-

тографию в двух системах растворителей. Сначала плас-

тинку помещают в камеру, насыщенную парами системы

толуол — этилацетат — 85%-ная муравьиная кислота

(5:4: 1). Когда фронт растворителя поднимется на 10 см

над линией старта, пластинку вынимают из камеры, под-

сушивают на воздухе и помещают в камеру с системой

хлороформ — метанол (99 : 1) и разгоняют в том же на-

правлении на расстояние 13 см от линии старта *. Пла-

'165

стинку просматривают в УФ-лучах (365 нм). Rf афлаток-

синов Bi, B

, Gi, G

равна соответственно 0,34; 0,29; 0,26;

0,22. Вместо системы хлороформ — метанол (99:1)

можно использовать систему четыреххлористый угле-

род — ацетон — уксусная кислота (20:10:1). Rf афла-

токсинов B

, Gi и G

в этом варианте равна соответ-

ственно 0,38; 0,35; 0,33; 0,29. Если в пробе 4 отмечается

интенсивная флуоресценция, соответствующая по вели-

чине и характеру свечения стандарту, делают разведе-

ние основного раствора в 50 раз. Для этого 0,1 мл основ-

ного раствора переносят в мерную пробирку на 5 мл и

доводят объем раствора до метки хлороформом. Из при-

готовленного раствора на пластинку наносят 10 и 5 мкл

(пробы 6 и 7) и проводят последовательную хромато-

графию, как описано выше. Концентрацию афлатоксинов

определяют по табл. 23.

Таблица 23. Определение концентрации афлатоксинов

Номер пробы

с флуоресценцией

Концентрация B

и G

, мкг/кг

Номер пробы

с флуоресценцией

Концентрация B

и G

, мкг/кг

10—20

4 >100

>20

6 >500

>50

>1000

Для более точного определения афлатоксинов в об-

разце готовят разведение основного раствора в 2, 5,

10 раз и более и из приготовленного раствора наносят

на пластинку пробы, постепенно увеличиваемые в объе-

ме. После разгонки пластинки в хроматографических ка-

мерах ее проявляют в УФ-лучах, отмечая наименьший

объем пробы, дающий на пластинке минимальную флуо-

ресценцию. Концентрацию каждого афлатоксина вычис-

ляют по формуле

£ _ 1,2

•

200 • V

~ Wn

где V — конечный объем основного раствора с учетом

разведений, мл; W — масса образца, соответствующая

экстракту, наносимому на колонку, г; 200 — коэффициент

* Если необходимо определить только афлатоксин B

хромато-

графируют пластинку только в системе толуол — этилацетат —

85%-ная муравьиная кислота (5:4: 1).

'166

пересчета токсина на 1 кг корма с учетом минимально

детектируемых количеств афлатоксинов на пластинке;

1,2— коэффициент, учитывающий потери определяемых

веществ в ходе анализа; п — объем пробы, дающий на

пластинке минимальную флуоресценцию, мкл; С — кон-

центрация афлатоксинов B

или Gi, мкг/кг.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОХРАТОКСИНА А

Принцип метода основан на извлечении микотоксина

смесью хлороформа и 0,1 M раствора ортофосфорной

кислоты, переэкстракции микотоксина из хлороформа в

0,1 н. раствор натрия двууглекислого, отделении щелоч-

ного раствора от хлороформа, подкислении его муравьи-

ной кислотой до рН 2—3, реэкстракции микотоксина в

новую порцию хлороформа, концентрировании его и раз-

делении методом хроматографии в тонком слое. Хрома-

тограммы просматривают в УФЛ волной 365 нм. Мини-

мальное количество охратоксина А, определяемое на

хроматографических пластинках силуфол УФ-254, со-

ставляет 0,001 мкг. Чувствительность метода— 10 мкг/кг

продукта.

Экстракция микотоксина. Из тщательно перемешан-

ного и измельченного на электрической мельнице сред-

него образца зернофуража, продуктов его переработки

или комбикорма отбирают навеску массой 50 г, которую

переносят в колбу емкостью 500 мл. В колбу вносят 25 мл

0,1 M раствора ортофосфорной кислоты и 250 мл хлоро-

форма. Экстрагируют микотоксин, встряхивая содержи-

мое колбы в течение 30 мин или путем настаивания в те-

чение 12 ч.

Очистка и концентрирование экстракта. Экстракт от-

деляют от корма фильтрацией через бумажный фильтр.

Фильтрат переносят в делительную воронку емкостью

500 мл, прибавляют к нему 200 мл 0,1 н. раствора натрия

двууглекислого и хорошо перемешивают. После разде-

ления смеси хлороформный слой удаляют, водный оста-

ток подкисляют муравьиной кислотой до рН 2—3 и при-

бавляют к нему 50 мл хлороформа. Содержимое дели-

тельной воронки вновь перемешивают. После разделения

слоев хлороформный слой сливают в выпарительную фар-

форовую чашку, а водный остаток повторно обрабаты-

вают 50 мл хлороформа, который после отделения объ-

единяют с первой порцией и упаривают досуха при тем-

пературе не выше 60 °С.

'167

Качественное определение содержания охратоксина А

в образце. Сухой остаток экстракта растворяют в 1 мл

подкисленного хлороформа. На хроматографическую

пластинку силуфол УФ-254 наносят микрошприцем 1—

2 мкл стандартного раствора микотоксина (раствор 2)

и 5—30 мкл испытываемого раствора. Точки нанесения

обоих растворов должны быть на расстоянии не менее

1 см друг от друга и 1,5 см от бокового края пластинки.

Наносить растворы на хроматографическую пластинку

необходимо в токе теплого воздуха, используя для этой

цели фен. Размер пятна, нанесенного на пластинку

раствора, не должен превышать 5 мм.

Пластинку помещают в вертикальном положении в

хроматографическую камеру, дно которой заполнено си-

стемой растворителей толуол — этилацетат — 85%-ная

муравьиная кислота (6:3:1). После того как фронт

растворителей поднимется на высоту 10—12 см от стар-

та, пластинку вынимают из камеры, подсушивают в то-

ке теплого воздуха до удаления запаха растворителей.

Хроматограмму просматривают в УФ-лучах длиной вол-

ны 365 нм. Сравнивая хроматограмму стандартного рас-

твора охратоксина А с хроматограммой испытываемого

образца, выясняют, имеется ли в нем вещество, анало-

гичное по свечению и величине стандарту микотоксина.

Для подтверждения наличия охратоксина А в исследуе-

мом образце хроматограмму выдерживают в парах ам-

миака 5 мин. Под воздействием паров аммиака охраток-

син А изменяет флуоресценцию от зелено-голубой до

темно-голубой. В случае выявления в испытываемом

образце охратоксина А, приступают к его количествен-

ному определению.

Количественное определение содержания охратоксина

А в образце. Остаток экстракта в фарфоровой чашке

растворяют в 5 мл подкисленного хлороформа и количе-

ственно переносят в калиброванную (с меткой 5 мл) про-

бирку. На хроматографическую пластинку силуфол

УФ-254 наносят параллельно с помощью микрошприца

или специальной мерной микропипеткой 1, 2, 4, 6, 8 и

10 мкл испытываемого раствора и 1, 2, 4, 6, 8 и 10 мкл

раствора-свидетеля охратоксина А. Все операции по по-

лучению хроматограмм и просмотру их в УФ-лучах про-

водят, как при качественном определении. При просмот-

ре хроматограмм в УФ-лучах выявляют предельно ми-

нимальное количество охратоксина А — 0,01 мкг. Если

на хроматограмме в минимальном объеме исследуемого

'168

раствора имеется пятно охратоксина А, по интенсивнос-

ти свечения превосходящее предельно выявляемое, то

исходный объем испытываемого раствора разбавляют в

2 раза и более до достижения на хроматограммах пре-

дельно выявляемого свечения охратоксина А. Расчет со-

держания охратоксина А в образце проводят по формуле

у_ 2. 0,001 . Y

• 1000

M '

где X — содержание охратоксина в исследуемой пробе,

мкг/кг; 0,001 — минимальное количество охратоксина А,

выявляемое в УФ-лучах на пластинке силуфол УФ-254,

мкг; Y

— общий объем испытываемого раствора, мл;

Yi — минимальный объем испытываемого раствора, в ко-

тором на хроматограмме установлено в УФ-лучах пре-

дельно выявляемое свечение охратоксина А, мл; M —

масса исследуемого образца, г; 1000 — коэффициент пе-

ревода в килограммы; 2 — коэффициент, учитывающий

потери вещества в ходе анализа.

ВЕТЕРИНАРНО-САНИТАРНАЯ ЭКСПЕРТИЗА ТУШ

И ОРГАНОВ ЖИВОТНЫХ

При отравлениях животных проводят дифференциро-

ванную санитарную оценку мяса и субпродуктов с целью

не допустить к употреблению продуктов, опасных для

здоровья человека. При этом учитывают данные химико-

токсикологического анализа, токсичность вещества, вы-

звавшего отравление, кумуляцию его в органах и тканях,

результаты органолептического, биохимического и бакте-

риологического исследований.

Общую ветеринарно-санитарную оценку туш и всех

внутренних органов проводят согласно «Правилам вете-

ринарного осмотра убойных животных и ветеринарно-

санитарной экспертизы мяса и мясных продуктов»,

утвержденным Главным управлением ветеринарии Гос-

агропрома СССР в 1983 г. Обязательные химико-токси-

кологические исследования мяса проводят в лаборато-

рии, куда направляют пробы мышечной, жировой ткани

и печени по 200 г, 2—3 лимфатических узла и содержи-

мое желудка и кишечника. В сопроводительном докумен-

те указывают, на какие яды необходимо проводить ис-

следование. Если причина отравления неизвестна, в ла-

боратории прежде всего исследуют содержимое желудка

(кишечника) на соли тяжелых металлов, пестициды,

алкалоиды и другие вещества, затем мышечную ткань

'169

и печень по методам, утвержденным Минздравом СССР.

Бактериологическое исследование проводят по дей-

ствующему стандарту, с целью выявления вторичных

(секундарных) инфекций и подтверждения обсеменения

мяса микрофлорой, способной вызывать пищевые от-

равления у человека.

Физико-химические исследования мяса проводят в

соответствии с государственными стандартами для мяса

по видам животных. При предполагаемом отравлении

животных особое внимание следует обратить на органо-

лептические показатели, величину рН и активность пе-

роксидазы. Пробы мяса крупного рогатого скота иссле-

дуют дополнительно реакцией с нейтральным формали-

ном (формольная реакция). Биохимические исследования

проб не следует проводить в день убоя животных,

так как при незавершенном процессе созревания мяса

могут быть получены необъективные показатели. Поэто-

му определять рН мяса и проводить формольную реак-

цию и на пероксидазу необходимо через 20—24 ч после

убоя животных.

При благоприятных органолептических показателях,

результатах бактериологического и биохимического ана-

лиза, санитарная оценка мяса зависит от наличия в нем

остаточных количеств химического вещества, вызвавше-

го отравление животных.

Не разрешается использовать в пищевых целях мясо

и продукты убоя животных независимо от количествен-

ного содержания в них цианидов, желтого фосфора, про-

пазина, гептахлора дихлоральмочевины, полихлорпине-

на, полихлоркамфена, альдрина, ТМТД, ДДВФ, цинеба,

дикрезила, поликарбацина, байгона, севина, ялана, бен-

тиокарба, динитроортокрезола, нитрофена, метафоса,

хлорофоса, тиофоса, карбофоса, ртутьсодержащих пести-

цидов (учитывая естественное содержание ртути в пече-

ни животных не более 0,03 мг/кг и почках не более

0,05 мг/кг), мышьяксодержащих препаратов (учитывая

естественное содержание мышьяка в мясе до 0,05 мг/кг),

гербицидов группы 2,4-Д и триходесмы седой. Если в

мясе обнаружены перечисленные вещества в количествах,

не превышающих 4 пределов чувствительности официаль-

но утвержденных методов анализа остатков ядохимика-

тов, оно может быть допущено для переработки на су-

хие животные корма.

При обнаружении в мясе вынужденно убитых живот-

ных пестицидов в пределах допустимых остаточных ко-

'170