Шендрик А.Н. Химия белка. Структура, свойства, методы исследования

Подождите немного. Документ загружается.

Реакция Эдмана. Фенилизотиоцианат легко реагирует с аминокисло-

той в пиридиново-водной среде при рН=8-9 и Т=40

С с образованием фенил-

тиокарбамоилпроизводных аминокислот. В неводных средах эти производ-

ные циклизуются с образованием фенилтиогидантоинов амсинокислот.

Уравнения этих реакций мы детально рассмотрим в разделе посвященном

методам секвенирования пептидных цепей. Фенилтиогидантоины различных

аминокислот легко разделяются хроматографически. После гидролиза щело-

чью они дают исходную аминокислоту и ФИТЦ.

Ацилирование. Под ацилированием аминокислот понимают широкий

круг реакций, которые направлены на введение в аминокислоты остатков

карбоновых кислот, арилсульфокислот или сложных эфиров различных ки-

слот.

Примерами ацилирования аминокислот является взаимодействие их с

муравьиной кислотой, уксусным ангидридом или газообразным кетеном при

нагревании.

CHR COOH

CO NHCHR COOH

CHR COOH

CO NHCHR COOH

Реакция идет в ледяной

кс

сной кислоте

Введение остатка органической кислоты часто используют для оценки

влияния ацетилирования концевых α-NH

- и ε-NH

-групп лизина на функ-

циональные свойства белка.

Бензиловые эфиры

хлоругольной кисло-

ты. Они оказались

полезными для защи-

ты свободной амино-

группы (КБЗ-защита,

посредством карбо-

бензоксихлоридов) в процессе синтеза пептидов.

Реакция Ван-Слейка. Аминогруппа аминокислоты реагирует с азоти-

стой кислотой с образованием оксикислоты и выделением газообразного азо-

та:

HNO

CHR COOH

HO CHR COOH

-H2O

Эта реакция является классической для оценки хода гидролиза белков

по количеству выделившегося азота, которое легко определяется манометри-

ческим методом.

Достоинства метода Ван-Слейка: реакция протекает быстро (5-10 мин.); реа-

гируют только α-NH

-группы аминокислот и N-концевые группы пептидов.

Ни ε-NH

-группа лизина, ни аммиак, отщепляющийся от амидов аспарагино-

вой и глутаминовой кислот за такое короткое время не успевают прореагиро-

вать с азотистой кислотой.

Реакция с формальдегидом (формольное титрование). Эту реакцию

впервые предложил Зеренсен. Она находит широкое применение для оценки

степени гидролиза белка по количеству освобождающихся карбоксильных

групп. Аминогруппы блокируются формальдегидом, а карбоксильные оттит-

ровываются щелочью:

OCOCl

CHR COOH

OCO NH CHR COOH

КБЗ-защита

-HCl

СH

O + H

N-CHR-COOH → CH

=N-CHR-COOH + H

=N-CHR-COOH + NaOH → CH

=N-CHR-COONa + H

Формальдегид способен также образовывать метиленовые мостики между

амино- и какой-либо другой реакционноспособной группой, содержащей

подвижные атомы водорода (имидазольной, гуанидиновой, индольной, SH- и

-OH группы). Эта реакция широко применяется для получения модифициро-

ванных белков.

Переаминирование. При кипячении водных растворов α-аминокислот

с α-кетокислотами происходит переход α-аминогруппы от аминокислоты к

α-кетокислоте:

RCOCOOH

R' CH COOH

R' CO COOH

R CH COOH

Переаминирование сопровождается часто декарбоксилированием. В присут-

ствии кислорода происходит окислительное дезаминирование и декарбокси-

лирование:

R-CHNH

-COOH + O

+ H

O → RCHO + NH

+ H

O + CO

В клетках реакции переаминирования катализируются ферментами - ами-

нотрансферазами.

Образование оснований Шиффа. Аминокислоты взаимодействуют с

альдегидами подобно первичным аминам с образованием шиффовых основа-

ний:

RCHNH

COOH

R'CHO

RCHN

COOH

CHR'

-H2O

Реакцию проводят в ледяной уксусной кислоте и исследуют полученные ос-

нования Шиффа методом электронной спектроскопии или фотоколоримет-

рии..

Реакция с фосгеном. Фосген образует с α-аминокислотами N-

карбоксиангидриды (ангидриды Лейкса):

COCl

N C COOH

-2HCl

Ангид

ид Лейкса

Ангидриды Лейкса взаимодействуют с нуклеофильными реагентами и игра-

ют важную роль в качестве промежуточных продуктов синтеза пептидов.

1.1.7 Групповые реагенты на аминокислоты

Нингидрин. В качестве группового локализующего агента применяется

0,25%-ный (масс./об.) рас-

твор нингидрина в ацетоне.

Нингидрин, как сильный

окислитель, приводит к де-

заминированию аминокис-

лоты с образованием ам-

миака, двуокиси углерода,

соответствующего альдеги

CHR COOH

RCHO

Нингидрин (исходная, окисленная, форма)

Восстановленная форма

да и восстановленной формы нингидрина:

Восстановленная форма нингидрина реагирует далее с избытком нин-

гидрина и аммиаком, образуя продукт сине-фиолетового цвета с λ

мах

580нм. Оптическая плотность при этой длине волны является практически

линейной функцией числа аминогрупп. Исходя из этого, на основе нингид-

риновой реакции разработан фотоколориметрический метод количественного

определения аминокислот. Сине-фиолетовый продукт реакции имеет сле-

дующее строение:

Если реакцию с нингидрином проводить при рН=1-5, то количество

свободной аминокислоты можно определить по объему выделившейся дву-

окиси углерода. Пептиды и первичные амины также дают сине-фиолетовое

окрашивание с нингидрином. Однако, СО

в этих случаях не образуется. Это

позволяет проводить анализ аминокислот в присутствии пептидов. Пролин и

оксипролин образуют с нингидрином ярко желтый продукт (λ

мах

=440 нм.),

что позволяет анализировать смеси амино- и иминокислот без их предвари-

тельного разделения.

После проведения нингидриновой реакции и разделения смеси мето-

дом хроматографии в тонких слоях пятна можно проявлять нагреванием при

100°С в течение 5 мин или, с целью получения более светлого фона, выдер-

живанием при комнатной температуре в течение нескольких часов. Амино-

кислоты дают пурпурные пятна; гистидин и глицин красно-серые; фенилала-

нин, тирозин и аспарагиновая кислота синие; триптофан коричневые; аспара

гин грязно-желтые; пролин желтые. Чувствительность метода варьирует в

диапазоне от 0,2 мкг для глицина до 2 мкг для гистидина.

Для идентификации по окраске используют смесь 50 мл 0,1%-ного рас-

твора нингидрина в этаноле + 2 мл коллидина. В некоторых работах реко-

мендуется добавлять 10 мл СН

СООН. Чем ниже чистота коллидина, тем

лучше окраска. Хроматограмму нагревают, наблюдая за развитием окраски.

Окраску, даваемую каждой аминокислотой, лучше всего определить экспе-

риментально, но следует особо отметить, что тирозин меняет окраску через

несколько секунд после ее появления, и пятна многих других аминокислот

спустя несколько минут приобретают пурпурную и синюю окраску.

Некоторые исследователи предпочитают измененный вариант приве-

денных выше методик, с участием иона меди. Это диктуется необходимо-

стью достичь такого различия в окраске, чтобы можно было идентифициро-

вать все аминокислоты. В соответствии с этой методикой готовят два раство-

ра: 1) 0,2%-ный раствор нингидрина в 50 мл этанола + 10 мл уксусной кисло-

ты + 2 мл коллидина; 2) 1%-ный раствор Сu(NO

)

•3H

O. Хроматограмму

опрыскивают свежеприготовленной смесью 25 мл раствора (1) и 1,5 мл рас-

твора (2); высушивают и нагревают в течение 1,5-2 мин при 105°С. Таким же

образом обрабатывают пластинки ТСХ. Пластинки высушивают, опрыски-

вают реагентом и подогревают так, чтобы за окраской можно было наблю-

дать по мере ее появления.

Для обнаружения N-метиламинокислот (которые обычно дают очень

слабую окраску с нингидрином) в присутствии свободных аминокислот ис-

пользуют специальный реагент. Смешивают равные объемы 0,33%-ного рас-

твора нингидрина в трет-бутаноле и смеси ледяная уксусная кислота-вода-

пиридин (1: 5 : 5). Опрыскивают и нагревают 10-15 мин при 100-110°С. Пер-

вичные амины и N-метиламинокислоты дают пурпурные пятна сравнимой

интенсивности. При опрыскивании водным раствором нингидрина, приго

товленным путем растворения нингидрина в н-бутаноле, насыщенном водой

и содержащем 2% уксусной кислоты, N-метиламинокислоты дают пятна сла-

бой интенсивности.

Окрашенная нингидрином бумага выцветает под действием воздуха и

света. Для более длительного сохранения окраски можно дополнительно оп-

рыскать реагентом, содержащим Cu(NО

)

;. К 1 мл насыщенного раствора

Cu(NО

)

добавляют 0,2 мл 10%-ной НNO

и доводят до 100 мл 95%-ным

этанолом. Лучше всего бумагу покрыть пленкой, погрузив ее в насыщенный

раствор полиметилметакрилата в хлороформе.

Флуорескамин. Этот реагент реагирует с первичными аминогруппами

аминокислот и пептидов. Хроматограмму опрыскивают 0,05%-ным раство-

ром флуорескамина в ацетоне и наблюдают флуоресцирующие пятна. Пред-

варительное и последующее опрыскивание хроматограммы 10%-ным раство-

ром триэтиламина в метиленхлориде повышает чувствительность методики

(до 1 нмоль), а также устойчивость образующихся флуоресцирующих пятен.

Пятна пролина и гидроксипролина медленно проявляются при нагревании в

течение 3 ч при 110°С или через два дня при комнатной температуре. В дру-

гом варианте методики бумагу или пластинку обработанную флуоресками-

ном, вымачивают последовательно в 0,1 М растворе уксусной кислоты в аце-

тоне и 0,1 М растворе N-хлоросукцинимида в ацетоне. Выдерживают 5 мин,

промывают ацетоном и нагревают 5-10 мин при 110°С.

Изатин. Один из недостатков нингидрина состоит в том, что пролин

может быть легко «замаскирован» пятнами других аминокислот. Были опи-

саны два реагента, лишенные этого недостатка и в то же время обеспечи-

вающие широкий диапазон цветов при хроматографическом определении

аминокислот.

1 г. изатина + 1,3 г. ацетата цинка растворяют в 70-80 мл нагретого изо-

пропанола. По охлаждении добавляют 1 мл пиридина.

1 г изатина + 1,5 г ацетата цинка растворяют в 93 мл нагретого изопро-

панола + 3 мл воды. По охлаждении добавляют 1 мл ледяной уксусной ки-

слоты.

Эти реагенты дают наборы пятен, слегка различающиеся по окраске. В

обоих случаях хроматограмму опрыскивают, высушивают и прогревают при

80-85°С в течение 10 мин. Фон может быть отмыт без изменения окраски

аминокислотных пятен быстрым ополаскиванием хроматограммы водой.

Наблюдения в УФ-лучах. Возможны следующие методики анализа

аминокислот с использованием УФ-облучения.

Аминогруппы могут реагировать со свободными альдегидными груп-

пами, содержащимися в хроматографической бумаге. Образующиеся ос-

нования Шиффа дают синюю флуоресценцию в УФ свете. Хроматограмму

нагревают при 100°С в течение 30 мин. N-Замещенные аминокислоты да-

ют темные пятна. Чувствительность немного ниже, чем при использова-

нии нингидрина, некоторые аминокислоты могут разрушаться.

Хроматограмму опрыскивают 0,2%-ным раствором салицилового аль-

дегида в ацетоне. Образующиеся основания Шиффа могут разлагаться при

опрыскивании водой и под действием воздуха.

Хроматограмму пропитывают 0,01%-ным раствором 1,2-нафтохинон-4-

сульфоната – (реагент Фолина) в метаноле. Нагревают при 110-120°С в

течение 10 мин.

Иод. Метод, не вызывающий разрушения аминокислот, но неспеци-

фичный. Бумагу или тонкослойную пластинку обрабатывают парами I

(от

нескольких кристаллов) в стеклянном сосуде. Через 10-30 с хроматограмму

вынимают и отмечают карандашом быстро исчезающие коричневые пятна. В

другом варианте: бумагу можно опрыскать петролейным эфиром (фракция с

т.кип. 60 - 80°С), насыщенным I

Хлор Пригоден для определения аминокислот, N-блокированных ами-

нокислот и пептидов. Тест специфичен для соединений, содержащих связь N-

С, поэтому такие растворители, как пиридин и коллидин, должны быть уда-

лены. Бумагу или тонкослойную пластинку промывают эфиром, а затем сме-

сью (1:1) ацетон-этанол (в этих растворителях аминокислоты и пептиды не-

растворимы). Обрабатывают в течение 5 мин Сl

, для чего помещают над

ванночкой, в которой находятся равные объемы насыщенного раствора

КМnО

и 10%-ной НС1. Хроматограмму вынимают, проветривают для уда-

ления избытка С1

и погружают в смесь равных объемов насыщенного рас-

твора о-толуидина в 2%-ной уксусной кислоте и 0,05 М раствора KI. На свет-

лом фоне возникают сине-черные пятна. Фон может быть уменьшен, если

бумагу, обработанную хлором, перед помещением в раствор о-толуидина об-

работать в течение 10с парами аммиака.

Образование полных и неполных ангидридов аминокислот.

Эта реакция интересна исторически. Образование дикетопиперазинов

при гидролизе белков явилось основанием для создания ошибочной дикето-

пиперазиновой тео-

рии строения белка

Н. Зелинским в

1914г., которая впо-

следствии развива-

лась его учениками

В. Садиковым и

Н.Гавриловым.

NCHC

CHC

HN CH C

CHC

Неполный ангидрид (дипептид)

олный ангид

ид (дикетопипе

азин)

NHCHC

HN CH C

1.1.8 Специфические реагенты на аминокислоты

Если по каким-либо причинам невозможно идентифицировать пятно

по его положению и окраске с использованием общих тестов, существуют

реагенты, специфичные к одной аминокислоте или группе аминокислот.

Тирозин

Реакция Фолина и Дениса с α-Нитрозо-

-нафтол. Хроматограмму

погружают в 0,1%-ный раствор α-нитрозо-β-нафтола в ацетоне, высушивают

при комнатной температуре. Затем погружают ее в ацетон, к которому до-

бавлено 10% (об.) конц. НNО

; высушивают и постепенно прогревают, начи-

ная с одной стороны так, чтобы можно было следить за появлением пятен на

хроматограмме. Желтый цвет бумаги светлеет в участке, который достаточно

прогрет. Тирозин определяется по красной окраске, чувствительность ~ 1

мкг. Триптофан дает окраску от серой до коричневой с меньшей чувстви-

тельностью. Фенол и коллидин следует удалять промыванием смесью (1:1)

ацетон-диэтиловый эфир. Тирозин определяют также с помощью теста Пау-

ли (см. ниже).

Реакция Милонна - реакция с закисными и окисными солями ртути и

азотистой кислотой. Чувствительность около 50 мкг/мл.

Триптофан и родственные соединения

Реагент Эрлиха

Хроматограмму погружают в 1%-ный (масс./об.) раствор пара-

диметиламинобензальдегида в смеси (9:1) ацетон-конц. НС1; выдержива-

ют при комнатной температуре несколько минут. Триптофан дает пурпур-

ное пятно, пирролы и родственные соединения дают красные пятна.

Можно также опрыскать хроматограмму 2%-ным раствором п-

диметиламинобензальдегида в 5%-ной НС1 и затем высушивать при ком