Шендрик А.Н. Химия белка. Структура, свойства, методы исследования

Подождите немного. Документ загружается.

192

тем, включая белки и пептиды, уравнение Друде неприемлемо, поскольку

вблизи λ

должна наблюдаться так называемая аномальная дисперсия. В урав-

нении Друде - это точка разрыва

(деление на ноль), при прибли-

жении к которой оптическая ак-

тивность должна стремиться к

бесконечности. Этот факт отра-

жает в действительности лишь

ограниченность уравнения Дру-

де (как, например, и закона Ку-

лона или Ньютона при r→0). На

практике оптическая активность

возрастает, однако зависимость

ее от λ весьма своеобразная (см. рис.), а наблюдаемый эффект получил назва-

ние Коттон-эффекта.

Вблизи полосы поглощения (λ=λ

) оптическая активность сильно возрас-

тает, проходит через максимум и стремительно падает. Затем, изменив свой

знак, проходит через такой же глубокий минимум и выполаживается (см.рис.).

Для белков максимум оптической активности наблюдается при 230 нм.

Явление Коттон-эффекта учитывает эмпирическое двухчленное уравне-

ние, предложенное Моффитом и Янгом:

()

[']ma b

λλ

−

где [m’]

- приведенное среднее вращение остатка.

Коэффициенты a

и b

определяют экспериментально. Для этого, послед-

нее уравнение приводят к виду:

, нм

-1200

-800

-400

400

800

1200

[

193

()

[']mab

λλ

−













−

и строят график прямой:

Y = a

+ b

где Y =

[']m

λλ

−













; X =

()

λλ

−

На рисунке, в качестве примера,

представлены данные в координатах

прямой для дисперсии оптического

вращения синтетического пептида (λ

= 212 нм). Этот пептид представляет

собой сополимер следующего состава:

5% L-тирозина и 95% L-глутаминовой

кислоты (результаты получены Уор-

несом и Доти).

Величина a

- отражает вращение, обусловленное природой аминокис-

лотных остатков, b

- взаимодействие в α-спиральных участках пептидной це-

пи. Переход от спиральной структуры к неупорядоченной сопровождается

уменьшением величины углового наклона (b

). Для правой спирали в неполяр-

ных растворителях характерна величина b

порядка -630. Для неупорядоченных

структур в полярных растворителях эта величина приближается к нулю (см.

рис).

Наблюдение Коттон-эффекта в белках может служить, таким образом, некото-

рой характеристикой их вторичной структуры. Надо заметить, однако, что в

0 2 4 6 8 10 12

-800

-600

-400

-200

рН=4, спираль

рН=7,

клубок

194

белках вариации b

выражены значительно хуже, чем в синтетических пепти-

дах

4.2.2 Поглощение белками света в УФ-, видимой и ИК-областях спектра

В видимой области поглощают только хромопротеиды - белки, которые

содержат в своем составе пигмент. Это, например, белки в состав которых вхо-

дит гем (порфириновое кольцо с ионом железа): миоглобин, гемоглобин, цито-

хромы, каталаза, пероксидаза и др.

В УФ-области все белки, кроме протами-

нов, имеют широкую полосу поглощения в

области 275-285 нм (ядра тирозина, трип-

тофана, фенилаланина). Оптическая плот-

ность (коэффициент экстинкции) при

структурировании аморфного белка в спи-

раль уменьшается. Длина волны в макси-

муме полосы поглощения не изменяется.

См. рисунок:

Это явление носит название гипохромного эффекта. Вначале он был открыт для

нуклеиновых кислот, а затем, много позже, для пептидов и белков. По величине

гипохромного эффекта можно судить о степени включения пептидной цепи в

спираль.

В ИК-области спектра важные полосы поглощения белковых молекул

обусловлены пептидной связью (группами С=О и NH): 3300 см

-1

- валентные

колебания NH группы, 1660 - валентные колебания С=О, 1550 - деформацион-

ные колебания NH. Исследование ИК-спектров также позволяет сделать неко-

торые заключения о вторичной структуре пептидных цепей белков.

220 260 300

, нм

Оптическая плотность

Спираль

Клубок

Гипохромный эффект

195

4.3 Методы очистки белков

Для любых исследований белка, будь то определение его структуры или

биологической функции, этот белок нужно иметь, прежде всего, в очищенном

от примесей виде. Осуществить это на практике трудно, поскольку природа не

синтезирует белки вне живой клетки. Поэтому, после разрушения клеток всегда

получается очень сложная смесь. Как правило, процедура выделения и очистки

белка - это многостадийная обработка исходного биологического материала. На

каждой из следующих друг за другом стадий удаляется часть посторонних ве-

ществ и так до тех пор пока белок не будет получен в чистом виде. Ясно, что на

каждой из стадий происходит не только очистка, но и безвозвратная потеря

большего или меньшего количества белка. Обычно, удается получить в чистом

виде 5-10% исходного белка.

Универсальной методики очистки белков нет. Каждый следующий шаг

выбирается методом проб и ошибок, а успех зависит от эрудиции, точных зна-

ний и интуиции экспериментатора. Подходящим (приемлемым) путем очистки

считается тот, при котором можно получить (сохранить) максимальное количе-

ство белка в наиболее очищенном состоянии. Если этот результат можно дос-

тичь в 4-6 стадий, то им можно быть вполне довольным.

В качестве примера рассмотрим результаты полученные Анраку (Anraku)

при выделении галактозосвязывающего белка из клеток E. Coli (см. табл.4.2).

Выделяемый (галактозосвязывающий) белок связывает простые сахара и участ-

вует в транспорте их через бактериальную клеточную мембрану.

Обработка протамином (стадия 2) не приводит к заметному отделению

балластных белков (остается 2352 из 2600 мг). Протамин используют для уда-

ления из гомогената ДНК и РНК путем осаждения. Третий этап - фракциониро-

вание сульфатом аммония - широко применяемый прием при выделении бел-

ков. Сульфат аммония понижает растворимость белков (эффект высаливания).

196

Три последние стадии - хроматографическое разделение на ионообменниках и

гель-фильтрация на ДЭАЭ-сефадексе.

Таблица 4.2

Последовательность процесса выделения

галактозосвязывающего белка из клеток E.Coli

№

п/п

Стадии работы Общее

содержа-

ние белка

в смеси,

мг

Общая

актив-

ность

ед.

Удельная

актив-

ность

ед/мг

*Выход,

1 Получение гомогената кле-

ток

2600 960 0.39 100

2 Осаждение протамином 2352 798 0.34 85

3 Осаждение сульфатом ам-

мония

1664 728 0.43 75

4 Хроматография на ДЭАЭ-

целлюлозе

432 488 1.15 52

5 Хроматография на гидро-

ксилапатите

46 322 7.0 34

6 Хроматография на ДЭАЭ-

сефадесе

18 208 12.0 22

* Выход (в%) - есть отношение общей активности на данной стадии к общей активности ис-

ходного экстракта

Общее количество белка определяли по методу Лоури. Суммарную ак-

тивность измеряли так. Помещали белковую фракцию в полупроницаемую

трубку и проводили диализ в течении нескольких часов против раствора, со-

держащего известное количество

С-галактозы. Затем определяли наведенную,

за счет связывания белком меченой галактозы, радиоактивность образца.

4.3.1 Частные методы разделения белков

Ультрацентрифугирование. Метод ультрацентрифугирования основан

на том, что взвешенные в растворе белковые молекулы оседают на дно сосуда в

мощном гравитационном поле со скоростями пропорциональными их массам и

197

плотностям. Чем больше масса и плотность, тем скорее белок оседает. Основы

метода ультрацентрифугирования изложены в разделе посвященном методам

определения молекулярной массы белков.

Теоретически, эффективность разделения смесей методом центрифугирова-

ния должна быть высокой. Практически, однако, это далеко не так.

Гель-фильтрация. Для проведения препаративной гель-фильтрации бел-

ков чаще других носителей используют сефадексы. Причина в том, что число

сшивок в гелях на основе сефадексов легко регулируется в процессе получения

этих сетчатых (пористых) носителей для хроматографии количеством введен-

ного эпихлоргидрина (сшивающего агента):

CH CH

Тем самым достигается получение сефадексов с различным количеством и раз-

мером ячеек. Серийно выпускаемые типы сефадексов и размеры белковых мо-

лекул, которые с их помощью можно расфракционировать приведены в разделе

посвященном гель-хроматографии.

В отечественной и зарубежной литературе гель-колоночную хроматогра-

фию подразделяют нередко на гель-проникающую хроматографию (ГПХ) и

гель-фильтрацию. Принципиальной разницы между этими двумя понятиями

нет. Просто термин "гель-фильтрация" используют чаще при работе с водными

растворами и гидрофильными гелями. Как правило, фильтрование через гель

используется в биохимических исследованиях биологических полимеров. В

ГПХ применяются преимущественно органические растворители и гидрофоб-

ные гели. Этот вариант анализа широко используется при исследованиях синте-

тических высокомолекулярных соединений. Схема разделения смеси белков

методом гель-фильтрации сводится к следующему.

¾ Проводят процедуру набухания сефадекса в разбавленном растворе хло-

рида натрия. Он предотвращает слипание гранул сефадекса.

¾ Заполняют колонку полученным гелем.

198

¾ Вводят смесь белков в колонку. Объем смеси должен быть во много раз

меньше объема гель-фазы.

¾ Пропускают через колонку растворитель (буферный раствор). Находя-

щиеся в составе анализируемого образца молекулы малых размеров постоянно

сорбируются и десорбируются порами геля. Этот процесс многократной сорб-

ции-десорбции замедляет продвижение малых молекул по колонке. Более

крупные молекулы движутся скорее. И молекулы размеры которых больше

размеров ячеек геля вообще не поглощаются им и, «обтекая» гранулы геля бы-

стро движутся с током растворителя к выходу из колонки. Собирая небольши-

ми порциями элюэнт на выходе из колонки можно получить хорошо обособ-

ленные фракции отдельных белков.

Конкретный пример по разделению

смеси яичного альбумина,

ММ=44тыс. (антиген); имунного γ-

глобулина, ММ=160тыс. (антитело)

и продукта их рекомбинации (ком-

плекс антиген-антитело), ММ >

200тыс. на сефадексе G-200 пред-

ставлен на рисунке

Отметим, что при гель-

фильтрации на сефадексе белки

практически не адсорбируются ге-

лем, т.е. процесс протекает как молекулярная фильтрация. Существенно также

то, что сефадексы не разрушают лабильные белки.

В ряде случаев метод гель-фильтрации сочетают с процессом ионного

обмена. Для этой цели выпускаются ионообменные смолы на основе сефадекса

- ДЭАЭ-сефадексы, КМ-сефадексы и некоторые другие.

В процессе фракционирования на сефадексах можно одновременно опре-

делять и молекулярную массу белков. Эндрюс установил, что скорость движе

90 110 130 150 170 190 210 230

Объем элюэнта, мл

0,1

0,2

0,3

0,4

280

160 тыс.

>200 тыс.

44 тыс.

199

ния белков с ММ от 4000 до 160000 на сефадексах G-75 и G-100 практически

линейно зависит от логарифма ММ белка.

Метод гель-фильтрации применяется не только для фракционирования

белков, но и для освобождения белков от примесей низкомолекулярных соеди-

нений (в том числе и солей). Кроме того, сухой гель можно использовать для

концентрирования белков в растворах. Для этого в раствор белка засыпают гра-

нулы сефадекса, например. В процессе набухания он поглощает воду и низко-

молекулярные компоненты раствора, а белки остаются в меньшем количестве

растворителя, т.е. концентрируются. После полного набухания гель отделяется

от раствора центрифугированием.

Помимо сефадексов в препаративном разделении белков используют се-

фарозы и гели на основе полиакриламида (биогели). Типы этих гелей и ММ

разделяемых с их помощью белков мы рассмотрим несколько позже.

4.3.2 Контроль чистоты выделяемого белка

Для контроля за чистотой белка используют методы количественного

анализа белков. Наиболее ранний метод - определение количества белка по со-

держанию в нем азота. Разработаны два варианта: прямой и косвенный. В пря-

мом методе белок осаждают из раствора трихлоруксусной кислотой. Осадок

промывают и определяют содержание азота в белке. Косвенный - определяют

общее содержание азота в растворе белка. Белок осаждают, отделяют и вновь

определяют содержание азота в оставшемся маточном растворе. Разность полу-

ченных величин - есть количество белкового азота. Если содержание белка в

растворе очень мало, а низкомолекулярные примеси богаты азотом, то изме-

ренные количества азота (с белком и без белка) будут очень близки между со-

бой. Косвенный метод в этом случае неприемлем из-за больших погрешностей.

Содержание азота определяют по методу Къельдаля, или в его микрова-

рианте - методом Конвея. Суть метода. Белок кипятят с концентрированной

серной кислотой и сульфатом калия. В качестве катализатора применяют чаще

200

всего сернокислую медь. В продуктах реакции образуется сульфат аммония. В

щелочной среде его переводят в аммиак. Последний оттитровывают соляной

кислотой. Полученное количество азота умножают на коэффициент 6.25 (ус-

редненное значение содержание азота в белках). Величина этого коэффициента

весьма условна. Поэтому, всегда нужна определенная осторожность. В некото-

рых белках содержание азота может значительно отличаться от среднего (на-

пример, основные белки клеточного ядра). Расхождения могут быть двух и бо-

лее кратными. Как правило, однако, в тривиальных случаях эти расхождения не

превышают 5-10%.

Определение содержания белка по азоту - трудоемкая операция, требую-

щая довольно больших количеств белка. Чаще, поэтому, прибегают к другим

методам. В их числе.

Биуретовая реакция. Биурет (NH

CONHCONH

) и другие соединения с

пептидной связью дают сине-фиолетовое окрашивание при действии солей ме-

ди в щелочной среде. При обработке белковых растворов ионами меди появля-

ется пурпурно-голубая окраска с λ

мах

= 550 нм. Причина окрашивания - образо-

вание комплекса Cu

c пептидными связями. Интенсивность окрашивания в

этой реакции пропорциональна числу пептидных связей и практически не зави-

сит от других компонентов. Известны микроварианты этого метода, которые

позволяют выполнять анализ белка в концентрации 0.15 мг/мл и менее.

Метод Лоури. Получил наиболее широкое распространение. В методе со-

четаются две реакции: на ароматические аминокислоты и биуретовая. Окраши-

вание проводят реагентом Фолина-Чикольте (Чокальтеу). В состав этого реа-

гента входят ионы Cu

, которые в присутствии сильных оснований и фосфо-

молибденвольфрамовой кислоты при взаимодействии с белком дают пурпурно-

голубое окрашивание. Окрашивание возникает в результате образования ком-

плекса ионов меди с пептидными связями и реакции фофсфомолибденвольф-

рамовой кислоты с тирозином. Предполагают также некоторое участие в этой

реакции остатков триптофана, гистидина, цистеина. Метод Лоури обладает бо

201

лее высокой чувствительностью, чем биуретовая реакция, и позволяет опреде-

лять 0.01 - 0.05 мг/мл белка. Чувствительность в значительной степени зависит

от содержания в белке ароматических аминокислот. По этой причине он прак-

тически неприменим для анализа коллагеновых белков, в которых очень низ-

кое содержание ароматических аминокислот.

Основной недостаток метода - отсутствие линейной зависимости между оп-

тической плотностью и концентрацией белка в более или менее широком

диапазоне концентраций. Линейная зависимость наблюдается при содержа-

нии белка в растворе в пределах 15-40 мкг. По этой причине разработано не-

сколько модификаций метода. Измерение оптической плотности чаще всего

проводят при 500, 650, 750нм или других значениях длины волны, добиваясь

получения линейной калибровочной прямой.

Второй недостаток метода - это его довольно высокая чувствительность

ко многим примесям. В частности, к нуклеиновым кислотам.

Метод Бредфорда. В основе предложенного Бредфордом метода лежит

неспецифическое связывание красителей с белками, т.е. способность белков

просто адсорбировать некоторые красители. Этот подход позволяет в ряде слу-

чаев получить воспроизводимые результаты при довольно высокой чувстви-

тельности. В общем же случае зависимость между степенью сорбции красителя

и концентрацией белка, как правило, нелинейная. Для разных белков угол на-

клона калибровочной кривой сильно варьирует.

Наиболее распространенными красителями являются кумасси бриллиан-

товый голубой G-250 и кумасси R (фирмы Sigma) или BIO-RAD-реагент (про-

изводитель BIO-RAD Laboratories). Раствор белка после окрашивания красите-

лями фотоколориметрируют при 595 нм (во всех модификациях метода Бред-

форда).

Тщательные исследования метода Бредфорда показали, что линейная калиб-

ровочная прямая охватывает, в большинстве случаев, диапазон 0.5-50 мкг

белка в пробе (0.5-10 мкг/мл). Описан микровариант метода Бредфорда.