Шендрик А.Н. Химия белка. Структура, свойства, методы исследования

Подождите немного. Документ загружается.

202

¾ При наличии в лаборатории УФ-спектрофотометра для анализа белков

можно воспользоваться таким их свойством, как поглощение света в УФ-

области при длине волны λ

мах

= 280 нм. На этой длине волны поглощают тиро-

зин, триптофан и фенилаланин. Чувствительность метода довольно велика,

около 0.2 мг/мл. Результаты значительно искажаются в присутствии нуклеино-

вых кислот, максимум поглощения для которых расположен в области 260 нм.

Поэтому, оптическую плотность измеряют, как правило, при двух длинах волн:

260 и 280 нм. Это позволяет уменьшить неточности связанные с наличием в об-

разце нуклеиновых кислот. Существуют специальные поправочные таблицы и

формулы, позволяющие оценивать на основании спектроскопических данных

соотношение белков и нуклеиновых кислот в образце.

4.3.3 Оценка полноты очистки и гомогенности белков

Заключения о чистоте выделенного белка требуют знаний о наличии в

нем белковых и небелковых примесей. Полнота очистки от небелковых азотсо-

держащих соединений оценивается обычно по соотношению между белковым

(осаждаемым 10% ТХУ) и общим азотом препарата.

Оценить наличие белковых примесей в образце значительно труднее. Как

правило, надежное заключение можно получить только путем сочетания раз-

личных методов. Это наиболее эффективные варианты методов ультрацентри-

фугирования, электрофореза, хроматографии, молекулярной (гель-)фильтрации

и т.д. По мере совершенствования экспериментальных методов степень досто-

верности выводов о чистоте данного белка возрастает. Однако, как ранее, так и

сейчас нельзя быть абсолютно уверенным в том, что полученный белковый об-

разец является действительно индивидуальным белком. Нередки случаи, когда

считавшийся гомогенным белок оказывался при анализе более совершенным

методом неоднородным. Примером могут служить смеси изоферментов - чрез-

вычайно близких по свойствам и с одной и той же субстратной специфично-

стью белков. Долгое время о существовании этих изомеров просто не знали,

203

поскольку они обычными классическими методами фракционирования не раз-

деляются.

Не следует упускать из виду и тот факт, что многие белки в процессе ана-

лиза могут изменять свои свойства, в частности, денатурировать. В результате,

можно прийти к ошибочному заключению о наличии в смеси двух и более раз-

личных белков. На самом деле, эта смесь может представлять собой один и тот

же белок в нативной и денатурированной формах.

Одним из легкодоступных, несложных и достаточно надежных критериев

гомогенности белка является проба на растворимость. Этот показатель для од-

нородного белка не должен изменяться при повторениях одной или нескольких

стадий очистки. Кроме того, величина растворимости индивидуального белка

не должна зависеть от величины взятой навески. Практически это легко прове-

ряется. Берется серия навесок белка с возрастающей массой в градуированные

пробирки. Все пробирки заполняются до одного и того же объема растворите-

лем. После полного растворения фильт-

руют все растворы и определяют концен-

трацию белка в каждом из них. Для инди-

видуального белка график зависимости

количества растворившегося белка от ве-

личины взятой навески будет состоять из

двух линий (см. рис., лини 1,2), одна из

которых (линия 2) параллельна оси абс-

цисс (насыщение).

При наличии белковых примесей

полученный в эксперименте график будет выглядеть иначе. На графике про-

явится промежуточная зона, между начальной прямой растворимости и прямой

насыщения (см. рис.). Этот дополнительный участок (2') появляется потому,

что предел растворимости по основному белковому компоненту смеси наступа-

ет значительно скорее чем по белку примеси. Увеличение растворимости белка

m, навески белка

m, растворенного белка

2' 3'

204

(отрезок 2') будет происходить до тех пор, пока не будет достигнут предел рас-

творимости и по белку примеси. Проба на растворимость является одним из

наиболее строгих критериев гомогенности белка. Степень очистки белка при-

нято контролировать как минимум двумя независимыми методами. Например,

дополнительно к растворимости степень чисто-

ту выделенного белка проверяют методом ана-

литического центрифугирования. Седименто-

грамма чистого белка должна иметь единствен-

ный симметричный пик правильной формы

(см.рис.).

Для проверки чистоты можно воспользо-

ваться методами ионообменной хроматографии,

гель-фильтрации, ТСХ, бумажной хроматогра-

фии. Во всех случаях должно наблюдаться

только одно вещество.

4.4 Методы определения молекулярной массы белков

Применяемые для определения молекулярной массы (ММ) белков мето-

ды физико-химического эксперимента подразделяются на две группы. Одну

группу составляют методы определения среднечисленной ММ (М

MnMn

∑∑

где n

- количество молей белка с молекулярной массой

Среднечисленная ММ есть, фактически, среднеарифметическая ММ. Эти

методы основаны на измерениях коллигативных свойств растворовров, таких

например как осмотическое давление, которое определяется концентрацией

растворенного вещества.

Белок выделен

в чистом виде,

на седиментограмме

один симметричный пик

Седиментограмма

205

Другая группа объединяет методы определения средневесовой ММ (M

∑∑

iii

cMcM /

где VMnc

iii

/= - весовая концентрация в г/см

Или

MnMnM

∑∑

= /

Эти методы основаны на непосредственном измерении массы.

Основное различие между этими двумя группами методов в следующем.

Если раствор белка монодисперсный (все молекулы белка одного размера), то

обе группы методов дадут одну и ту же величину ММ. Если же раствор поли-

дисперсный (молекулы белка различаются размерами), то средневесовая ММ

получается больше среднечисленной. Причины того, что молекулы одного и

того же белка в растворе могут различаться размерами разные. Чаще всего это

диссоциация на субъединицы или ассоциация нескольких молекул в белковые

агрегаты. Поэтому сравнение средневесовой и среднечисленной ММ служит

одним из способов обнаружения надмолекулярных белковых образований.

По технике проведения измерений методы определения ММ белков под-

разделяют на статические и динамические. Группу статических составляют ме-

тоды, основанные на измерении:

¾ осмотического давления;

¾ давления насыщенных паров;

¾ светорассеяния

К динамическим относятся методы основанные на:

¾ изучении диффузии;

¾ измерении вязкости растворов;

¾ седиментационном анализе;

206

¾ гельхроматографии;

¾ электрофорезе.

На ранних этапах становления химии белка применялся аналитический

метод определения молекулярной массы. В основе его лежали доступные све-

дения о химическом составе молекулы белка. Так например, известно, что мо-

лекула миоглобина содержит одну простетическую группу с атомом железа. На

массу этого элемента приходится 0.335% от общей массы взятого для анализа

белка. Отсюда минимальная ММ одной молекулы миоглобина определяется

как:

ММ

миогл.

= 100*56 (атомн.М Fe)/0.335 = 16700

В настоящее время этот метод практически не используется.

4.4.1 Определение молекулярной массы по осмотическому давлению

Зависимость между ММ и осмотическим давлением предельно разбав-

ленного раствора определяется уравнением Вант-Гоффа:

где с

- весовая концентрация растворенного вещества в г/л, П - осмотическое

давление, R, T - универсальная газовая постоянная и абсолютная температура

соответственно.

Уравнение Вант-Гоффа справедливо только для идеальных растворов

(очень разбавленных в пределе бесконечно разбавленных). В эксперименте, по-

этому, измеряют величину осмотического давления при различных концентра-

циях белка в растворе. Полученные данные наносят на график и экстраполяци-

ей к нулевой концентрации белка находят его ММ.

207

В принципе, процедура определения ММ по осмотическому давлению про-

ста и имеет под собой строгое теоретическое обоснование. При практиче-

ской же реализации часто встречаются значительные затруднения. Прежде

всего необходимо добиться, чтобы раствор белка не содержал низкомолеку-

лярных примесей, способных проникать через полупроницаемую мембрану.

Диффузия этих примесей через мембрану понизит величину измеряемого

осмотического давления за счет появления дополнительного (противопо-

ложно направленного со стороны растворителя) осмотического давления.

Кроме того, многих осложнений при определении ММ по осмотическому

давлению можно избежать, если проводить измерения в изоэлектрической

точке.

Для измерения величины осмотического

давления можно воспользоваться изобра-

женной на рисунке очень простой уста-

новкой Пфеффера. Осмотическое давле-

ние со стороны находящегося в трубке

раствора создается за счет проникающего

через полупроницаемую мембрану растворителя и равно высоте столбика

(h).

4.4.2 Определение молекулярной массы по давлению насыщенных паров

Из термодинамики известно, что давление насыщенных паров раствора рав-

но сумме парциальных давлений всех компонентов раствора:

i∑

∑

где Р

и р

- суммарное давление насыщенных паров и парциальные давления

паров каждого из компонентов раствора.

208

В идеальных (предельно разбавленных растворах) величины парциаль-

ных давлений компонентов пропорциональны мольным долям каждого из них.

Давление насыщенных паров полимеров (в частности, белков) при комнатных

температурах крайне мало и его вкладом в Р

можно пренебречь. Тогда, для

идеального двухкомпонентного раствора белка в растворителе будем иметь:

лярастворите

pP ≅

∑

Увеличение концентрации белка в растворе будет понижать мольную долю

растворителя, и как следствие, его

парциальное давление. Иными слова-

ми величина насыщенных паров над

раствором будет в этом случае умень-

шаться. Что и позволяет определить

молекулярную массу растворенного

полимера.

Упругость паров над поверхностью

разбавленных растворов неэлектролитов и чистым растворителем можно со-

поставить по величине с помощью тензиметра (см рис.). Для простоты предпо-

лагается, что давление создают лишь пары растворителя, т. е. давление паров

растворенных веществ равно нулю. Установлено, что упругость паров раствора

падает по мере того, как возрастает его титр (s), рассчитанный по формуле:

где т' и m— масса растворенного вещества и растворителя соответственно.

Приведенная величина понижения давления над раствором ((P - P')/P)

связана с его титром и молекулярными массами растворенного вещества (M') и

растворителя (М) следующим простым соотношением:

209

−

Это основное уравнение тонометрии, которое позволяет рассчитать молекуляр-

ную массу растворенного вещества. Молекулярная масса растворителя является

тономентрической постоянной.

Метод тонометрии не всегда дает надежные результаты. Во-первых по-

тому, что с увеличением концентрации растворы белков быстро отклоняются от

идеальных. Во вторых, при очень больших разбавлениях трудно зафиксировать

вызванные небольшими добавками белка уменьшения давления насыщенных

паров над раствором.

4.4.3 Определение молекулярной массы

методами эбулиоскопии и криоскопии

Закон Рауля применительно к эбулиоскопии (криоскопии) гласит, что по-

вышение температуры кипения (понижение температуры замерзания) раствора

по сравнению с растворителем (∆T) пропорционально титру раствора (s) и об-

ратно пропорционально молекулярной массе растворенного вещества (M'):

)'(

kkT =∆

где k, k' - эбулиоскопическая (криоскопическая) постоянная растворителя.

4.4.4 Определение молекулярной массы методом светорассеяния

Если пропустить луч света через белковый раствор в затемненной комна-

те, то его путь через сосуд становится видимым. Это свойство коллоидных рас-

творов хорошо изучено и известно как опалесценция. Явление опалесценции

обусловлено рассеянием света, а сам эффект назван эффектом Тиндаля.

Если известны длина волны падающего света, интенсивность рассеянного

излучения, показатели преломления растворителя, а также показатель прелом

210

ления и концентрация растворенного вещества, то можно рассчитать его моле-

кулярную массу.

Существует два методических подхода. Первый используют, если размер

растворенных молекул в 10-20 раз

меньше длины волны облучающего

света. В этом случае молекула вы-

ступает как один рассеивающий из-

лучение центр.

Второй подход применяется когда

длина волны излучения сравнима с

размером молекул или больше. То-

гда, в одной и той же молекуле может быть несколько независимых осциллято-

ров и необходимо учитывать интерференцию световых лучей рассеянных раз-

личными участками одной и той же молекулы (см рис.).

Для первого случая применимо уравнение Релея для зависимости интен-

сивности рассеянного под углом θ света от расстояния до рассеивающей час-

тицы:

где R

- приведенная интенсивность или число Релея;

, I

- интенсивность падающего и рассеянного света соответственно;

r - расстояние от рассеивающей частицы до приемника света.

Для идеальных разбавленных растворов величина R

пропорциональна ММ

растворенного вещества (М) и его весовой концентрации (с):

McR K=

Коэффициент пропорциональности (К) является функцией, имеющей вид:













⋅

∂

211

где n

, n - показатель преломления растворителя и раствора соответственно; N -

число Авогадро.

Величины R

, n

, dn/dc определяют экспериментально и подстановкой в

уравнение рассчитывают молекулярную массу белка.

Для неидеальных растворов пользуются эмпирическим соотношением:

где В - эмпирическая постоянная,

и строят зависимость в координатах:

)(

Отсекаемый на оси ординат отрезок равен обратной ве-

личине молекулярной массы (см. уравнение, рисунок).

Если размеры молекул белка соизмеримы с λ, то в

уравнение вносятся дополнительные поправки:













+•













⋅

sin

где

- так называемый радиус инерции.

Для различных форм белковых молекул (сфера, цилиндр, клубок и т.д.)

существуют специальные формулы для расчета величин

. Если при подста-

новке рассчитанного для определенной формы молекулы значения

в урав-

нение экспериментальные данные укладываются на прямую в координатах:

)(

sin

⋅

•

c, г/см

= 1/М