Лабораторные работы и задачи по биохимии, практическое пособие

Подождите немного. Документ загружается.

гиперболическую форму. Впервые теоретические основы кинетики

ферментативного катализа были разработаны Л. Михаэлисом и М .Ментен.

Они предложили математическое уравнение, выражающее зависимость

скорости ферментативной реакции v от концентрации субстрата S:

]S[K

]S[V

max

где v – скорость ферментативной реакции; S – концентрация субстрата,

max

– максимальная скорость реакции, K

– константа Михаэлиса.

Константа Михаэлиса является мерой сродства фермента к субстрату .

Она численно равна концентрации субстрата, при которой скорость

ферментативной реакции равна половине максимальной скорости .

Из графика Михаэлиса –Ментен трудно точно определить К

и V

max

, в

связи с чем имеются различные математические преобразования указанного

уравнения. В частности , Лайнуивер и Берк предложили строить график в

двойных обратных координатах . Тогда уравнение примет вид :

111

VSV

=⋅+

[]

Это уравнение прямой y=ax+b (рис. 1), где a=K

/V - тангенс угла

наклона прямой ; b=1/V, y=1/v, x=1/[S].

Рис. 1. График Лайнуивера-Берка

Ход работы . Фермент глутаматдегидрогеназа катализирует реакцию:

глутамат + NAD

→ 2-оксоглутарат + NADH

+ H

+ NH

Скорость реакции измеряли по увеличению экстинкции среды при 340

нм в единицу времени, которое происходило вследствие восстановления

NAD

. При измерении скорости данной реакции при различных

концентрациях субстрата и постоянной концентрации NAD

были получены

данные, представленные в табл. 2. Определите графически K

максимальную скорость ферментативной реакции.

1/V

Наклон = К

-1/К

1/v

1/[S]

Таблица 2

Экспериментальные данные зависимости скорости

глутаматдегидрогеназной реакции от концентрации глутамата

Концентрация глутамата,

ммоль / л

Начальная скорость реакции,

∆E

340

/мин

1,68 0,172

3,33 0,250

5,00 0,286

6,67 0,303

10,00 0,334

20,00 0,384

Работа 6. Определение типа и константы ингибирования

Процесс ингибирования может быть обратимым и необратимым.

Обратимые ингибиторы бывают конкурентного, неконкурентного,

бесконкурентного и смешанного действия. Некоторые ферменты

ингибируются избытком субстрата.

Конкурентное ингибирование возникает тогда, когда ингибитор

взаимодействует с функциональными группами активного центра фермента.

Конкурентное ингибирование может быть ослаблено или устранено

увеличением концентрации субстрата. В большинстве случаев ингибиторы

конкурентного типа представляют собой структурные аналоги субстратов .

При конкурентном ингибировании происходит кажущееся увеличение К

max

остается неизменной .

Неконкурентное ингибирование не зависит от концентрации субстрата.

Неконкурентный ингибитор подавляет каталитическое превращение

субстрата в продукты реакции. Видимо, при неконкурентном торможении

ингибитор связывается с ферментом на участке, отличающемся от центра

связывания субстрата; однако при этом деформирует этот центр , подавляя

его каталитическую функцию. Когда в реакционной среде находятся и

субстрат и ингибитор , они присоединяются к ферменту одновременно. В

присутствии неконкурентного ингибитора K

не изменяется, а V

max

уменьшается.

Бесконкурентное ингибирование наблюдается в том случае, когда

ингибитор не способен присоединяться к ферменту , но он может связываться

с комплексом ES, переводя его в неактивную форму. Бесконкурентный

ингибитор в одинаковой мере уменьшает К

и максимальную скорость

реакции.

При смешанном ингибировании ингибитор действует как на участок

связывания, так и на каталитический центр фермента, причем независимо от

того, перекрываются они или нет. Ингибитор смешанного типа действия

тоже изменяет и K

, и V

max

, но в отличие от бесконкурентного ингибирования

кажущаяся K

может или увеличиваться, или уменьшаться, а величина V

max

всегда снижается.

Ход работы . При измерении кинетики ферментативной реакции в

зависимости от концентрации субстрата в присутствие и отсутствии

ингибитора были получены данные, представленные в таблице 3. Определите

графически К

и V

max

в отсутствие ингибитора и в присутствии его.

Определите тип ингибирования.

Таблица 3.

Скорость ферментативной реакции в отсутствие и в присутствии

ингибитора

Скорость реакции, мкмоль / мин Концентрация

субстрата, мкмоль / л

Без ингибитора С ингибитором

3 10,4 4,1

5 14,5 6,4

10 22,5 11,3

30 33,8 22,6

90 40,5 33,8

Работа 7. Ферменты поджелудочной железы . Определение

активности амилазы в сыворотке крови

Функции поджелудочной железы . Поджелудочная железа является

эндокринной железой (в ней образуются и секретируются в кровь гормоны

инсулин и глюкагон) и экзокринной (в ней образуются и секретируются в

тонкий кишечник рад пищеварительных ферментов и бикарбонат).

Бикарбонат нейтрализаует HCl желудочного сока в поступившей из желудка

порции пищи. В тонком кишечнике продолжается переваривание белков ,

начавшееся в желудке.

Переваривание белков . Поступление аминокислот в

двенадцатиперстную кишку вызывает освобождение гормона

холецистокинина, который стимулирует секрецию нескольких ферментов

поджелудочной железы . Это трипсин, химотрипсин, карбоксипептидаза и

эластаза. Они вырабатываются экзокринными клетками поджелудочной

железы в виде ферментативно неактивных предшественников (зимогенов ) -

трипсиногена, химотрипсиногена, прокарбокси-пептидазы и проэластазы .

Благодаря этому поджелудочная железа не разрушается ферментами.

Зимогены активируются в тонком кишечнике путем ограниченного

протеолиза. Трипсиноген превращается в активную форму под действием

энтерокиназы , протеолитического фермента, секретируемого клетками

кишечного эпителия. Образование трипсина обусловлено отщеплением

гексапептида от N-конца полипептидной цепи трипсиногена. Трипсин по

мере своего образования также участвует в превращении трипсиногена в

трипсин. Трипсин гидролизует пептидные связи, образованные

карбоксильными группами лизина и аргинина.

Химотрипсиноген, как и проэластаза и прокарбоксипептидаза,

превращается в активный фермент под действием трипсина. Молекула

химотрипсиногена представляет собой одну полипептидную цепь с

несколькими внутрицепочечными дисульфидными связями. Химотрипсин

гидролизует пептидные связи, образованные остатками фенилаланина,

тирозина и триптофана. Эластаза гидролизует пептидные связи,

образованные пролином . Карбоксипептидаза отщепляет аминокислоты от С-

конца полипептидов .

Деградация коротких пептидов в тонком кишечнике осуществляется

другими пептидазами. В результате белки превращаются в смесь свободных

аминокислот, которые транспортируются через эпителиальные клетки,

выстилающие тонкие кишки, и переносятся кровью в печень.

Переваривание углеводов . Крахмал и гликоген расщепляются

ферментами до D-глюкозы . Этот процесс начинается во рту во время

пережевывания пищи благодаря действию фермента амилазы , выделяемого

слюнными железами. Амилаза гидролизует

-(1-4)-гликозидные связи в

крахмале и в гликогене. При этом образуется смесь мальтозы , глюкозы и

олигосахаридов . Переваривание углеводов продолжается и завершается в

тонком кишечнике под действием амилазы поджелудочной железы .

Переваривание триацилглицеролов (нейтральных жиров , состоящих из

глицерина и жирных кислот) начинается в тонком кишечнике, куда из

поджелудочной железы поступает зимоген пролипаза. Пролипаза

превращается в активную липазу в присутствии желчных кислот и белка

колипазы . Комплекс липазы , желчных кислот и колипазы присоединяется к

капелькам триацилглицеролов и катализирует гидролитическое отщепление

одного или обоих крайних остатков жирных кислот с образованием смеси

свободных жирных кислот в виде их Na

или K

-солей (мыл) и 2-

моноацилглицеролов . Образовавшиеся мыла и нерасщепленные

ацилглицеролы эмульгируются в виде мелких капелек под действием

перистальтики (перемешивание движением кишечника), а также под

влиянием солей желчных кислот, моноацилглицеролов и фосфолипидов ,

которые являются амфипатическими соединениями и потому

функционируют как детергенты . Детергенты располагаются на границе

раздела фаз жир-вода и стабилизируют эмульсию. Жирные кислоты и

моноацилглицеролы из этих капелек поглощаются кишечными клетками.

Кроме перечисленных пищеварительных ферментов , сок

поджелудочной железы содержит ряд других : карбоксиэстеразы (отщепляют

глицерин от моноацилглицерола ), фосфолипазы (расщепляют фосфолипиды ),

холестеролэстераза (расщепляет эфиры холестерина), рибо - и

дезоксирибонуклеазы (разрушают нуклеиновые кислоты ).

Острый панкреатит – неинфекционное воспаление поджелудочной

железы , которое наступает в результате действия любых причин,

вызывающих :

- повышенную секрецию панкреатического сока и затруднение его

оттока с повышением давления в панкреатических протоках . При этом

происходит нарушение метаболизма клеток и выход ферментов из лизосом в

цитоплазму. Лизосомальные ферменты могут активировать зимогены ;

- заброс в протоки повреждающих клетки и активирующих

панкреатические ферменты веществ ;

- прямое повреждение панкреацитов (заболевания желчевыводящих

путей или двенадцатиперстной кишки, избыточное питание жирной и

жареной пищей , прием алкоголя , нарушения кровообращения в организме и

в железе, травмы поджелудочной железы , отравления, вирусные

заболевания).

Комбинация нескольких пусковых факторов заболевания становится

толчком для активации протеолитических ферментов внутри протоков и

самопереваривания поджелудочной железы . Активные панкреатические

ферменты не только действуют местно, но и поступают за пределы

поджелудочной железы – в окружающие ткани, в полость брюшины , по

портальной системе в печень, по лимфатической системе в кровь. Это

первичные факторы агрессии.

Вторичные факторы агрессии – кинины (брадикинин, серотонин,

гистамин – гормоноподобные вещества местного действия), образование

которых активируется под действием трипсина. Они повышают сосудистую

проницаемость с формированием отека железы . Фосфолипаза стимулирует

выработку простагландинов (еще одна группа гормоноподобных веществ

липидной природы ), которые усиливают секреторную активность

поджелудочной железы и проницаемость мембран. Отмечается также

усиление пероксидного окисления липидов , снижение антиоксидантной

защиты клеток поджелудочной железы и накопление в них ионов Са

Факторы агрессии третьего порядка – ишемические токсины

панкреатического происхождения, например , фактор депрессии миокарда,

вызывающий нарушения сердечной деятельности .

Первыми органами-мишенями ферментной и токсической агрессии

оказываются печень и легкие, затем сердце и центральная нервная система,

затем почки. Развиваются моторные нарушения желудочно-кишечного

тракта. Под влиянием лечения и механизмов тканевой защиты может

произойти частичное восстановление структуры и функций поджелудочной

железы и других поврежденных органов . Может развиться хронический

панкреатит, при котором в стадии обострения клетки поджелудочной железы

погибают, а в стадии затухания обострения на их месте развивается

соединительная ткань.

Клиническая лабораторная диагностика панкреатитов . Существует

около 80 биохимических и технических методов диагностики панкреатитов .

При изучении внешнесекреторной функции поджелудочной железы чаще

всего определяют активность ферментов (амилазы , липазы и трипсина) в

крови; активность амилазы в моче; изоферментный спектр амилазы в крови;

изменения активности амилазы , липазы и трипсина в крови после

стимуляции поджелудочной железы секретином и холецистокинином ;

уровень эластазы и химотрипсина в кале ; исследуют функции околоушной

железы , в которой при хроническом панкреатите могут происходить те же

изменения, что и в поджелудочной железе; исследуют кал на содержание

триацилглицеролов и мышечных волокон; исследуют панкреатический сок и

т.д . При исследовании внутрисекреторной функции поджелудочной железы

применяют те же тесты , что и при диагностике сахарного диабета:

определение глюкозы в крови; тест толерантности к глюкозе; определение

концентрации инсулина и глюкагона в крови.

Определение каталитической активности α-амилазы в сыворотке крови

α-амилаза (КФ 3.2.1.1) катализирует гидролиз крахмала , гликогена и

родственных поли - и олигосахаридов с образованием мальтозы ,

короткоцепочечных декстринов и некоторого количества глюкозы . Фермент

секретируется поджелудочной и слюнными железами, выявлен также в

печени, легких , почках , кишках .

Принцип метода: α-амилаза катализирует гидролиз нерастворимого

цветного крахмального субстрата с образованием растворимого синего

красителя пропорционально каталитической активности фермента.

Концентрацию красителя определяют фотометрически при 590 нм .

Реактивы : 1. Цветной крахмальный субстрат (36 г/л) в фосфатном

буфере (60 ммоль / л) рН 7,0, содержащем натрий хлористый 9 ммоль / л. 2.

Осаждающий раствор: магний сернокислый 1,85 моль / л, кислота

сульфосалициловая 2 ммоль / л, хелатон 3 - 1,3 ммоль / л.

Ход работы представлен в таблице 4.

Таблица 4.

Ход определения амилазы в сыворотке крови

Реагенты , мл Проба Контроль

Субстрат (№ 1) 1,0 1,0

Подогревают 5 мин при 37

Сыворотка 0,1 -

Дистиллированная вода - 0,1

Инкубируют точно 15 мин при 37

Осаждающий реактив (№ 2) 2,0 2,0

Перемешивают. Через 15 мин центрифугируют 5 мин. при 3000

об/мин. или фильтруют. Измеряют оптическую плотность надосадочной

жидкости пробы (А) против надосадочной жидкости контроля . Длина

волны 590 нм .

Расчет. Каталитическую концентрацию

-амилазы находят по

приложенной калибровочной таблице, исходя из полученной оптической

плотности (А ).

Нормальные величины : 2,3-5,8 мккат/ л.

Примечания. Пробы с экстремально высокой концентрацией разводят

физиологическим раствором NaCl, результат умножают на разведение.

Посуда не должна содержать детергенты . Результаты могут быть искажены

следами слюны и пота. Следует фильтровать через бумажную вату .

Диагностическое значение теста: Активность амилазы в сыворотке

крови повышается при остром панкреатите, паротите, хроническом

рецидивирующем панкреатите (но только в первые 2-3 дня от начала

болевого приступа), при кисте поджелудочной железы , стоматите, невралгии

лицевого нерва, паркинсонизме, а также за счет реабсорбции при перитоните,

непроходимости тонкого кишечника, перфорации язвы , разрыве маточной

трубы . Снижение активности фермента наблюдается при депрессии,

аутоиммунном заболевании слюнных желез , панкреонекрозе, отравлении

мышьяком , барбитуратами.

Работа 8. Метаболизм глюкозы в организме человека и его

нарушения. Определение концентрации глюкозы в сыворотке крови и

моче . Качественные реакции на кетоновые тела

Метаболизм глюкозы в клетках организма человека. В клетки тканей

организма глюкоза может поступать как экзогенная из пищи, так и

образованная эндогенно из гликогена (в процессе гликогенолиза) или из

других субстратов (из лактата, глицерата, аминокислот в результате

глюконеогенеза). За перенос глюкозы в клетки отвечают транспортные

белки. Для поступления глюкозы в клетки большинства тканей организма

нужен инсулин. Инсулин – это гормон пептидной природы , который

вырабатывается β- клетками островкового аппарата поджелудочной железы .

Инсулин оказывает свое действие через рецепторы на поверхности клеток . В

клетки некоторых тканей глюкоза проникает и в отсутствие инсулина – это

инсулиннезависимые ткани – слизистая кишечника, нервная ткань,

эритроциты и семенники.

В клетках глюкоза фосфорилируется с помощью фермента

гексокиназы , образуя глюкозо-6-фосфат. Глюкозо-6-фосфат является

субстратом нескольких путей метаболизма.

Типы регуляции углеводного обмена. Субстратная регуляция.

Основным фактором , определяющим метаболизм глюкозы , является ее

концентрация в крови (гликемия). При уровне гликемии меньшем 5,5-5,8

ммоль / л, печень поставляет глюкозу в кровь, при большем уровне, наоборот,

преобладает синтез гликогена в печени и мышцах .

В клетках слизистой кишечника, почках и печени содержится фермент

глюкозо-6-фосфатаза. Этот фермент отщепляет фосфатную группу от

глюкозо-6-фосфата с образованием глюкозы . Свободная глюкоза поступает в

кровь. Таким образом , вышеперечисленные ткани участвуют в регуляции

концентрации глюкозы в крови.

Нервная регуляция. Возбуждение симпатических нервных волокон

приводит к освобождению адреналина из надпочечников . Адреналин

стимулирует расщепление гликогена и повышение концентрации глюкозы в

крови. Раздражение парасимпатических нервных волокон сопровождается

усилением выделения инсулина поджелудочной железой , поступлением

глюкозы в клетку и снижением ее уровня в крови.

Почечная регуляция. В клубочках почек глюкоза фильтруется, затем в

проксимальных канальцах реабсорбируется. При превышении в сыворотке

уровня 8,8-9,9 ммоль / л (почечный порог ) глюкоза выделяется с мочой

(глюкозурия). Почечный порог может быть снижен при заболеваниях почек с

нарушением реабсорбции.

Гормональная регуляция. На уровень глюкозы в крови влияет широкий

спектр гормонов , но только инсулин вызывает снижение уровня глюкозы в

крови – гипогликемию. Инсулин синтезируется в виде неактивного

проинсулина, вэтом виде он накапливается в β-клетках островков

Лангерганса поджелудочной железы . В результате частичного протеолиза

проинсулина образуется активный инсулин и С-пептид . Инсулин не

проникает в клетки; на поверхности клеток существуют рецепторы к

инсулину. Инсулин усиливает поступление в клетки глюкозы , К

аминокислот, активирует многие внутриклеточные ферменты . Инсулин

усиливает синтез белков (протеогенез ), липидов (липогенез ) и гликогена.

Инсулин подавляет распад белков (протеолиз ), липидов (липолиз ), гликогена

(гликогенолиз ) и синтез глюкозы (глюконеогенез ). Глюкагон оказывает

эффекты , противоположные действию инсулина.

Сахарный диабет. Сахарный диабет – это группа обменных

заболеваний, характеризующихся гипергликемией , которая является

результатом снижения синтеза или эффективности действия инсулина.

Выделяют два типа диабета.

Диабета 1 типа (инсулинозависимый диабет) характеризуется

абсолютным дефицитом секреции инсулина. Чаще возникает в молодом

возрасте. Лица с высоким риском развития этого типа диабета могут быть

идентифицированы по наличию в крови антител к клеткам панкреатических

островков и по генетическим маркерам . Причина этого типа диабета –

разрушение клеток островков поджелудочной железы , обычно

аутоиммунное. Факторы риска - вирусные инфекции, воздействие

химических веществ , травмы, воспаление (панкреатит) или удаление

поджелудочной железы .

Диабет 2 типа (инсулинонезависимый диабет) характеризуется

относитель - ным дефицитом секреции инсулина. Начинается обычно у

взрослых. Отмечается снижение чувствительности к инсулину

(резистентность) у клеток инсулин-зависимых тканей . Резистентность может

проявляться на рецепторном и пострецепторном уровне. В крови могут

обнаруживаться антитела к клеточным рецепторам инсулина. В большей

степени наследуется, чем диабет 1 типа. Факторы риска – ожирение,

гипертоническая болезнь, атеросклероз .

Нарушения метаболизма при сахарном диабете. Уменьшение или

прекращение поступления глюкозы в инсулин-зависимые клетки

сопровождается повышением ее уровня в крови. При этом повышается

поступление глюкозы в инсулин-независимые клетки. Избыточная глюкоза в

клетках превращается в сорбитол, который является осмотически активным

веществом и приводит к поступлению воды в клетки. В частности , с

накоплением сорбитола связано возникновение катаракты у больных

диабетом .

Гипергликемия приводит к повышенному гликозилированию белков –

образованию комплексов между глюкозой или фруктозой и аминогруппами

белков и других азотсодержащих молекул. Образующиеся комплексы

называются фруктозамины . Функции гликозилированных белков

нарушаются; так , гликозилированный гемоглобин прочнее связывает

кислород и хуже отдает его тканям . Возникают ишемия тканей , нефропатия

(патология почек ), ретинопатия (патология сетчатки глаза), ангиопатия

(повреждение сосудов ) и другие патологические состояния.

Гипергликемия приводит к глюкозурии – выделению глюкозы с мочой .

Так как глюкоза осмотически активна, происходит увеличение объема

выделяемой мочи (повышение диуреза) и усиление жажды .

Усиление распада липидов приводит к образованию большого

количества ацетил-кофермента А . Избыток ацетил-КоА , который не успевает

окисляться в цикле трикарбоновых кислот, в печени превращается в

кетоновые тела – ацетоуксусную, β-гидроксимасляную кислоты и в ацетон.

Кетоновые тела поступают в кровь и доставляются в другие органы , где

могут быть окислены с выделением энергии. Повышение концентрации

кетоновых тел в крови может привести к кетоацидозу, опасному состоянию,

при котором снижен рН крови.

Усиленный распад белков приводит к снижению веса и иммунитета. Из

аминокислот путем глюконеогенеза образуется глюкоза, при этом

повышается уровень мочевины в крови, которая образуется из аминогрупп

аминокислот.

Биохимические анализы при сахарном диабете.

Диагностика сахарного диабета. В диагностике сахарного диабета

используют определение концентрации глюкозы в крови (норма – 3,33-5,55

ммоль / л) и глюкозы в моче (в норме нет). Тест толерантности к глюкозе

включает определение скорости возврата концентрации глюкозы в крови к

нормальному уровню после приема или внутривенного введения глюкозы . У

здоровых людей через два часа после введения глюкозы ее уровень в крови

возвращается к норме.

Диагностика компенсации сахарного диабета. Определяют

концентрации кетоновых тел в крови и в моче, лактата в крови (для

установления степени ишемии), фруктозаминов и гликозилированного

гемоглобина в крови (прогноз развития осложнений), инсулина и глюкагона

в крови.

Определение глюкозы в сыворотке крови. Глюкозооксидазный метод

Принцип метода. При окислении β-D-глюкозы кислородом воздуха при

каталитическом действии глюкозооксидазы образуется эквимолярное

количество пероксида водорода. Под действием пероксидазы H

окисляет

4-амино- антипирин в присутствии фенолов в окрашенное соединение.

Интенсивность окраски пропорциональна концентрации глюкозы в

анализируемом образце и измеряется фотометрически при длине волны 490-

540 нм .

Реактивы . 1. Рабочий реагент, содержащий калий-фосфатный буфер 0,1

ммоль / л, рН 7,4; 12,5 ед / мл глюкозооксидазы , 2,5 ед / мл пероксидазы , 8-

оксихинолин 0,75 ммоль / л, 4-аминоантипирин 50 ммоль / л. 2. Стандартный

раствор глюкозы 10,0 ммоль / л в 0,15% растворе бензойной кислоты .

Ход работы . Внести в пробирки сыворотку крови и образцы согласно

таблице 5. Пробы тщательно перемешать и инкубировать в течение 15 мин.

при температуре 37°С. После окончания инкубации измерить величину

оптической плотности опытной и калибровочной проб против контрольной

пробы при длине волны 490-540 нм . Окраска проб стабильна в течение 2 ч.

после инкубации при условии предохранения от прямого воздействия

солнечных лучей .

Таблица 5.

Ход определения глюкозы

Реактивы Опытная

проба, мл

Калибровочная

проба, мл

Контрольная

проба, мл

Рабочий реагент 2,0 2,0 2,0

Сыворотка крови 0,02 - -

Стандартный раствор - 0,02 -

O - - 0,02

Расчет. Расчет концентрации глюкозы в анализируемых пробах

провести по формуле :

станд

опыт

⋅=

где С - концентрация глюкозы , ммоль / л; Е

опыт

– оптическая плотность

опытной пробы ; Е

станд

– оптическая плотность калибровочной пробы ; 10 –

концентрация глюкозы в стандартном растворе, ммоль / л

Диагностическое значение теста. Глюкоза - основной компонент

энергетического обмена в организме. Нормальное содержание в крови

составляет 3,33 – 5,55 ммоль / л, в сыворотке и плазме - 3,8 – 6,2 ммоль / л.

Гипергликемия (повышение концентрации глюкозы в крови) может

наблюдаться в физиологических условиях : после обильной углеводной пищи,

физических нагрузок , сильных эмоций.

Гипергликемия может наблюдаться при многих патологических

состояниях : сахарном диабете, остром панкреатите, травмах , сотрясениях и

заболеваниях головного мозга, токсикозах и отравлениях , психическом

возбуждении, повышенной гормональной активности коры надпочечников и

передней доли гипофиза и некоторых других патологиях .

Гипогликемия (снижение концентрации глюкозы в сыворотке крови)

бывает при передозировке инсулина, заболеваниях поджелудочной железы ,