Санагурський Д.І. Об’єкти біофізики: монографія

Подождите немного. Документ загружается.

311

−=

⋅−=

(7.6)

−=

Аналізуючи зображений на рисунку метаболічний шлях,

ми ставили за мету знайти умови, за яких потік у напрямку

утворення продукта реакції Р є найвищим при мінімальних

витратах субстратів (S1 і S2). Тому ми припустили, що

технологічно впливаємо на концентрації ферментів (наприклад,

клонуванням) і можемо маніпулювати їхніми кінетичними

параметрами. Проблема полягає в тому, якими саме параметрами

необхідно маніпулювати, щоб досягнути необхідного результату (в

нашому прикладі − збільшення виходу продукту).

Пуринові попередники перетворюються у рибофлавін і

згодом у флавінові коферменти ФМН і ФАД, піддаються

складному регуляторному впливу як зовнішніх, так і внутрішніх

ефекторів

(

Л. Берталанфи, 1969; А. Бессмертный и др., 1991

)

Структуру метаболічної системи та кінетику її ферментів описано

відповідно до експериментальних даних

(

Д. Бериташвили, Н. Ротт,

1973; Ю. Ашофф, 1984; А. Жулидов и др., 1985

)

. У моделі

вважається, що фермент першої реакції синтезу рибофлавіну ГТФ-

циклогідролаза (Е1) піддається неконкурентному інгібуванню з

312

боку продукта метаболізму Р, тоді кінетичне рівняння швидкості

реакції (v

)

матиме такий вигляд:

де V – максимальна швидкість реакції; S – концентрація субстрату

реакції; I – концентрація інгібітора реакції; K

– константа

інгібування; K

– концентрація субстрату, при якій v=V/2 для I=0

(константа Міхаеліса).

Рівняння швидкості двосубстратних реакцій v

E2,

E8,

E9,

(механізм Ordered BI BI) набудуть вигляду:

де V

– максимальна швидкість прямої реакції; V

– максимальна

швидкість зворотної реакції; K

– константа рівноваги; K

–

константа Міхаеліса для першого субстрату; K

mВ

– константа

Міхаеліса для другого субстрату; K

– константа Міхаеліса для

першого продукту; K

– константа Міхаеліса для другого

продуктf; K

iА

– константа інгібування першим субстратом прямої

реакції; K

iВ

– константа інгібування другим субстратом прямої

реакції; K

– константа інгібування зворотної реакції;

Рівняння швидкості реакцій, zrs каталізуються ферментами

Е3–E6, згідно з кінетикою Генрі – Міхаеліс – Ментен, матимуть

вигляд:

)1(1

imi

+⋅++

⋅

(7.7)

)))1()1(()1((

)()/1(

)/(

iBmBiA

mBiAmB

BKKAKKPAB

KPQABVv

+⋅++⋅⋅++⋅

⋅+++++⋅

−⋅=

(7.8)

313

⋅

, (7.9)

де V – максимальна швидкість реакції; K

– константа Міхаеліса;

S – концентрації субстратів.

Математичний опис біосинтетичного шляху (7.5–7.6) ми

задали в середовищі прикладної програми Gepasi 3.1, назначили

довільно вибрані числові значення для різних параметрів і

промоделювали стаціонарний стан заданої системи. Отримані

результати прийняли як вихідні для дальших досліджень (наш

“дикий тип”). Тоді вибрали 10 параметрів, які могли бути

потенційними мішенями для генетичних маніпуляцій: всі

концентрації ферментів, загальна концентрація кофакторів, а

також кінетичні параметри (і ті, які визначають дію Р як інгібітора

Е1). Для параметрів визначили межі, в яких вони можуть

змінювати свої значення під час оптимізації:

максимальні швидкості реакцій (V) між 0,001 та 1 000;

загальна кількість пулу А ([A]+[AH]) у межах від 1Е–6 до

1Е+6;

регулюючі константи (для Р) у межах від 1Е–7 до 1Е+7.

У ході комп’ютерного експерименту алгоритми числової

оптимізації реалізовували моделюючи стаціонарну поведінку

системи, що дало змогу застосувати різні алгоритми оптимізації

для досягнення поставленої мети. Досліджуючи біосинтетичний

шлях (табл. 7.1-7.3), застосували п’ять оптимізаційних методів

(В.П. Божкова, 1971; А.В. Жулидов и др., 1985; П.Г. Костюк і ін.,

2001).

314

Таблиця 7.1

Розрахункові значення потоку (J8), отримані в результаті

чисельного інтегрування з використанням різних оптимізаційних

алгоритмів

Застосований

метод

Значення потоку (J8)

мкM/c, 10

-4

Кількість

моделювань

“Дикий тип” 0,028 1

Steepest descent

0,32 18

L-BFGS-B

0,30 9

Hooke and Jeevs

0,96 193

Genetic algorithm

0,78 903

Random search

5,55 1 000

На підставі аналізу результатів комп’ютерного

експерименту, наведених у таблиці, виявили, що найліпщий

результат визначення максимуму функції (потоку J8), що на два

порядки перевищує значення “дикого типу”, отримано із

застосуванням методу випадкового пошуку (Random search).

Випадковий пошук – метод оптимізації, у процесі реалізації

якого оптимум знаходять шляхом перевірки значень

досліджуваної функції в серії комбінацій випадкових значень

змінних параметрів. Випадкові значення генеруються у

попередньо визначених межах, більше того, будь-які комбінації

значень параметрів, які виходять за визначені межі, вилучають з

розрахунку.

Порівнюючи значення кінетичних параметрів “дикого

типу” з даними, отриманими у процесі оптимізації, можна зробити

висновок, що оптимальні значення потоку J8 одержали за умов,

коли концентрації ферментів Е1,Е4, Е8 досягали своїх верхніх

граничних значень (від 10 до 100), тоді як концентрації інших ферментів

набували нижніх граничних значень (у межах від 0,01 до 0,1).

315

Таблиця 7.2

Символ, X

Назва метаболіту

Гуанозинтрифосфат (GTP)

Рибулозо-5`-фосфат

2,5-диаміно-4-окси-6-рибозиламінопіримідин-5`-

фосфат

2,5-диаміно-4-окси-6-рибітиламінопіримідин-5`-фосфат

5-аміно-2,4-диокси-6-рибітиламінопіримідин-5`-фосфат

5-аміно-2,4-диокси-6-рибітиламінопіримідин

3,4-дигідрокси-2-бутанон-4-фосфат

6,7-диметил-8-рибітиллюмазин

Рибофлавін

Флавінмононуклеотид (FMN)

Флавінаденіндинуклеотид (FAD)

Таблиця 7.3

Символ, E

Назва ферменту

ЕС no.

GTP-циклогідролаза

Редуктаза

Дезаміназа

Фосфатаза

3,4-дигідрокси-2-бутанон-4-фосфат

синтаза

6,7-диметил-8-рибітиллюмазинсинтаза

Рибофлавінсинтаза

Рибофлавінкіназа

ATФ: ФМН-денілилтрансфераза

3.5.4.25

1.1.1.193

3.5.4.26

3.3.1.-

−−−−

2.5.1.9

2.7.1.26

2.7.7.2

На підставі цих результатів ми можемо припустити, що для

того, щоб досягнути максимуму виходу продукту (Р) за незмінних

концентрацій субстратів, необхідно:

забезпечити надекспресію ферментів Е1, Е4, Е8;

максимально збільшити чутливість цих ферментів до

їхніх субстратів (тобто зменшити K

);

знизити інгібуючу дію продукту (Р) на першу реакцію

метаболізму.

316

7.2. Òðàíñôëàâ³íîâà ìîäåëü

Сукупність реакцій, які задіяні у

метаболізмі флавінів у дріжджів і були покладені в основу моделі,

подано в табл. 7.4. Пуринові попередники перетворюються у

рибофлавін і далі – у флавінові коферменти ФМН і ФАД,

піддаються складному регуляторному впливу як зовнішніх, так і

внутрішніх ефекторів (

Д.Р. Бериташвили и др., 1969, 1970, 1974)

Структуру метаболічної системи та кінетику ферментів описано

відповідно до експериментальних даних (

Д.Р. Бериташвили,

Н.Н. Ротт, 1973

). На основі даних про кінетичні властивості

досліджуваної системи складену систему диференціальних рівнянь,

описаних відповідно до рівнянь масового балансу (7.1):

dGTP

−=

νν

−=

νν

−=

νν

−=

ννν

−

+−=

RRR

−=

νν

−=

(7.10)

317

νν

−=

νν

−=

⋅

νν

98 RR

FMN

−=

FAD

Таблиця 7.4

Опис ферментативних реакцій які задіяні у метаболізмі

рибофлавіну у дріжджів

Номер

реакції

КФ Назва ферменту Схема реакції

R1 3.5.4.25 GTP-циклогідролаза

GTP + 3H

O = HCOO

+ PP

+ 2,5-диаміно-

4-окси-6-рибозиламінопіримідин-5’-фосфат

R2 1.1.1.193 Редуктаза

2,5-диаміно-4- окси-6-рибозил-

амінопіримідин-5’-фосфат + NADPH =

2,5-диаміно-4- окси-6-рибітил-

амінопіримідин-5’-фосфат + NADP

R3 3.5.4.26 Дезаміназа

2,5-диаміно-4- окси-6-рибітил-

амінопіримідин-5’-фосфат + H

O = 5-

диаміно-4- окси-6-рибітил-

амінопіримідин-5’-фосфат + NН

3.1.3.- Фосфатаза

5-диаміно-4- окси-6-рибітил-

амінопіримідин-5’-фосфат = 5-диаміно-4-

окси-6-рибітил-амінопіримідин

R5 ----------- 3,4-дигідрокси-2-

бутанон-4-

фосфатсинтаза

Рибулозо-5-фосфат (S2) = 3,4-дигідрокси-

2-бутанон-4-фосфат + НСООН

6,7-диметил-8-

рибітиллюмазин-

синтаза

5-диаміно-4- окси-6-рибітил-

амінопіримідин + 3,4-дигідрокси-2-

бутанон-4-фосфат = 6,7-диметил-8-

рибітиллюмазин + Р

.5.1.9

2.5.1.9

Рибофлавін синтаза

2 6,7-диметил-8-рибітиллюмазин =

Рибофлавін + 5-аміно-2,4-диокси-6-

рибітиламінопіримідин

R8 2.7.1.26 Рибофлавін-кіназа

Рибофлавін (RIB) + ATP = FMN + ADP

R9 2.7.7.2 Ф:ФМН-аденілил-

транс-фераза

FMN + ATP = FAD + Р

318

Враховуючи складність отриманої системи і жорсткі умови,

яким має відповідати система, щоб досягнути стаціонарності,

значення кінетичних параметрів ферментативних реакцій пі-

дібрані довільно на основі аналізу зібраних експериментальних

даних і таким чином, щоб відтворювати характер змін у часі кон-

центрацій продуктів біосинтезу, описаних у роботах Шавловського

і співр. (А.В. Жулидов и др., 1985; П.Г. Костюк й ін., 2001).

Механізми дії ферментів описують за такими рівняннями:

(

)

(

)

I/1

VSν

im1

+++− =

VS/ν

+=−

(7.11)

(

)

(

)

(

)

(

)

(

)

()()

()

B/1P

A1P

P/1AB/

PQ/ABVν

ibmbiambmp

iamqeq

mbipeq

++++

++++−=−

(

)

(

)

(

)

(

)

A/1P

AB/

P/ABVν

iampeq

mbeq

++++−=−

де V – максимальна швидкість реакції; S – концентрація субстрату

реакції; I – концентрація інгібітора реакції; К

, – константа

інгібування; К

– концентрація субстрату, при якій v=V/2 для I=0

(константа Міхаеліса), V

– максимальна швидкість прямої реакції;

– максимальна швидкість зворотної реакції, K

– константа

рівноваги; K

– константа Міхаеліса для першого субстрату; K

–

константа Міхаеліса для другого субстрату; К

тP

– константа Міхаеліса

для першого продукту; К

тQ

– константа Міхаеліса для другого

продукту; К

– константа інгібування першим субстратом прямої

реакції; К

– константа інгібування другим субстратом прямої реакції;

– константа інгібування зворотної реакції.

319

У цьому розділі описано кінетичну поведінку моделі, яку

було отримано в результаті проведеного модельного експерименту,

порівняно результати моделювання з даними дослідження

особливостей метаболізму рибофлавіну у дріжджів Pichia

guilliermondii отриманими in vivo. Встановлено, що модель

біосинтезу рибофлавіну і його похідних здатна відтворювати

стан системи при різних заданих внутрішніх параметрах. Щоб

дослідити відтворювальні можливості моделі, змінювали окремі

параметри системи і знову розраховували систему рівнянь (7.10).

Результати порівнювали як з даними вихідної моделі, так і з

експериментально отриманими даними. З метою аналізу впливу

змін внутрішніх параметрів системи вимірювали значення

концентрацій метаболітів у кінцевій точці інтегрування. Для

аналізу вибрали саме цю стадію, оскільки це критична точка, в

якій можна виміряти значення концентрацій як продуктів

біосинтезу, так і їхніх попередників.

У результаті чисельного інтегрування отримали динаміку

накопичення продуктів біосинтезу – рибофлавіну та флавінових

коферментів. Доведено, що вміст флавінів поступово наростає з

виходом на стаціонарний рівень, а концентрація флавінових

нуклеотидів, порівняно з аналогічною рибофлавіну була значно

меншою (рис. 7.2, 7.3). Причому співвідношення рибофла-

він/флавінові нуклеотиди на різних етапах збільшувалося до рівня

в 5,9 разів на стаціонарній стадії, що узгоджується з

експериментальними даними (А.В. Жулидов и др., 1985).

Результати є подібні до описаних Шавловським і співр. даних про

накопичення флавінів у культуральній рідині і в клітинах при

вирощуванні дріжджів Pichia guilliermondii на середовищі з

високим вмістом заліза.

320

Рис. 7.2. Динаміка накопичення флавінів у моделі при низьких значеннях

максимальної швидкості реакції (V):

а: 1 – флавінові нуклеотиди; 2 – рибофлавін; 3 – динаміка накопичення рибофлавіну при

насиченні ферменту (R6) субстратом (S2);

б: 1 – ФМН; 2 – рибофлавін; 3 – ФАД; 4 – сумарний вміст флавінів у клітині

Динаміка утворення продуктів значною мірою залежить від

доступності субстратів. Зокрема, значне накопичення рибофлавіну,

порівняно з флавіновими нуклеотидами в моделі, зумовлено досить

низькою концентрацією другого субстрату для рибофлавінкінази –

АТФ. На рис. 7.2 (б) зображено дані про вміст окремих флавінів, які

отримано на моделі при підвищенні концентрації АТФ у 10 разів.

Вони відповідають динаміці накопичення флавінів клітинами,

описаній у роботі (А.В. Жулидов и др. 1985), згідно з якими в фазі

сповільненого росту (30–60 год) вміст флавінів зростав головно за

рахунок ФАД, кількість вільного рибофлавіну була найвищою на

початку фази сповільненого росту, а перед початком стаціонарної

фази значно зменшувалась. Також встановлено, що при насиченні

ферменту 6,7-диметил-8-рибітиллюмазинсинтаза (R6) субстратом

спостерігається значне зростання швидкості утворення продуктів

біосинтезу, зокрема, рибофлавіну (рис. 7.2).