Шендрик А.Н. Химия белка. Структура, свойства, методы исследования

Подождите немного. Документ загружается.

натной температуре. Триптофан дает пурпурную окраску, ароматические

амины и цитруллин желтую.

УФ-облучение

Бумагу высушивают при комнатной температуре. Наблюдают в УФ-

свете. Триптофан или совсем не дает окрашивания или дает очень слабое

окрашивание (что обусловлено наличием продуктов распада, и обычно

соответствующее им пятно расположено немного впереди истинного). Не-

которые родственные соединения хорошо видны в результате взаимодей-

ствия с бумагой, например кинуренин (синее окрашивание); кинуреновая

кислота (сине-зеленое); гидроксикинуреновая кислота (зеленовато-

желтое); аминоацетофенон (небесно-голубое); 2-амино-З-гидроксиацето-

фенон (желтое); ксантуреновая кислота (синее); антраниловая кислота

(сине-фиолетовое); гидроксиантраниловая кислота (небесно-голубое).

Ароматические растворители иногда мешают.

Хроматограмму опрыскивают смесью (6:1) хлорная кислота (70-72%-

ная) - вода. Триптофан в течение 10 мин дает устойчивую и интенсивную

зелено-синюю флуоресценцию. Последующее опрыскивание 1%-ным рас-

твором FеС1

дает красновато-желтую окраску.

Терефталевый альдегид в кислой среде. Опрыскивают 0,2%-ным рас-

твором терефталевого альдегида в ацетоне, содержащем 10% уксусной ки-

слоты. Хроматограмму прогревают при 105°С в течение 3 мин. Триптофан

дает синее пятно. Этот реагент чрезвычайно чувствителен.

Гистидин

Реагент Паули. Раствор 1 (1%-ная сульфаниловая кислота в 1 М НС1)

и раствор 2 (5%-ный водный раствор NaNO

) выдерживают в холодильнике.

Равные объемы этих растворов смешивают (также на холоду) за 5 мин до ис-

пользования. Осторожно, чтобы не смыть пятна. опрыскивают бумагу. Затем

опрыскивают 15%-ным раствором Na

CО

. Гистидин и другие имидазолы

сразу дают красную окраску. Окрашенные пятна с меньшей чувствительно-

стью дают также гистамин (розово-коричневое ); тирозин (розовое); ксантин,

дииодотирозин (оранжевое); тиамин, триптофан, аденин (розовое); гуанин

(оранжево-пурпурное); катехин (пурпурное).

Для уменьшения мешающего влияния тирозина методику можно изме-

нить. Хроматограмму опрыскивают 0,1%-ным раствором п-анизидина в сме-

си (1:1) этанольных растворов 0,11 М НС1 - 10%-ный амилнитрит. Высуши-

вают на воздухе при комнатной температуре. Опрыскивают 1%-ным КОН в

этаноле. Перекристаллизованный п-анизидин может «не работать». Удержи-

ваемые бумагой другие растворители, такие, как фенол и коллидин, должны

быть отмыты ацетоном и эфиром.

Терефталевый альдегид. Хроматограмму опрыскивают 0,2%-ным рас-

твором терефталевого альдегида в ацетоне. Прогревают при 105°С в течение

10 мин. Гистидин дает желто-зеленое пятно. Триптофан дает коричневое

пятно в УФ-свете. Реагент очень чувствителен, особенно для гистидина.

Фенилаланин

Нингидрин-NaHCO

. Хроматограмму прокрашивают нингидрином

(см. выше). При опрыскивании нагретой бумаги разбавленным (0,15 - 10%)

раствором NaHCO

устойчиво только пятно фенилаланина.

Серусодержащие аминокислоты

Тетраиодид платины

Хроматограмму погружают в раствор: 0,002 М платинохлороводород-

ная кислота-1 М КI - 2 М НС1-ацетон (4:0,25:0,4:76). После высушивания

при комнатной температуре окраску усиливают путем обработки парами

НС1. Цистин, цистеин, метионин, цистатионин, лантионин, дьенколевая

кислота, метионинсульфоксид и другие дают бесцветные пятна на розовом

фоне. В случае использования в качестве растворителя фенола или колли-

дина бумагу следует сначала промыть смесью (1:1) ацетон-эфир.

Для большей контрастности хроматограммы (темно-коричневый фон)

0,002 М раствор H

PtCl

можно заменить на 0,002 М раствор PdCl

, в 0,1 М

НС1.

Азид-иод. Хроматограмму опрыскивают 0,025 М раствором I; в 50%-

ном этаноле, содержащем 1,5% NaN3. На светло-коричневом фоне момен-

тально проявляются белые пятна цистеина, затем (через 15 мин) цистина, да-

лее (через 60 мин) метионина. Пятна лучше видны в УФ-свете. Этот реагент

позволяет обнаруживать также тиамин.

Нитропруссид. Реагент а. Смешивают 1,5 г нитропруссида натрия в 5

мл 1 М H

+ 95 мл МеОН + 10 мл 28%-ного NН

. Фильтруют. Хромато-

грамму погружают в этот раствор. SH-соединения дают красную окраску.

Еще влажную бумагу погружают в раствор б (2%-ный раствор NaCN в 95%-

ном МеОН). Расщепление связей —S—S— этим реагентом вызывает появле-

ние красной окраски через промежуток времени от нескольких секунд до 10

мин. Для цистина чувствительность 1 мкг. Если нет необходимости опреде-

лять SH-соединения, используют равные объемы растворов а и б с концен-

трацией в 2 раза выше. Аргинин при этом дает оранжевое пятно на бледно-

желтом фоне, переходящее в серо-синее на интенсивно-зеленом фоне.

Глицин

о-Фталевый альдегид. Хроматограмму опрыскивают 0,2%-ным рас-

твором о-фталевого альдегида в ацетоне. Прогревают при 50°С в течение 10

мин. Глицин дает зеленое пятно, в УФ-свете при 365 нм шоколадно-

коричневое; гистидин и триптофан - интенсивно желтая флуоресценция при

365 нм. Этот реагент нельзя использовать после хроматографирования в аро-

матических растворителях.

Аргинин

Реакция Сакагучи. Хроматограмму погружают в 0,1%-ный раствор 8-

гидроксихинолина в ацетоне. Высушивают на воздухе. Тщательно опрыски-

вают раствором 0,2 мл Вг

в 100 мл 0,5 М NaOH. Аргинин и другие гуаниди-

ны дают оранжево-красные пятна.

Орнитин

Ванилин. Хроматограмму опрыскивают 0,2%-ным раствором ванилина

в ацетоне, а затем 0,1%-ным раствором КОН в этаноле. Прогревают при

110°С в течение 10 мин. Орнитин дает красное пятно, аналогично реагируют

пролин и гидроксипролин.

Иминокнслоты (пролин и гидроксипролин)

Изатин. Хроматограмму опрыскивают 0,2%-ным раствором изатина в

н-бутаноле, содержащем 4% уксусной кислоты. Прогревают при 105°С в те-

чение 15 мин. Пролин и гидроксипролин дают устойчивые пятна (синие).

Многие аминокислоты дают окраску в этом же диапазоне цветов, которая

исчезает при комнатной температуре через несколько часов. Чтобы получить

синие пятна только пролина и гидроксипролина, бумагу промывают после

проявления в 1 М НС1, а затем в воде.

Чтобы различить пролин и гидроксипролин, хроматограмму погружа-

ют сначала в описанный выше раствор, а затем в реагент Эрлиха (см. выше).

Все цвета, даваемые изатином исчезают, кроме окраски гидроксипролина,

которая переходит из синей в светло-вишневую.

Многократное прокрашивание

За опрыскиванием нингидрином может следовать опрыскивание α-

нитрозо-β-нафтолом или реагентом Эрлиха. За ним могут также следовать

реагенты, дающие пониженную чувствительность обработки (реагент Паули

или Сакагучи). Изатину может предшествовать нингидрин или за изатином

может следовать реактив Эрлиха или α-нитрозо-β-нафтол (чувствительность

последнего теста при этом снижается). За реактивом Эрлиха может следовать

обработка по Сакагучи, даже если предшествующими операциями были оп-

рыскивание нингидрином или изатином. УФ-облучение и обработка иодом

не мешают проведению любых последующих тестов.

Реакции по функциональным группам R остатка

В некоторых случаях используют реакции по функциональным груп-

пам R-остатков аминокислот. Например по SH-группе цистеина, фенольному

гидроксилу в тирозине, гуанидиновой группе аргинина. Исключительно вы-

сокую реакционную способность имеет R-группа цистеина, содержащая тио-

ловую или сульфгидрильную группировку. В щелочных средах цистеин те-

ряет атом серы в результате сложных реакций.

Тетранитрометан в мягких условиях с очень высокой специфичностью

реагирует с фенильной группой тирозина:

C(NO

)

Нитрованый остаток

тирозина

Нитроформиат

C(NO

)

Цистин, образующийся в результате ковалентного связывания двух ос-

татков цистеина, играет в белковой структуре особую роль. За счет этой ами-

нокислоты образуются поперечные дисульфидные связи.

ГЛАВА 2

2.1 СТРУКТУРА БЕЛКОВ

2.1.1 Установление аминокислотного состава белков

Аминокислотная последовательность полипептида или белка представля-

ет собой его первичную структуру. Установление аминокислотной последова-

тельности включает следующие этапы:

¾ определение суммарного аминокислотного состава (брутто состава);

¾ установление структуры N- и С-концевых аминокислот;

¾ фрагментация (расчленение) больших пептидных цепей белка на фраг-

менты с меньшим числом аминокислотных остатков (20 - 60)

¾ установление аминокислотной последовательности в небольших пептид-

ных фрагментах по Эдману;

¾ составление пептидных карт;

¾ окончательное установление полной аминокислотной последовательности

пептидной цепи исходя из результатов всех вышеперечисленных этапов.

Анализ суммарного (брутто) аминокислотного состава белков включает

две стадии: полный (неспецифичный) гидролиз белка и количественный анализ

смеси образовавшихся аминокислот.

Полный гидролиз проводят в стеклянных ампулах, которые предвари-

тельно очищают горячей смесью серной и азотной кислот (3:1 по объему) в те-

чении 10-15 часов. После кислотной обработки ампулы промывают дистилли-

рованной деионизированной водой и высушивают в воздушном термостате

(сушильном шкафу) при 110

С.

Стандартный метод кислотного гидролиза (полного расщепления белка)

состоит в следующем. 1-5 мг. белка помещают в стеклянную ампулу, заливают

6 н. НСl, вакуумируют, заполняют азотом, запаивают и выдерживают эту смесь

при 110

С в течении 12 - 36 часов.

Раствор НСl готовят так. Пропускают газообразный НСl через воду и по-

лучают 12 н. раствор соляной кислоты. Этот раствор смешивают с водой в со-

отношении 9:11 и перегоняют. После перегонки получается 5.7 н. раствор НСl.

Расщепление белка при кислотном гидролизе протекает практически без

рацемизации аминокислот. Серьезной проблемой является полное разрушение

индольного фрагмента триптофана, если он входит в состав белка. Поэтому, во

избежание этих осложнений, вместо НСl можно использовать метансульфоно-

вую кислоту. Она не разрушает триптофан.

При кислотном гидролизе амиды глутамин и аспарагин превращаются в

аммиак и глутаминовую, аспарагиновую кислоты соответственно. Такое пре-

вращение обнаруживают и учитывают, измеряя количество образовавшегося

аммиака, а также на основании полученной при секвенировании информации.

Частично разрушаются при кислотном гидролизе серин, треонин, цисте-

ин, тирозин, метионин. Трудно и неполностью протекает гидролиз белка по

пептидным связям с Вал, Лей, Иле. Для учета этих эффектов изучают кинетику

гидролиза и строят зависимость концентрации вышеназванных аминокислот от

времени. На основании полученных

графиков количества частично раз-

рушающихся аминокислот находят

экстраполяцией к нулевому време-

ни, а трудно гидролизуемых по вы-

ходу кривой на плато.

Качественно, сказанное проиллюст-

рировано на рис.

Соляную кислоту, по оконча-

нию гидролиза, выдувают из ампу-

лы Помимо кислотного применяется и щелочной гидролиз. В этом случае не-

обходимо учитывать следующие осложнения: разрушение цистеина, цистина,

Время гидролиза, ч

Концентрация а/к

→

Разрушающиеся а/к

Трудногидролизуемые а/к

серина и треонина. Кроме того, щелочной гидролиз приводит к рацемизации

всех аминокислот.

Анализ смесей аминокислот по завершению гидролиза

Количественное определение аминокислот полученных по завершению

неспецифического гидролиза белков и пептидов проводят, как правило, различ-

ными методами разделительной хроматографии. Ниже приведены примеры не-

которых (простейших) из них.

Тонкослойная хроматография - простейший и наиболее доступный ме-

тод разделения аминокислот. Возможности количественной оценки ограничены

и требуют больших трудозатрат. Как правило, после разделения смесей в тон-

ком слое строго количественный анализ не проводят. Даются, если это возмож-

но, только оценки (больше, меньше и т.п). Идентификацию (отнесение) прояв-

ленных пятен аминокислот проводят сравнением хроматограмм с результатами

хроматографирования стандартных смесей аминокислот известного состава в

идентичных условиях.

Колоночная хроматография. Для разделения аминокислот чаще приме-

няют вариант колоночной ионообменной хроматографии. Неподвижная фаза -

сульфированный полистирол сшитый дивинилбензолом. Аминокислоты в этом

варианте колоночной хроматографии переводят в катионную форму при низких

значениях рН. Они связываются с заряженными сульфогруппами носителя.

Элюирование проводят буфером (цитрат натрия, например) с возрастающей ве-

личиной рН. Повышение рН уменьшает эффективные положительные заряды

аминокислот и, соответственно, силы связи их со смолой. Тем самым достига-

ется последовательное (поочередное) вытеснение (вымывание) аминокислот из

колонки. Очередность выхода аминокислот из колонки в значительной мере

определяет рН буфера-элюэнта. В процессе элюирования ионы Na

вытесняют

аминокислоты по связям их с сульфогруппами.

Известен вариант двухколоночной методики. Первая колонка с амберли-

том IR-120, например, служит для разделения кислых и нейтральных амино-

кислот, а на второй колонке проводят анализ основных аминокислот. Широкого

распространения эта методика не нашла, поскольку ее не совсем просто реали-

зовать чисто технически. Кроме того, возрастает примерно вдвое расход анали-

зируемых материалов (потери из-за необратимого связывания) и существенно

увеличивается погрешность измерений.

Величина рН буферной смеси, как уже сказано, в ходе элюирования

должна возрастать. Этот градиент может быть как непрерывным так и дискрет-

ным. Последний много проще, поэтому и более распространен.

Внутренний стандарт. К раствору белка перед гидролизом в качестве

внутреннего стандарта добавляют точно известное количество известной ами-

нокислоты. Количественные показатели ее вытеснения (выхода) из колонки

служат базовыми для расчета выходов всех полученных при гидролизе амино-

кислот. Таким способом учитываются потери аминокислот в результате анали-

за.

Выявление (детектирование) выходящих из колонки аминокислот и уста-

новление их структуры. Как уже говорилось выше белковые аминокислоты яв-

ляются неокрашенными соединениями, поэтому отслеживать визуально их

движение вдоль колонки и на ее выходе невозможно. Для этих целей необхо-

димо использовать УФ-детектор, или "окрашивать" модифицировать амино-

кислоты. Это окрашивание выполняют двумя способами.

1. Постколоночная модификация. До начала 70-х годов вымываемые из

колонки аминокислоты детектировали реакцией с нингидрином. Интенсивность

возникающей окраски измеряли при двух длинах волн: вначале при 580нм, а за-

тем при 440нм для определения содержания пролина и гидроксипролина.

В 1972 году в качестве селективного флуорогенного реагента на первич-

ные амины был предложен флуорескамин. Он обеспечивает чувствительность

в 10-100 раз большую, чем нингидриновый метод. Для измерений используют