Волькенштейн М.В. Общая биофизика

Подождите немного. Документ загружается.

3.6.

МОДЕЛЬНАЯ ТЕОРИЯ АКТИВНОГО ИОННОГО ТРАНСПОРТА

131

но

не

влияет

на

него, находясь

во

внешней среде

[41]. Из кле-

точных мембран удалось выделить

К,

Na-активируемую

АТФ-

азу

[42].

Этот фермент расщепляет

АТФ

только

присутствии

и Na+.

Действие

АТФ в

мембране непосредственно связано

с активным транспортом

—

глюкозид оубаин ингибирует

АТФ-

азу

при той же

концентрации,

при

которой

он

прекращает

ра-

боту

натриевого насоса. Гидролиз

АТФ in vitro с

помощью этой

АТФ-азы происходит

в две

стадии

[43].

Вначале выделяется

АДФ,

неорганический фосфат остается связанным

фермен-

том.

Эта

стадия активируется ионами

Na+.

Второй этап

требует

присутствия

состоит

отщеплении фосфата

от

фермента.

Сходная,

но уже

пространственная асимметрия свойственна

на-

сосу—

на

внутренней поверхности мембраны

его

активность

за-

висит

от

на

внешней

— от с£ [44]. При

расщеплении

АТФ

на

мембранах наблюдается переход меченого фосфора

из АТФ

фосфопротеиды мембраны

[45, 46].

Кинетика действия

АТФ-

азы

in vitro

характеризуется S-образной зависимостью скорости

реакции

от

концентраций

Na+, K

и АТФ [47].

Гидролиз одной

молекулы

АТФ в

мембране сопровождается выходом

из

клетки

двух

—

трех

ионов

Na+ [48].

Для согласования

всех

этих фактов

и их

объяснения предла-

гались различные модели натриевого насоса.

модели Опита

Чарнока

[49],

основанной

на

структурной модели мембраны,

предложенной Даниэлли

Давсоном

(см.

далее,

стр. 137), бе-

лок

мембраны, расположенный

на ее

внутренней поверхности,

приобретает АТФ-азную активность

под

действием

Na+ и фос-

форилируется

при

расщеплении

АТФ:

•

АТФ + Е

*=±

•

Ф + АДФ.

результате

фосфорилирования происходит резкое конформа-

ционное

превращение белка, поворот макромолекулы, вынося-

щий

занятые

Na+

ионообменные центры

внешней поверхности

мембраны, причем

Na+

заменяется

на К

•

Ф + К

ч=* К

•

Ф + Na

Комплекс

фосфопротеида

с К

гидролизуется, отщепляется

фос-

фат

молекула белка возвращается

исходное состояние:

•

Ф ^ Е +

+ К

Обратный конформационный переход, обратный поворот моле-

кулы вносит ионы внутрь мембраны. Оубаин ингибирует именно

последнюю стадию. Таким образом,

этой модели АТФ-аза

рас-

сматривается

как

конформационный переносчик. Модель являет-

ся

качественной

и не

подкреплена расчетами.

Ее

достоинство

состоит

в том, что она

учитывает сочетание ферментативной

132 ГЛ. 3. МЕМБРАННЫЙ ТРАНСПОРТ

реакции с ионообменной и кооперативный характер процесса. Но

предложенный механизм представляется искусственным, так как

он

требует

перемещения больших участков макромолекулы от

одной поверхности мембраны к другой. Экспериментальные под-

тверждения такого перемещения

отсутствуют.

В работе [50] ко-

личественно проанализирована модель с участием переносчика,

который может находиться в нескольких формах. Теория эта

исходит из частных предположений и вводит в расчет 19 неза-

висимых параметров. Поэтому ее нельзя проверить эксперимен-

тально. В работе [51] рассмотрена модель с двумя переносчи-

ками,

в работе [52] — модель функционирования активного цент-

ра К, Na-активируемой АТФ-азы. Были получены некоторые

сведения об этом ферменте. По-видимому, он представляет со-

бой тетрамерный белок с молекулярным весом около 250 000 и

содержит два типа субъединиц аир (молекулярные веса 84 000

57 000) по две каждого сорта. Лишь субъединицы а присоеди-

няют фосфорную метку из меченой АТФ [53, 54]. Исходя из

этого, Штейн и соавторы предложили конкретную модель ак-

тивного транспорта, определяемого конформационными превра-

щениями

АТФ-азы [55]. Переход из одной конформации в дру-

гую вызывает изменения сродства к катионам соответствующих

активных центров. В одной конформации а-субъединица связы-

вает Na+ и р-субъединица связывает К

, в

другой

— наоборот.

Конформационное

превращение сопровождается гидролизом

АТФ, отщепленный фосфат первоначально присоединяется к а-

субъединице. В работе [52] аргументируется участие

трех

ами-

нокислотных остатков в этом процессе: Глу, Гис и Сер.

Рассмотрим подробнее кинетическую модель, предложенную

в работе [56]. Предполагается, что имеются два типа активных

центров, способных присоединять и обменивать Na+ и К

. Пер-

вый тип центров неспецифичен, эти центры

участвуют

в пассив-

ном

транспорте (см. § 3.5). Центры второго типа принадлежат

АТФ-азе и обеспечивают активный транспорт. Перемещение ио-

нов

происходит по эстафетному механизму.

Фермент катализирует гидролиз АТФ. Обозначим АТФ бук-

вой X, АДФ (или АМФ) — Z и фосфат —Ф. Связь ионообменной

реакции с ферментативной запишем в виде

Na' + Е'

•

К + X ==t Е

•

Ф + Z + К'.

Индекс

i по-прежнему относится к внутренней стороне мембра-

ны,

е — к внешней. На внешней стороне

+ Е

•

Ф =£= Е

•

К + Ф + Na

Комплекс Na-Ф, распадающийся на внешней стороне мембраны,

перемещается к ней от места своего образования по градиенту

3.6. МОДЕЛЬНАЯ ТЕОРИЯ АКТИВНОГО ИОННОГО ТРАНСПОРТА

133

концентрации.

Если сродство обменных центров к ионам велико

свободные центры

отсутствуют,

то перемещение комплекса

• Ф и обмен на К можно представить в

виде обменной реакции

Е' • Na • Ф + Е

• К ^ Е* • К + Е

• Na • ф.

-3

Мембрана

Таким образом, обобщенная сила, переме-

щающая ионы, — разность химических по-

тенциалов продукта Z, которая поддержи-

вается ферментативной реакцией.

Предположим далее, что обмен на фер-

ментных центрах и ферментативная реак-

ция

происходят кооперативно. Иными сло-

вами, центры взаимодействуют

друг

с дру-

гом таким образом, что обмен лиганда про-

исходит

практически одновременно на не-

скольких центрах. Такой кооперативный

обмен наблюдается, например, в цеолитах

[57], где он определяется изменением

структуры

решетки вслед-

ствие обмена ионов. Соответственно

введем

в уравнения реак-

ций

стехиометрические коэффициенты, не равные 1.

Общая

схема

реакций имеет вид

Р*

Е' • Na

• Y,

Рис.

3.6. Сопряжение

ионных

потоков в мем-

реакцией

(Y—

фосфат)!

'N.Jf

*,Т*_,

• Na

• Y

Здесь /Na и /к — пассивные потоки, а, р, у — стехиометрические

коэффициенты.

Сопряжение направленных потоков изображено

на

рис. 3.6. Кинетические уравнения написанных реакций имеют

вид

^ = - *,

(

хУ

< + *_,

(4)

(

«&.,

Т ^а = - К (4а) (

хГ < +

-, (4)

/I-

- /

т 4 =

)

< = ~ К (4a)"

- *_,

(4)

(4)'

(3.122)

134

ГЛ. 3.

МЕМБРАННЫЙ ТРАНСПОРТ

где

с',, с? —

безразмерные концентрации,

т. е.

молярные

кон-

центрации

иона сорта

внутри

и вне

клетки, отнесенные

к мо-

лярным

концентрациям воды

соответствующих объемах

нх»

;

га

числа

занятых ионами обменных мест

фер-

мента

на

единицу площади внутренней

внешней поверхности

мембраны,

S —

площадь мембраны. Одновременно

ni _i_ fit =z.ni n

4- п

== п

С\ 1941

*\*ii

-I- ^\ti

~i- pi pi -4- r

=. n Л

С ,- Г С е 1 , I \ ее \

(3-124)

Соотношения

(3.123)

(3.124)

выражают сохранение числа

об-

менных центров

на

поверхностях мембраны

полного числа

ио-

нов

каждого сорта.

В стационарном состоянии правые части

(3.122)

равны нулю.

В клетке расходуется только вещество

(АТФ).

Из

двух

первых уравнений

(3.122)

следует,

что

активный

выход

Na+ из

клетки определяется скоростью реакции

сх и в

стационарном

состоянии компенсируется пассивным потоком

Считая

ферментативные реакции необратимыми, положим

&_!

= k-2 = k-з = 0. В

этом приближении активный поток

Na+

из

клетки равен

U (

i \

(

\V „i — и (г* ^

пе <sb

г>1

и« (Ч 19&Л

—

lia)

Х)

Na ~ ^^"Na^K- (O.IZH)

Считая

концентрации ионов

Na+ и К

растворах независи-

мыми

друг

от

друга,

получаем отсюда

Г № J(J

т.

е. с^

выражена

как

функция потока

У при

заданных

с£, с

Здесь

'о

= V

К?>

/со

n'n*

(ctf/(SW

+ k

(elf).

Анализ

(3.126)

показывает,

что

кривая c

(J) имеет один

перегиб

интервале

0 < / </оо, что

согласуется

опытом

[56].

То

же

относится

и к

c£(J). Если

а = р= 1, т. е.

отсутствует

кооперативное взаимодействие

между

активными центрами

фер-

мента,

то

перегиба

нет. В

этом смысле АТФ-азная реакция

по-

добна другим ферментативным процессам.

Описанная

кинетическая модель согласуется

опытом

и по-

казывает,

что

специфическая роль белка-фермента

мембран-

3.6. МОДЕЛЬНАЯ ТЕОРИЯ АКТИВНОГО ИОННОГО ТРАНСПОРТА 135

ном

транспорте состоит в сопряжении транспорта с метабо-

лизмом.

Мы

не обсуждали пока конкретные пути переноса ионов

через мембраны. Законно поставить вопрос о реализации пере-

носа

через поры, каналы в мембране или посредством специаль-

ных переносчиков [58]. Ходжкин впервые выдвинул предположе-

ние

«натриевых»

и «калиевых каналах» [59]. Очевидно, что

последовательность соответствующих ионообменных центров

также может трактоваться как канал. Однако существование

каналов

доказывается и непосредственно (см. [58, 183, 184]).

Оказалось, что клеточные мембраны проницаемы не только

для воды и ионов, но и для ряда нейтральных молекул, рас-

творимых в воде, но не растворимых в липидах (см., например,

[60]). В возбудимых мембранах (см. гл. 4)

существуют

специа-

лизированные

ионные поры, проницаемость которых зависит от

природы ионов [61]. Селективность каналов велика, но не абсо-

лютна. Так, отношения проницаемостей

ШО

н/Ряа

Для натриевых

каналов

перехвата Ранвье (см. стр. 161) для гидроксиламина

0,94, для Li+ 0,93, для NHj 0,16, для К

0,09. Для калиевых

каналов

Р„

„/Рк

для Т1+ 2,3, Rb+ 0,91,

0,13, Cs+ 0,08, Na+

0,01 [62] (дальнейшие подробности см. в [58]). Блокирование

каналов

другими ионами позволяет получить информацию о

функциональной

«архитектуре»

каналов.

В работе [63] предложена теоретическая модель канала в

двойном слое липидов (см. стр. 137). Предполагается, что на

стенках канала имеются кооперативно действующие активные

центры.

Переносимый ион подвергается действию силового поля

свободно движется вдоль канала. Движущиеся ионы

могут

трактоваться как ионный газ.

Прямое

доказательство наличия каналов состоит в том, что

отсутствие проникающих ионов Na+ и К

высокочастотная

проводимость мембраны равна нулю. Если бы в ней функциони-

ровали подвижные заряженные группы, то должен был бы

наблюдаться электрический ток. Удается оценить количествен-

ные

характеристики каналов, число которых, приходящееся на

мкм

мембраны, составляет несколько сот. Так, проводимость

одиночного натриевого канала

4-10~

Ом

-1

, калиевого —

12-Ю-

Ом-

[185]. Сечение Ыа+-канала — примерно 3X5 А

пропускная

способность — 10

ион/с.

Ионный

канал можно трак-

товать как своего рода «векторный фермент», катализирующий

перенос иона. Активность этого «фермента», несомненно способ-

ного к конформационным перестройкам, регулируется электри-

ческим полем [184].

В серии работ [186] проведено сопоставление перескокового

электродиффузионного механизмов движения частиц в тонких

мембранах.

136

ГЛ.

МЕМБРАННЫЙ ТРАНСПОРТ

Проблемы активного транспорта, описанные здесь, имеют

непосредственное отношение

возбудимым мембранам. Рассмот-

рение

свойств этих мембран

связи

генерацией нервного

им-

пульса приведено

в гл. 4.

3.7.

СТРУКТУРА

МЕМБРАН

Феноменологическое рассмотрение мембранного транспорта

на

основе неравновесной термодинамики

или

кинетических

мо-

делей

не

дает

сведений

молекулярных механизмах явления.

Развитие физики мембран связано

детальным изучением

их

молекулярного строения

молекулярной функциональности.

Биологическая

мембрана есть динамическая организованная

си-

стема; необходимо исследовать

как ее

устройство,

так и

дина-

мику

ее

поведения. Соответствующие задачи очень сложны

и,

несмотря

на

громадное число работ,

им

посвященных,

мы не

располагаем

еще

сколько-нибудь полной картиной динамической

мембраны.

Тем не

менее сейчас установлен

ряд

важных фактов

предложены убедительные модели мембран.

Мембраны состоят

основном

из

липидов

белков.

клет-

ках млекопитающих содержатся

небольшие количества

угле-

водов, связанных

белками (гликопротеиды)

или с

липидами

(гликолипиды).

Во

внутренних мембранах присутствуют

в ос-

новном

фосфолипиды,

плазматических содержатся

нейтраль-

ные

липиды.

Так,

мембранах эритроцитов

30%

липидов обра-

зует

холестерин.

В табл.

3.4

[64]

приведено относительное содержание белков

липидов,

также холестерина

фосфолипидов

различных

биологических мембранах.

Таблица

3.4

Состав

биологических

мембран

Мембрана

Миелиновая оболочка

Плазматические мембраны

клетки печени

клетки асцита

Эрлиха

тени эритроцитов

Внутренняя мембрана

эндоплазматический

ретикулум

Внешняя мембрана митохондрий

Внутренняя мембрана митохондрий

Палочки

сетчатки

Ламеллы

хлоропласта

Белок/липид

(весовое

отношение)

0,25

1,0-1,4

2,2

1.5-4,0

0,7—1,2

1,2

3,6

1,5

0,8

Холестерин/фосфо-

липид (молярное

отношение)

0,7-1,2

0,3-0,5

0,9-1,0

0,03—0,08

0,03-0,09

0,02-0,04

0,13

3.7.

СТРУКТУРА

МЕМБРАН 137

Для изучения состава мембран необходимы методы выделе-

ния

из мембран индивидуальных компонентов. Сейчас такие ме-

тоды хорошо разработаны. Они основаны на применении детер-

гентов (например, додецилсульфата натрия), солюбилизирую-

щих нерастворимые вещества, и разделении полученных белков

путем электрофореза в полиакриламидном

геле

[64, 65].

В большинстве случаев мембраны чрезвычайно гетерогенны.

Фосфолипиды

и липиды представлены в них целыми семейства-

ми.

Так, в мембранах эритроцитов человека содержится не ме-

нее 20 видов лецитина [66]. На рис. 3.7 представлена схема,

показывающая строение и состав липидов в этих мембранах [67].

Липиды построены из полярной

«головы»

двух

длинных непо-

лярных углеводородных

«хвостов»,

обладающих гидрофобными

свойствами. Как мы увидим, этим определяется

структура

мембран.

Белки

мембран также разнообразны. Около трети белков

мембраны эритроцита образует спектрин, состоящий из

двух

компонентов

с молекулярными весами 255 000 и 220 000. Вторая

треть — ряд белков с молекулярными весами около 90 000 и тре-

тья треть — белки с молекулярными весами

9000—15000

[65,

68].

Существуют мембраны и более простого состава — внутрен-

ние

мембраны палочек сетчатки содержат лишь один белок —

родопсин

(см. гл. 7). Состав мембран каждого типа клеток спе-

цифичен,

что, по-видимому, имеет прямое функциональное зна-

чение.

Было высказано предположение о присутствии на внеш-

ней

стороне цитоплазматической мембраны характеристических

белков, ответственных за узнавание [69].

Липиды играют не только

структурную

роль в мембранах.

Можно

было бы представить себе и чисто белковую мембрану,

молекулы которой связаны

друг

другом

слабыми взаимодей-

ствиями,

прежде всего гидрофобными. Таких мембран, однако,

нет, хотя известны стабильные белковые надмолекулярные

структуры (например, коллаген) и белково-углеводные мембра-

ноподобные системы. Можно

думать,

что белковая мембрана

была бы слишком стабильна и, тем самым, лишена структурной

лабильности, необходимой для многообразной функциональности

мембраны [70].

Основываясь на косвенных данных о свойствах клеток и про-

ницаемости

мембран, Даниэлли и Давсон еще в 1935 г. предло-

жили модель универсальной биологической мембраны, так на-

зываемой

унитарной

мембраны

[71]. Эта модель симметрична.

Матрикс

мембраны, ее внутренность формируют неполярные

«хвосты»

липидов, образующие два слоя. На поверхность вы-

ходят

полярные

«головы»

липидов, взаимодействующие с внеш-

ними

мономолекулярными белковыми слоями. В дальнейшем

эту модель неоднократно модифицировали и усовершенствовали

го

sir

во

70 80

Нейтральные

лишЯы

холестерин

/СИЯ/7-

липиды

Фосфалипивы

сринго-

миели//

сн

с=о

НС

—

С-СН

Н /

но

О=Р—О"

сн,

H,C-N

-CH,

СН,

фосфитидил-

халин

H,C-N

-CH,

сн

этаноламин

серия

Р — 0~

с-

сн

га

•а

•о

Рис.

3.7.

Структура

состав липидов

фосфолипидов

мембране эритроцита человека.

3.7.

СТРУКТУРА

МЕМБРАН 139

на

основании данных, полученных с помощью электронной мик-

роскопии

и рентгенографии. Модель Робертсона [72] состоит из

двух

лииидных слоев с гидрофобными

«хвостами»,

обращенными

внутрь, и полярными

«головами»,

смотрящими

наружу.

Моно-

молекулярные слои белка различны на

двух

сторонах мембраны.

Толщина

внутреннего гидрофобного билипидного слоя около

35 А, толщина каждого из внешних слоев, состоящих из поляр-

ных

«голов»

и белка, — около 20 А, толщина унитарной мембра-

ны

в целом — около 75 А.

Другие

модели приведены в [2].

Данные,

полученные методом электронной микроскопии, воз-

можно,

требуют

уточнений. Оттенение препаратов производится

OsO

, KMnO

и т. п. Химия происходящих при этом процессов

еще недостаточно изучена, неясно также, что происходит при

выделении мембран и подготовке препаратов. Здесь не исклю-

чены артефакты. Тем не менее основной принцип построения

унитарной мембраны — двуслойное расположение липидов —

по-видимому, правилен. Это доказывается, в частности, рентге-

нографическими

данными. Установлено, что чистые фосфоли-

пиды,

диспергированные в

воде

и образующие бимолекулярные

слои вследствие гидрофобных взаимодействий,

дают

дифрак-

ционную картину, весьма

сходную

с картинами, получаемыми

с диспергированными биологическими мембранами. Оказалось,

что столь различные объекты, как мембраны эритроцитов, бак-

терий

Mycoplasma

laidlawii

и плазматические мембраны нерв-

ных окончаний крысы, имеют в основном сходное строение, со-

гласующееся с унитарной моделью.

Сказанное,

однако, не относится к расположению белков в

мембране. Предложенные модели исходят из того, что мембран-

ные

белки имеют гидрофильные, полярные, поверхности, взаи-

модействующие с полярной липидной поверхностью мембраны.

В действительности это не так. Были проведены исследования

выделенных мембранных белков и мембран косвенными

метода-

ми—

воздействием на них протеолитических ферментов и вклю-

чением в белки мембран различных меток [2, 5]. Оказалось, что

белки мембран можно разделить на два класса. Одни из них

связываются только поверхностями мембраны; подобно

глобу-

лярным

белкам, функционирующим в водном окружении, они

имеют гидрофильную поверхность. Белки второго класса спо-

собны проникать в мембрану, взаимодействуя с гидрофобными

«хвостами»

липидов. Такие белки нерастворимы в

воде

и имеют

преимущественно гидрофобный характер [68]. Исследования

мембран методами инфракрасной спектроскопии, спектрополя-

риметрии,

спектроскопии ЯМР и т. д. указывают на разнообра-

зие белковых

структур

и, вероятно, значительную роль взаимо-

действия белков

друг

другом,

не учитываемого в унитарной

модели [73]. В модели Бенсона [74] глобулярные белки

«утоп-

140 ГЛ. 3. МЕМБРАННЫЙ ТРАНСПОРТ

лены» в мембране. Липиды не образуют сплошного бимолеку-

лярного слоя, но рассредоточены

между

белковыми глобулами

так, что их углеводородные

«хвосты»

контактируют с гидрофоб-

ными

участками белков (см. также [65, 75]).

В настоящее время наиболее правдоподобной представляется

мозаичная

модель мембраны, отличная и от модели Даниэлли и

Давсона, и от модели Бенсона.

Ряд

данных непосредственно доказывает, что в отличие от

унитарной модели белки в мембране распределены асимметрич-

но.

Для исследования применялись методы изменения наружной

поверхности мембраны под действием непроникающих агентов,

идентификация

наружных компонентов с помощью специфиче-

ских антител, введение селективных меток, сравнение фермента-

тивной

и транспортной активностей нативных и

«вывернутых»

везикул и т. д. [75]. Особенно детально изучены мембраны эри-

троцитов. Прямой метод локализации компонентов мембраны —

ЯМР-спектроскопия

с применением гидрофильных парамагнит-

ных меток — дал особенно убедительные доказательства этой

асимметрии [75—78].

Важные результаты получены при помощи методики скалы-

вания

в замороженном состоянии

(freeze

etching). Мембраны

быстро замораживают при температуре жидкого азота и дробят

вакууме. Лед сублимируется, образец оттеняют, реплицируют

платиной

и углеродом и исследуют под электронным микроско-

пом.

Выяснилось, что излом проходит вдоль внутренней гидро-

фобной

области мембраны эритроцита. При этом обнаружились

большие глобулярные частицы диаметром до 75 А. Эти части-

цы

— белки [65, 79, 80].

Многие

свойства биологических мембран, не связанные с фер-

ментативной активностью, удается моделировать эксперимен-

тально. Оказалось возможным получать и исследовать искус-

ственные липидные мембраны, имеющие двухслойное строение.

Стабильные двухслойные системы такого рода были впервые

получены в 1962 г. [81]. Искусственные мембраны получаются

при

контакте смеси фосфолипидов и нейтральных липидов, рас-

творенных в органических соединениях, с водой. При этом

можно получить

«черные»

мембраны, т. е. тонкие слои, лишен-

ные

интерференционных цветов. Толщина таких мембран ме-

нее 100 А. Разработаны весьма надежные способы их изготовле-

ния

(см., например, [82]). Используются как природные, так и

синтетические липиды [83].

Искусственные двухслойные липидные мембраны весьма раз-

нообразны,

но в целом сходны с моделью унитарной мембраны.

Внутри расположены неполярные группы липидов, снаружи —

их полярные участки. Искусственные двухслойные мембраны

имеют физические свойства, очень близкие к свойствам биоло-