Лабораторные работы и задачи по биохимии, практическое пособие

Подождите немного. Документ загружается.

злокачественных опухолях , некоторых поражениях печени, эндокринных

заболеваниях , врожденной недостаточности ферментов (галактоземия).

Определение глюкозы мочи качественным методом

Принцип метода. Глюкоза восстанавливает соли меди (II), имеющие

голубую окраску, в соли меди (I), выпадающие из раствора в виде красного

осадка.

Реактивы . Реактив Гайнеса, содержащий 13,3 г CuSO

·5H

O, 50 г NaOH

и 15 г глицерина в 1 л H

Ход определения. К 4 мл реактива Гайнеса приливают 1 мл мочи .

Ставят в кипящую баню на 2 - 3 минуты . В присутствии глюкозы появляется

желтая или красная окраска жидкости и осадок . При отсутствии глюкозы

цвет жидкости не меняется (остается синим ).

Оценка качества: положительная; слабо положительная ; слабо

отрицательная; отрицательная.

Количественный метод (Альтгаузена) определения глюкозы мочи

Принцип метода. Глюкоза при нагревании с NaOH образует

окрашенное соединение.

Реактивы : 10%-й раствор NaOH.

Ход определения: К 4 мл исследуемой мочи прилить 1 мл 10%-го

NaOH и кипятить 1 - 3 мин. в кипящей водяной бане. Охладить. Через 10

мин. сравнить со шкалой контрольных растворов .

Приготовление контрольных растворов . Взять 1 г сухой глюкозы и

растворить в 25 мл безбелковой , безглюкозной мочи . Из этого 4%-го

раствора готовят разведения:

1. 3 мл раствора + 1 мл мочи = 3%-й раствор

2. 2 мл раствора + 2 мл мочи = 2%-й раствор

3. 1 мл раствора + 3 мл мочи = 1%-й раствор

4. 0,5 мл раствора + 3,5 мл мочи = 0,5%-й раствор .

Контрольные растворы обрабатывают так же, как опытную пробу .

Хранят около 2 недель .

Диагностическое значение. Глюкоза в моче появляется при повышении

ее концентрации в крови выше почечного порога реабсорбции (около 9

ммоль / л). Наличие глюкозы в моче может быть признаком сахарного диабета

или заболевания почек со снижением порога реабсорбции для глюкозы

Качественные реакции на кетоновые тела в моче .

Проба Либена

Реакция основана на свойстве ацетона превращаться в йодоформ в

присутствии йода в щелочной среде. К 1 мл исследуемой мочи добавляют

несколько капель раствора люголя (йод в растворе йодистого калия) и

несколько капель 10%-го раствора гидроксида натрия. При наличии ацетона

в моче появляется помутнение за счет образования йодоформа, имеющего

характерный запах :

C=O + 3I

+ 4N

OH CHI

+ CH

COON

+ 3N

I + 3H

Осадок йодоформа

(желтый, кристаллический)

ацетон

Проба Легаля

Реакция основана на том , что ацетон и ацетоуксусная кислота в

щелочной среде образуют с нитропруссидом натрия комплексные анионы

оранжево-красного цвета, переходящего в вишнево-красный при

подкислении концентрированной уксусной кислотой . К 1 мл мочи добавляют

несколько кристаллов нитропруссида натрия и 3-4 капли 10%-го раствора

гидроксида натрия. При кетонурии появляется оранжевое окрашивание,

которое превращается в вишневое при добавлении 5-8 капель

концентрированной уксусной кислоты .

Проба Герхардта

Енольная форма ацетоуксусной кислоты , взаимодействуя с хлорным

железом , образует комплексное соединение вишнево-красного цвета. К 1 мл

мочи добавляют несколько капель хлорного железа. При наличии в моче

ацетоацетата появляется вишнево-красное окрашивание.

C=O C-OH

COOH COOH

ацетоуксусная ацетоуксусная кислота

кислота (кетоформа) (енольная форма)

Работа 9. Обмен холестерина в организме человека и его

нарушения. Определение концентрации холестерина в сыворотке крови

Холестерин (холестерол) является соединением , типичным для

метаболизма животных, и содержится в значительных количествах в

продуктах животного происхождения - в яичном желтке, мясе, печени и

мозге. Холестерин представляет собой амфипатический липид и является

незаменимым структурным компонентом мембран. Холестерин содержится в

составе липопротеинов либо в свободной форме, либо в виде эфиров с

длинноцепочечными жирными кислотами. Липопротеины транспортируют

холестерин в кровотоке, где легко устанавливается равновесие с

холестерином , входящим в состав других липопротеинов и мембран.

Липопротеины плазмы крови. Нерастворимость жиров в воде

обусловливает необходимость существования специальных транспортных

форм для переноса их кровью . Основные из этих форм : хиломикроны ,

липопротеины очень низкой плотности (ЛПОНП, пре-β-липопротеины ),

липопротеины низкой плотности (ЛПНП, β-липопротеины ), липопротеины

высокой плотности (ЛПВП, α-липопротеины ). Липопротеины представляют

собой мелкие (до 1 мкм диаметром ) глобулярные образования, в которых

молекулы фосфолипидов , холестерина и белков расположены радиально

гидрофильной частью к поверхности , гидрофобной частью к центру.

Центральная часть глобулы занята триацилглицеролами и эфирами

холестерина. Плотность липопротеинов прямо пропорциональна содержанию

белка и обратно пропорциональна содержанию триацилглицеролов .

Обмен холестерина. Холестерин синтезируется во многих тканях из

ацетил-КоА . Приблизительно половина холестерина, имеющегося в

организме, образуется путем биосинтеза (около 500 мг/сутки), а другая

половина поступает с пищей . Холестерин синтезируется главным образом в

печени (до 80%), кишечнике и коже. Холестерин является предшественником

других стероидов , а именно кортикостероидов (гормонов надпочечников ),

половых гормонов , желчных кислот и витамина Д . Из организма человека

ежедневно выводится около 1 г холестерина. Примерно половина этого

количества экскретируется с фекалиями после превращения в желчные

кислоты . Оставшаяся часть выводится в виде нейтральных стероидов .

Желчные кислоты образуются из холестерина в печени. Они способствуют

эмульгированию жиров в процессе пищеварения и всасыванию жиров в

кишечнике. Значительная доля солей желчных кислот, поступающих с

желчью в кишечник , всасывается в кишечнике и через воротную вену

возвращается в печень (кишечно- печеночная циркуляция желчных кислот).

Для восполнения потерь желчных кислот в печени постоянно осуществляется

синтез желчных кислот из холестерина в количествах , эквивалентных

выводимому.

Нарушения обмена холестерина. Все состояния и заболевания, при

которых изменяется содержание холестерина в организме, крови или

отдельных тканях , можно разбить на три группы : первая характеризуется

изменением содержания холестерина в плазме и тканях ; вторая объединяет

все виды гипер - и гипохолестеринемий; к третьей относятся болезни

локального накопления в различных клетках и тканях холестерина и его

производных.

Холестерин является основным компонентом желчных камней , однако

его главная роль в патологии состоит в том , что он служит фактором ,

вызывающим атеросклероз жизненно важных артерий головного мозга,

сердечной мышцы и других органов .

Атеросклероз – патология, характеризующаяся отложением

холестерина в стенках сосудов . Главная причина отложений –

гиперхолестеринемия на фоне повреждений эндотелия, вызванных

гипертонией , воспалительными процессами, повышенной свертываемостью

крови, воздействием токсических веществ (например , компонентов

табачного дыма). В поврежденных участках сосудистой стенки эндотелий

оказывается проницаемым для ряда веществ . В стенку сосуда могут

проникать все липопротеины , кроме хиломикронов . Однако атерогенными

являются ЛПОНП и ЛПНП, содержащие много холестерина. Липопротеины ,

проникшие в сосудистую стенку, поглощаются фагоцитами и все их

составные части , кроме холестерина, разрушаются ферментами. Холестерин

этерифицируется, эфиры холестерина накапливаются в клетках и разрушают

их . Вокруг образующихся липидных бляшек развивается соединительная

ткань, наступает кальцификация пораженного участка сосуда. Сосуды

становятся плотными, неэластичными, ухудшается кровоснабжение тканей ,

на месте бляшек могут возникать тромбы .

Гиперхолестеринемия – результат нарушения в одном из звеньев

сложной биохимической системы, включающей синтез холестерола , его

обмен, транспорт и выведение, формирование липопротеинов , их

катаболизм , рецепцию липопротеинов клетками. Так , значительный избыток

холестерина в питании, хотя и ведет к замедлению его биосинтеза, может

явиться причиной гиперхолестеринемии. При снижении количества

клеточных рецепторов к холестерину клетки теряют способность поглощать

холестерин из крови, что также ведет к развитию гиперхолестеринемии.

В настоящее время методы предупреждения и лечения атеросклероза

направлены на то, чтобы уменьшить его поступление в организм (диеты ),

усилить обратный отток из тканей путем снижения холестеринемии за счет

подавления синтеза, прямого удаления из организма (гемосорбции), путем

ограничения всасывания или увеличения экскреции (прерывание кишечно-

печеночной циркуляции желчных кислот). Отмечено, что содержание в пище

полиненасыщенных жирных кислот является фактором , снижающим

содержание холестерина в крови.

Лабораторная диагностика нарушений обмена холестерина.

Определяют концентрацию общего холестерина в сыворотке (плазме) крови.

Повышение показателя выше 6,5 ммоль / л - указание на возможность

развития атеросклероза. Также определяют концентрацию холестерина во

фракции ЛПВП: снижение этого показателя ниже 0,9 ммоль / л указывает на

возможность развития атеросклероза. Вероятность развития атеросклероза

прогнозируется оптимально так называемым индексом атерогенности –

отношением суммарного содержания холестерина в ЛПНП и ЛПОНП к его

содержанию в ЛПВП. Это отношение в 20-30 лет от 2 до 2,8; старше 30 – до

3,5, а у больных атеросклерозом – выше 4,0. Диагностическое значение имеет

и содержание суммарного содержания холестерина к сумме фосфолипидов : в

норме около 1,0, при атеросклерозе 1,5 и выше.

Определение концентрации общего холестерина в сыворотке крови

Принцип метода. При гидролизе эфиров холестерина ферментом

холестеролэстеразой образуется свободный холестерин. Образовавшийся и

имеющийся в пробе холестерин окисляется кислородом воздуха под

действием холестеролоксидазы с образованием эквимолярного количества

перекиси водорода. Под действием пероксидазы перекись водорода окисляет

хромогенные субстраты с образованием окрашенного продукта.

Интенсивность окраски пропорциональна концентрации холестерина в

пробе.

Реактивы . 1. Рабочий реагент: 0,1 моль / л фосфатный буфер ,

содержащий 20 ммоль / л фенол, детергенты , активаторы и стабилизаторы

ферментов , хромогены , 200 U/л холестеролэстеразы , 250 U/л

холестеролоксидазы , 500 U/л пероксидазы . 2. Стандартный раствор

холестерина содержит 5,17 ммоль / л холестерина.

Ход работы . В трех пробирках – опытной , калибровочной и

контрольной – смешивают реактивы согласно таблице 6.

Содержимое пробирок тщательно перемешивают и инкубируют не

менее 5 мин. при температуре 37°С. Измеряют оптическую плотность

опытной и калибровочной проб против контрольной пробы при длине волны

490-500 нм . Окраска стабильна в течение 2 часов при предохранении от

прямого солнечного света.

Таблица 6.

Ход определения холестерина

Реактивы , мл Опытная проба Калибровочная

проба

Контрольная

проба

Сыворотка 0,02 - -

Вода

дистиллированная

- - 0,02

Рабочий реагент 2,0 2,0 2,0

Стандартный раствор

холестерина

- 0,02 -

Расчет. Расчет концентрации холестерина проводят по формуле :

С = (Е

ст

)х 5,17 ммоль / л,

где Е

– оптическая плотность опытной пробы ;

ст

– оптическая плотность калибровочной пробы ,

измеренные относительно контрольной пробы .

Содержание холестерина: идеальное содержание < 5,2 ммоль / л;

допустимое содержание – 5,2 – 6,5 ммоль / л;

патологическое содержание > 6,5 ммоль / л.

Диагностическое значение теста. Увеличение концентрации

холестерина в крови – гиперхолестеринемия – является достоверным

фактором риска развития атеросклероза.

Работа 10. Методы определения и классификация витаминов.

Колориметрический метод определения аскорбиновой кислоты в плазме

Методы определения витаминов в биологических объектах делят на

физико-химические и биологические. Некоторые витамины обладают

способностью поглощать оптическое излучение определенной части спектра.

В частности , витамин А имеет специфичную полосу поглощения при 328-330

нм . Его концентрацию определяют спектрофотометрически. При

взаимодействии витаминов с рядом химических соединений наблюдаются

характерные цветные реакции. Поэтому витамины можно определить

фотоколориметрически, например , витамин B

- при помощи диазореактива и

т.д. Для определения витаминов B

, В

и других применяют

флюорометрические методы . Используют и титриметрические методы ,

например , при определении витамина С применяют титрование pacтвором

2,6-дихлорфенолиндофенола . Эти методы позволяют судить о

количественном содержании витаминов в исследуемом пищевом продукте

или органах и тканях животных и человека.

Для выяснения обеспеченности организма человека каким -либо

витамином часто количественно определяют соответствующий витамин или

продукт его обмена в сыворотке крови, моче или биопсийном материале .

Экскрецию витаминов рассчитывают на 1 г креатинина. Объективную

информацию об обеспеченности организма витамином также дает

определение активности ферментов , использующих в ходе катализа

коферментную форму данного витамина. Например , определение степени

активации транскетолазы эритроцитов после добавления тиаминпирофосфата

является чувствительным тестом оценки обеспеченности организма

витамином B

Биологические методы основаны на определении того минимального

количества витамина, которое при добавлении к искусственной диете,

лишенной данного витамина, предохраняет животное от развития

авитаминоза или излечивает его от уже развившейся болезни. Это количество

витамина принимают за единицу (в литературе известны «голубиные» ,

«крысиные» единицы ). Большое место в количественном определении ряда

витаминов : фолиевой кислоты , витамина В

и др. в биологических

жидкостях , в частности , в крови, занимают микробиологические методы ,

основанные на измерении скорости роста бактерий; последняя

пропорциональна концентрации витамина в исследуемом объекте.

Количество витаминов принято выражать, кроме того, в миллиграммах ,

микрограммах , международных единицах (ME или IU).

Классификация витаминов

Современная классификация витаминов не является совершенной . Она

основана на физико-химических свойствах (в частности , растворимости ) или

на химической природе, но до сих пор сохраняются и буквенные

обозначения. В зависимости от растворимости в неполярных органических

растворителях или в водной среде различают жирорастворимые и

водорастворимые витамины . В приводимой классификации витаминов ,

помимо буквенного обозначения, в скобках указан основной биологический

эффект, иногда с приставкой «анти», указывающей на способность данного

витамина предотвращать или устранять развитие соответствующего

заболевания; далее приводится номенклатурное химическое название

каждого витамина.

Витамины , растворимые в жирах :

1. Витамин А (антиксерофтальмический); ретинол;

2. Витамин D (антирахитический); кальциферолы ;

3. Витамин Е (антистерильный, витамин размножения); токоферолы ;

4. Витамин К (антигеморрагический); нафтохиноны .

Витамины , растворимые в воде:

1. Витамин B

(антиневритный); тиамин;

2. Витамин В

(витамин роста); рибофлавин;

3. Витамин В

(антидерматитный, адермин); пиридоксин;

4. Витамин В

(антианемический); цианкобаламин; кобаламин;

5. Витамин РР (антипеллагрический, ниацин); никотинамид ;

6. Витамин В

(антианемический); фолиевая кислота;

7. Витамин В

(антидерматитный); пантотеновая кислота;

8. Витамин Н (антисеборейный, фактор роста бактерий, дрожжей и грибков );

биотин;

9. Витамин С (антискорбутный); аскорбиновая кислота;

10. Витамин Р (капилляроукрепляющий, витамин проницаемости );

биофлавоноиды .

Помимо этих двух главных групп витаминов , выделяют группу

разнообразных химических веществ , из которых часть синтезируется в

организме, но обладает витаминными свойствами. Для человека и ряда

животных эти вещества принято объединять в группу витаминоподобных.

Колориметрический метод определения аскорбиновой кислоты в

плазме крови

Принцип метода. Метод основан на учете интенсивности окраски

продукта, образованного в результате взаимодействия аскорбиновой кислоты

и фосфорно-вольфрамовой кислоты .

Реактивы . 1. Раствор фосфорно- вольфрамовой кислоты (в 30 мл воды

при нагревании на водяной бане растворяют 20 г NaWО

•2Н

0 и 10 г

Nа

HPО

•2Н

О ; в 15 мл воды растворяют 5 мл концентрированной H

затем второй раствор медленно вливают в теплый раствор вольфрамата и

смесь кипятят с обратным холодильником в течение 2 ч.). 2. Стандартный

раствор аскорбиновой кислоты (2 мг/мл) в 0,5%-м растворе щавелевой

кислоты .

Ход работы . В центрифужную пробирку вносят 2 мл плазмы, затем

медленно прибавляют 2 мл раствора фосфорно- вольфрамовой кислоты ,

перемешивают, оставляют на 30 мин. и центрифугируют 15 мин. при 3000

об/мин. Оптическую плотность супернатанта измеряют против контроля при

700 нм .

Расчет. Концентрацию аскорбиновой кислоты рассчитывают по

калибровочному графику, построенному с использованием

свежеприготовленного стандартного раствора аскорбиновой кислоты

согласно таблице 7. График линеен в интервале концентраций аскорбиновой

кислоты от 0,5 до 2 мг в 100 мл.

Таблица 7.

Приготовление калибровочных растворов аскорбиновой кислоты

Реактивы , мл Номера

пробирок

Эталонный раствор Н

Содержание аскорбиновой

кислоты , мг/мл

1 1 4 0,4

2 2 3 0,8

3 3 2 1,2

4 4 1 1,6

5 5 0 2,0

Задачи по теме «Витамины»

Вариант № 1

1. Суточная потребность взрослого человека в никотиновой кислоте

уменьшается, если в пище содержится большое количество аминокислоты

триптофана. Что можно сказать о взаимосвязи между никотиновой кислотой

и триптофаном на основе этого наблюдения?

2. В левой части страницы перепишите столбиком обозначения

витаминов (см . ниже). Против каждого справа укажите его биологическую

роль .

Витамины : B

(пантотеновая кислота), B

(PP), B

, B

(фолиевая

кислота), А , E, К .

Биологическая роль : а – участвует в реакции образования формильной

группы из серина; б – входит в состав дегидрогеназ ; в – стимулирует обмен

аминокислот; г – участвует в синтезе 2-го фактора свертывания крови; д – в

состав молекулы входит амидная группа; е – ослабляет цепные

свободнорадикальные процессы ; ж – при авитаминозе развивается анемия; з

– при авитаминозе возникает усиленное ороговение эпителия.

3. Объясните, почему работа в горячих цехах значительно повышает

потребность в витаминах .

Вариант № 2

1. Полиневрит у голубей . В ставших классическими экспериментах

голуби, содержащиеся на экспериментальной диете, утрачивали

координацию движений и способность удерживать тело в равновесии.

Уровень пирувата в крови и мозгу этих птиц значительно превышал

нормальный. Такое состояние проходило , если голубям давали мясо.

Объясните эти наблюдения.

2. В левой части страницы перепишите столбиком обозначения

витаминов (см . ниже). Против каждого справа укажите его биологическую

роль .

Витамины : B

, B

(пантотеновая кислота), B

(PP), B

(фолиевая

кислота), С, А , Д , К .

Биологическая роль : а – участвует в переносе ацильных групп; б –

входит в состав флавопротеинов ; в – необходим для образования

гидроксилизина и гидроксипролина в составе коллагена; г – в состав

молекулы входят глутаминовая и парааминобензойная кислоты ; д – входит в

состав фоточувствительных элементов глаза; е – образуется в коже под

влиянием ультрафиолетовых лучей ; ж – участвует в образовании γ-

карбоксиглутаминовой кислоты ; з – входит в состав НАД

и НАДФ

3. Объясните, почему в детском возрасте потребность в витаминах

выше, чем у взрослых.

Вариант № 3

1. Lactobacillus casei – представители семейства бактерий ,

используемых для получения таких продуктов брожения, как йогурт,

квашеная капуста, соленья, не способны синтезировать рибофлавин.

Характерное свойство этих бактерий заключается в том , что они получают

энергию за счет расщепления глюкозы до молочной кислоты (рК 3,5). Какой

метод количественного определения рибофлавина вы предложили бы , исходя

из этой информации?

2. В левой части страницы перепишите столбиком обозначения

витаминов (см . ниже). Против каждого справа укажите его биологическую

роль .

Витамины : B

(фолиевая кислота), С, B

(PP), B

, H (биотин), А , Д , Е .

Биологическая роль : а – авитаминоз может возникнуть при нарушении

секреторной функции добавочных клеток желудка; б – является

антиоксидантом ; в – при гиповитаминозе нарушается структура

соединительной ткани; г – связывает СО

; д – входит в состав родопсина; е -

участвует в переносе одноуглеродных фрагментов (метильной группы ); ж -

стимулирует отложение кальция и фосфора в костях ; з – входит в состав

НАДФН.

3. При переходе на рацион с высоким содержанием белка организм

начинает испытывать повышенную потребность в витамине B

. Объясните

механизм этого явления.

Вариант № 4

1. Бактерии Lactobacillus casei растут на простой культуральной среде,

содержащей рибофлавин, пиридоксин и четыре аминокислоты . Если в

культуральную среду добавить полный набор аминокислот и рибофлавин, то

количество пиридоксина, необходимого для оптимального роста бактерий,

сократиться на 90%. Объясните, почему так происходит.

2. В левой части страницы перепишите столбиком обозначения

витаминов (см . ниже). Против каждого справа укажите его биологическую

роль .

Витамины : B

, B

(пантотеновая кислота), B

(PP), H (биотин), Д , E,

К .

Биологическая роль : а – имеет стероидную структуру; б – входит в

состав кофермента А ; в – участвует в окислении сукцината; г – участвует в

окислительном декарбоксилировании пировиноградной и 2-оксоглутаровой

кислот; д – стимулятор биосинтеза протромбина; е – ослабляет цепные

свободнорадикальные процессы ; ж – участвует в реакциях

карбоксилирования; з – входит в состав НАДФН.

3. При расследовании дорожно-транспортного происшествия было

установлено, что водитель страдает гиповитаминозом . Это послужило

причиной столкновения двух автомобилей в ночное время. Недостаток

какого витамина привел к трагедии?

Вариант № 5

1. Бактерии Streptococcus faecalis, обитающие в толстом кишечнике,

нуждаются в витамине фолиевой кислоте. Если в питательной среде

содержатся аденин и тимин, то бактерии могут хорошо расти и в отсутствии

фолиевой кислоты . Почему бактерии нуждаются в фолиевой кислоте?

Почему потребность в фолиевой кислоте исчезает при добавлении в

культуральную среду аденина и тимина?

2. В левой части страницы перепишите столбиком обозначения

витаминов (см . ниже). Против каждого справа укажите его биологическую

роль .

Витамины : B

, B

(пантотеновая кислота), B

, С, А , Д , К .

Биологическая роль : a - стимулирует синтез коллагена в

соединительной ткани; б – переносит остаток уксусной кислоты ; в – является

коферментом сукцинатдегидрогеназы ; г - при гипервитаминозе наблюдается

кальцификация тканей организма; д – входит в состав сложного белка

родопсина; е - участвует в превращении одних аминокислот в другие; ж - при

недостатке витамина увеличивается время свертывания крови; з - при

гиповитаминозе увеличивается содержание пировиноградной кислоты .

3. Объясните целесообразность приема витамина Е и его аналогов

специалистами, работающими в зоне повышенной радиации.

Вариант № 6

1. Витамины А и D можно применять сразу за один прием в

количестве, которое достаточно для поддержания их нормального уровня в

течение нескольких недель ; витамины же группы В необходимо принимать

значительно чаще. Почему?