Волькенштейн М.В. Общая биофизика

Подождите немного. Документ загружается.

6.7. ЦИТОХРОМ с 331

дом (БСИ) при рН 4,1 [105, 106]. При отношении БСИ : белок до

3,3: 1 Мет 65 и Трп 59 окисляются. При отношении 5:1 разру-

шается и Тир 74. При этих химических изменениях резко падает

редуктазная активность НАД-Н-цитохрома с, и ее падение про-

порционально доле окисленного Трп 59. Одновременно происхо-

дит более медленное падение оксидазной активности цитохро-

ма с. Если отношение БСИ : белок более 5 : 1, происходит моди-

фикация

второго (не идентифицированного) Тир и окисление

Мет 80, что приводит к потере оксидазной активности.

Эти результаты показывают, что Трп 59, по-видимому, уча-

ствует

в восстановлении цит с. Исходя из этого и из предвари-

тельных данных рентгеноструктурного анализа, Дикерсон и

Уинфилд предложили модельный механизм восстановления цит

с, состоящий в следующем [101].

1. Один электрон каким-то способом переносится от редук-

тазы на Тир 74 и вследствие перекрывания я-электронных обла-

ков

с Тир 74 на Трп 59. Если избыточный электрон попал на Тир

74, он спонтанно мигрирует на Трп, так как более протяженная

кольцевая система делокализации Трп обладает более низкой

антисвязывающей орбиталью, которую может занять электрон.

2. Другой электрон переносится с Тир 67 на гем, оставляя

Тир 67 с нехваткой электрона. Здесь также электрон переходит

с меньшей системы делокализации на большую, обладающую бо-

лее низкими уровнями энергии. Этому

переходу

способствует

электростатическое отталкивание, создаваемое избыточным от-

рицательным зарядом на Трп 59, хотя прямой переход электрона

с Трп 59 на Тир 67 невозможен вследствие отсутствия перекры-

вания

я-электронных облаков.

3. Происходит конформационное изменение, в

результате

ко-

торого кольца Трп 59 и Тир 67 устанавливаются параллельно и

их л-облака перекрываются. Этому превращению способствует

электростатическое притяжение обогащенного электроном Трп

59 и имеющего нехватку электрона Тир 67.

4. Электрон затем переносится с Трп 59 на Тир 67, обе груп-

пы

становятся электрически нейтральными, и молекула остается

в наблюдаемой конформации восстановленного цитохрома с.

Последний электронный перенос облегчается малой диэлектри-

ческой проницаемостью внутренней гидрофобной молекулы.

Редфилд и

Гупта

[107] установили методом ЯМР, что в окис-

ленном цитохроме с неспаренный спин гема проводит большую

часть времени на пиррольном кольце, связанном с Цис 17, и на

противоположном кольце по диагонали, погребенном в глубине

кармана. Это последнее пиррольное кольцо находится в тесном

контакте с Тир 67. Спаривание электронов в этой части порфи-

ринового кольца должно способствовать переносу электрона с

Тир 67 на гем.

332 ГЛ. 6. СОПРЯЖЕННЫЕ ПРОЦЕССЫ В МИТОХОНДРИЯХ

Данные об участии ароматических соединений в восстановле-

нии

гемина (окисленного гема) были получены путем изучения

дисперсии магнитного вращения (ДМВ) (см. [3], § 7.3, 7.4) в мо-

дельных системах [108]. ДМВ гемина в безводном пиридине

практически совпадает с ДМВ феррокомплекса гема с пириди-

ном.

При добавлении воды ДМВ резко изменяется и становится

сходной с ДМВ гемина. По-видимому, в отсутствие воды возни-

кают я-комплексы гемина с пиридином. Такие комплексы гемина

с сопряженными молекулами в неполярных растворах хорошо

изучены, причем показано, что это комплексы с переносом за-

ряда [109]. Сходство ДМВ комплекса гемин — пиридин и комп-

лекса гем — пиридин показывает, что пиридин служит донором

электрона, переходящего на гемин. Из этих результатов

следует,

что в я-комплексе порфиринового кольца и ароматической моле-

кулы (пиридина) происходит перенос электрона и для данного

процесса существенна неполярность растворителя, стабилизи-

рующего я-комплекс. Переход электрона должен, очевидно, про-

исходить с понижением энергии, т. е. от менее протяженной я-

электронной системы пиридина к более протяженной системе

гема.

Укажем попутно, что исследование дисперсии магнитного

вращения и магнитного кругового дихроизма (МКД) цитохро-

мов очень перспективно для изучения процессов, происходящих

в ЦПЭ. Соответствующие работы начаты лишь недавно. Кривые

ДМВ и МКД, полученные для взвеси субмитохондриальных ча-

стиц, содержат ярко выраженные

пики,

отвечающие отдельным

цитохромам [ПО]. Обычные спектры поглощения не

дают

такой

ясной

картины.

Модель Дикерсона — Уинфилда очень привлекательна — она

непосредственно изображает электронно-конформационные взаи-

модействия. К сожалению, пришлось от этой модели отказаться

(см.

[117]). Последующие результаты рентгеноструктурного ана-

лиза не выявляют заметных различий

между

структурами окис-

ленного и восстановленного цит с. Найден цит с, в котором

Тир 74 заменен на Лей при полном сохранении активности фер-

мента. Поэтому Дикерсон приходит к выводу о туннельном ме-

ханизме переноса электрона в цитохроме.

В работах

[94—97]

предложена модельная квантовомехани-

ческая теория ферментативного катализа и изложено ее приме-

нение

к процессу восстановление — окисление цит с. Показано,

в частности, значительное ускорение процесса при наличии про-

межуточных электронных состояний системы, взаимодействую-

щих как с начальными, так и с конечными состояниями. Реак-

ции

переноса заряда, такие как

^=t

сильно ускоряются

в присутствии третьей частицы, играющей роль «мостика» для

0.7. ЦИТОХРОМ с 333

переноса электрона. Функция виртуального мостика рассмотрена

случае

цит с, причем получены

грубые

оценки скорости про-

цесса и зависимости ее от температуры, согласные с опытом.

Таким образом, имеются различные предположения о

меха-

низме переноса электрона в цитохроме с. Решение этой проб-

лемы

требует,

с одной стороны, экспериментального исследова-

ния

динамики окисления — восстановления, с

другой

— построе-

ния

полной квантовомеханическои теории процесса, учитываю-

щей и электронные и конформационные степени свободы. Мы

встречаемся здесь с очень большими трудностями.

ГЛАВА

ФОТОБИОЛОГИЧЕСКИЕ

ПРОЦЕССЫ

§ 7.1. ФОТОСИНТЕЗ

главах

3—5 рассмотрены биоэнергетические явления —

трансформация

химической энергии, запасенной в АТФ, в осмо-

тическую и механическую

работу.

В гл. 6 описан обратный про-

цесс—

образование АТФ в

результате

работы дыхательной цепи,

локализованной

в митохондриях. Все эти процессы относятся к

«темновой биологии», они протекают без участия света.

Вместе с тем

существуют

биоэнергетические явления, непо-

средственно связанные с действием солнечного света на орга-

низмы.

В конечном счете именно излучение Солнца является

источником

жизни на Земле. В этой главе рассматриваются

лишь

два важнейших фотобиологических процесса — фотосин-

тез (в основном, в зеленых растениях) и зрительная рецепция.

Возникновение

и существование живых систем, обладающих

сложной структурой, упорядоченной в пространстве и времени,

возможно лишь потому, что это открытые системы, находящиеся

состояниях, далеких от термодинамического равновесия. Воз-

никновение

жизни требовало источника свободной энергии. Та-

кой

источник — Солнце. Солнечная система далека от термоди-

намического равновесия, световая энергия, излучаемая Солнцем,

используется для биохимических процессов, лежащих в основе

жизни

фотоаутотрофных растительных организмов. Фотосинтез

растениях есть использование световой энергии для образова-

ния

сложных органических соединений, прежде всего углеводов,

синтеза АТФ. Глобальным результатом фотосинтеза является

образование свободного молекулярного кислорода, создание

окислительной атмосферы Земли, необходимой для дыхания как

аутотрофов, так и гетеротрофов (см., впрочем, стр. 480).

Суммарное уравнение фотосинтеза имеет вид

СО

+ Н

О +

/Но

-* О

+ (СН

О) +112 ккал/моль.

Здесь

Ьа>

— квант света, (СН

О) — фрагмент молекулы

углевода.

При

фотореакции выделяется энергия 112 ккал/моль. Изменение

свободной энергии составляет 120 ккал/моль, следовательно, из-

менение

энтропии в этом процессе равно — 27 кал/моль-К (при

Т — 300 К). На образование одной молекулы О

расходуется

7.1. ФОТОСИНТЕЗ 335

8 квантов света (см.

стр. 336) с суммарной энергией около

350 ккал/моль. Коэффициент использования солнечной энергии

тем самым равен

120/350

= 0,34. Выделяемая энергия около

110 ккал/моль

следует

из баланса:

Энергия

двух

связей С=О в СО

190X2

= 380

Энергия

двух

связей О—Н в Н

О 110X2 = 220

Итого

600

Энергия

связи 0=0 в О

116

Энергия

двух

связей С—Н в фор-

мальдегиде

СН

92X2

= 184

Энергия

связи С=О в

СН

190

Итого

490

600 — 490 = ПО ккал/моль.

Суммарная реакция фотосинтеза обратна реакции, реализуемой

дыхании, — образованию СО

и НгО из органических соеди-

нений.

Разность

энергий 112 ккал/моль

следует

из окислительно-вос-

становительного потенциала пары

V2O2/H2O,

равного +0,81 эВ,

пары СО

/(СН

О)-{- Н

О, равного — 0,40 эВ. Их разность со-

ставляет 1,21 эВ. В фотосинтезе для восстановления СО

до уг-

левода

нужно перенести 4 атома водорода с Н

О на СО

СО

+ 2Н

О -> (СН

) + О

= [(СН

О) + Н

О] + О

Вещество (СН

) нестабильно, оно распадается на (СН

О) и

О,

причем выделение воды не меняет уровня восстановления.

Соответственно баланс энергии сводится к 1,21 X 4 = 4,84 эВ =

=112

ккал/моль.

Таким

образом, фотосинтез в зеленых растениях означает

окислительно-восстановительную реакцию

между

окислителем

СОг и восстановителем Н

О, в которой четыре электрона (или

четыре атома Н) переносятся

«вверх»,

преодолевая разность по-

тенциалов около 1,2 В. Схематически этот процесс представлен

на

рис. 7.1 [1]. Он разделен на три стадии — две «горизонталь-

ные»

последовательности ферментативных реакций и

«подъем»

электронов

участием

света. При бактериальном фотосинтезе

вместо воды может фигурировать H

S; в этом

случае

разность

потенциалов H

S/S меньше, она составляет —0,2 В.

Фотохимическая стадия, сводящаяся к запасанию световой

энергии,

трансформируемой в химическую, начинается с погло-

щения

света пигментами растений, среди которых важнейшую

роль играет хлорофилл. Тимирязев показал, что спектр действия

солнечного света при фотосинтезе находится в

грубом

соответ-

ствии со спектром поглощения хлорофилла. Это положение имеет

фундаментальное значение [2]. Скорость фотосинтеза Р, изме-

ряемая

количеством выделенного в единицу времени кислорода

336

ГЛ. 7.

ФОТОБИОЛОГИЧЕСКИЕ

ПРОЦЕССЫ

(или

поглощенного СО

), зависит от интенсивности света /, Р =

f(I)- Эта зависимость характеризуется насыщением (рис. 7.2).

Тангенс

угла

начального наклона кривой выражает максималь-

ный

квантовый

выход

процесса, наблюдаемый при слабой осве-

щенности. При понижении температуры кривая снижается.

Грубая

теория, объясняющая насыщение, состоит в

следую-

щем: скорость фотохимического образования некоего

субстрата

пропорциональна числу погло-

щенных квантов.

Субстрат

не-

устойчив, так как после прекра-

щения

освещения продукция О

прекращается, независимо от ин-

тенсивности света. Образовав-

+0.5

СО,

(СН

О)

- н,о

Рис. 7.1.

Схема

фотосинтеза.

•—

ферментативное превращение Н

Оз, 2 —перенос водорода от про

межуточного вещества 2/2Н

к Х/ХНг

последовательности ферментатив-

ных

стадий с помощью активирован-

ного

светом хлорофилла, 3 — фермен-

тативное

превращение СО

(СН

О).

Рис. 7.2.

Зависимость

скорости

выделения

от

интенсивности

света

при

двух

температурах.

шийся

при освещении

субстрат

трансформируется

в фер-

ментативных процессах, и если его количество слишком велико,

то трансформация не

успевает

осуществиться до распада суб-

страта. Считая, что стационарная кинетика ферментативной ре-

акции

следует

уравнению Михаэлиса — Ментен и концентрация

субстрата

5 пропорциональна /, имеем

kEI

+ l •

(7.1)

где Е — концентрация фермента, k, К — константы. При / <с К

v ~ /, при / ^> К v =

Vmax

= kE, т. е. имеется насыщение. Кон-

станта k равна k

/n, где k

— константа скорости ферментатив-

ной

реакции, а п — число молекул

субстрата,

необходимых для

продукции одной молекулы О

. Из опыта

следует,

что наиболее

вероятное значение п равно 8.

Таким обазом, фотосинтез состоит из практически мгновенной

первичной фотохимической реакции и ферментативной темновой

7.1. ФОТОСИНТЕЗ 337

реакции (точнее — совокупности таких реакций). Эти два про-

цесса можно разделить в опытах с импульсным освещением (см.

далее). Такие опыты были впервые проведены Эмерсоном и Ар-

нольдом [3], изучавшими фотосинтез в клетках зеленой водо-

росли хлореллы. Было установлено, что при вспышках длитель-

ностью 10~

выход

кислорода P

, приходящийся на одну вспыш-

ку, вначале пропорционален интенсивности вспышки (числу

квантов),

а затем стремится к насыщению. Кривая зависимо-

сти Pf от энергии вспышки подобна кривым, изображенным на

рис.

7.2.

Из

данных химического анализа

следует,

что на один фер-

ментный комплекс или на одну молекулу обобщенного фермента

приходится около 300 молекул хлорофилла. Такой комплекс име-

нуется фотосинтетической единицей (см. [4]). В фотосинтезирую-

щих бактериях число молекул хлорофилла в фотосинтетической

единице снижено до 50. Большое число молекул хлорофилла,

объединенных в комплексе с одной молекулой обобщенного

фермента, легко объясняется соотношением размеров этих мо-

лекул. Молекулярный вес фермента порядка

—10

хлоро-

филла — 10

Константа скорости k

находится путем измерения зависимо-

сти выхода О

от продолжительности интервалов времени

между

вспышками td. По мере возрастания td

выход

на вспышку уве-

личивается, пока ta не достигнет 0,1 с. При этом значении проис-

ходит

насыщение. Следовательно, лимитирующий скорость про-

цесса фермент может переработать практически все количество

субстрата, полученного при вспышке, за время порядка 0,1 с.

Среднее время, необходимое для превращения одной молекулы

субстрата, примерно в пять раз меньше; оно составляет около

0,02 с при комнатной температуре. Иными словами, k

1/0,02

= 50 с-

Вместе с тем опыты с импульсным освещением

дают

количе-

ство фермента в фотосинтетической единице, равное

Е = СЫ/300,

где Chi — количество хлорофилла. Отсюда

следует,

что если

один и тот же фермент лимитирует как стационарную скорость

фотосинтеза при постоянном освещении, так и

выход

на вспыш-

ку, то t'max = k

E/n = 50 Chl/rt-300 « 0.02 Chi в с~'. Иными сло-

вами, максимальная скорость фотосинтеза при постоянном осве-

щении

равна одной молекуле О

на молекулу хлорофилла за

50 с. Эта оценка хорошо согласуется с опытом.

Изложенная

элементарная теория имеет ясное содержание,

ее простота является крупным достоинством. В действительно-

сти, однако, фотосинтез включает целую совокупность фермен-

338 ГЛ. 7. ФОТОБИОЛОГИЧЕСЖИЕ ПРОЦЕССЫ

тативных реакций, и максимальная скорость может определять-

ся

не одной, а несколькими реакциями. При вспышках длитель-

ностью 10~

с максимальный

выход

процесса становится выше

оказывается зависящим от температуры (см. [1]).

Фотосинтетические единицы локализованы в

хлоропластах

—

специализированных органоидах растительных клеток. Строе-

ние

и функциональность хлоропластов рассматриваются в § 7.5.

Здесь мы остановимся на некоторых свойствах хлоропластов,

имеющих общее значение для понимания фотосинтеза.

В водной суспензии хлоропластов с солями трехвалентного

железа выделение кислорода пролонгируется. Происходит

реак-

ция

Хилла

[5], сводящаяся к фотосинтезу, к выделению О

vitro

при участии добавленного окислителя. Таким окислителем

служат

ферри-соли, хиноны, красители. При изготовлении сус-

пензии

хлоропластов уничтожается или повреждается система 3

на

рис. 7.1. Добавленный окислитель, т. е. акцептор водорода,

замещает систему СО

/(СН

О). Установлено, что реакция Хил-

ла действительно является фотохимическим окислением воды.

Продукция

в этом

случае

почти такая же, как и при фотосин-

тезе in

vivo.

Реакция

Хилла показывает, что фотосинтез есть окислитель-

но-восстановительная реакция

между

О и СО

, в

ходе

кото-

рой

четыре атома Н переносятся от Н

О к СО

и оба реагента

одинаково существенны для процесса в целом. Однако первич-

ная

фотохимическая реакция более непосредственно связана с

дегидрогенизацией воды, чем с гидрогенизацией СО

. Источни-

ком

является Н2О, а не СО

, что доказано опытами с водой,

обогащенной О

[6, 7].

Химия фотосинтеза рассматривается в § 7.4. Фотохимическая

стадия завершается восстановлением НАДФ до НАДФ-Н, при-

чем идет фосфорилирование, т. е. образование АТФ.

Одновременно с фотосинтезом происходит дыхание, т. е. по-

глощение О

. На

свету

измеряется разность этих

двух

процес-

сов.

Доказано, что скорость дыхания одинакова в темноте и на

свету.

Тем самым два процесса

могут

быть разделены.

Дыха-

тельная цепь локализована в митохондриях, хлоропласты «не

дышат». У ряда растений наблюдается

фотореспирация,

специ-

фический

процесс поглощения кислорода на

свету,

реализующий-

ся

под действием света определенного спектрального состава.

В этом и последующих параграфах приводится лишь краткое

рассмотрение фотосинтеза, поневоле огрубленное. Фотосинтезу

посвящена

громадная литература, исследования в этой области

интенсивно

развиваются, и наши знания обогащаются непре-

рывно.

Фотосинтезирующая система чрезвычайно сложна.

Сошлемся,

наконец, на некоторые монографии, посвященные

фотосинтезу [1, 8—11, 74].

7.2. ХЛОРОФИЛЛ И ДРУГИЕ

ПИГМЕНТЫ

339

7.2. ХЛОРОФИЛЛ И ДРУГИЕ ПИГМЕНТЫ

Во

всех

фотосинтезирующих клетках, за исключением фото-

синтезирующих бактерий, фигурирует хлорофилл a (Chi а).

В бактериях вместо СЫ а наличествует бактериохлорофилл

сн,

/Ч/Ч/Ч

гн Рн

"l:::C°

°C

/-N"

| |

7—NH

N=(

^CH-CH

;сн

;сн-сн

СН

сн,

у"

— к

O\W

ни/

н Х Ч/Х

н н

Рис.

7.3.

Структурные формулы некоторых пигментов.

—хлорофилл

а. В хлорофилле b обведенная кружком группа СН

заменена на

—НС=О;

—

каротин;

В —

фикоэритробилин.

Chi. Chi а

имеет

сине-зеленую

окраску.

Менее

универсально,

хотя

обычно,

присутствие

хлорофилла

b (Chi b). В

литературе

340

ГЛ.

ФОТОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ

описаны

другие

хлорофиллы, содержащиеся

разных типах

водорослей. Строение

Chi а и Chi b

показано

на рис.

7.3,

Л. В ос-

нове структуры находится порфириновое кольцо, ответственное

за поглощение света

видимой области спектра.

центре коль-

ца

расположен атом

Mg.

Заметим попутно,

что

порфириновые

циклы

комплексах

другими атомами фигурируют

ряде

важнейших

для

биологии веществ

— в

геме (атом

Fe), в

гемоцианинах (атом

Си)

и др. [12].

Наряду

хлорофиллами

фотосин-

тетических системах растений присут-

ствуют

другие

окрашенные вещества,

пигменты, играющие вспомогательную

роль. Общим правилом является

на-

личие

каротиноидов

(рис.

7.3,5).

красных водорослях

(Rhodophycae),

сине-зеленых водорослях

(Суапо-

phycae)

присутствуют

фикобилины

(ве-

щества, родственные желчным

пиг-

ментам),

содержащие разомкнутое

порфириновое

кольцо

(рис. 7.3, В).

В табл.

7.1 [1]

приведены спектраль-

ные

характеристики хлорофиллов

других

пигментов,

участвующих

в фо-

тосинтезе.

На

рис. 7.4

показаны полосы

по-

глощения

Chi а,

каротиноида,

фико-

эритрина

фикоцианина

[1].

Основная

проблема химии

физи-

ки

фотосинтеза состоит

раскрытии

механизма преобразования энергии

света

химическую энергию, запасаемую

синтезируемых орга-

нических соединениях. Хлорофилл

—

вещество, определяющее

фотосинтез;

энергия света,

им

поглощенная, используется

для

фотосинтеза. Очевидно,

что

исследования указанной проблемы

целесообразно начинать

простых фотохимических реакций

участием хлорофилла. Именно

это

направление начали

с 1948 г.

развивать Красновский

и его

сотрудники

(см. [10, 11]).

Реакция

Красновского,

открытая

в 1948 г. [13],

состоит

в об-

ратимом фотовосстановлении хлорофилла

им

Chi

+ АН •* СпГ +

АН"

Тем самым, световая энергия трансформируется

in vitro в

хими-

ческую

при

участии хлорофилла. Восстановителем,

т. е.

доно-

ром электрона

этих опытах служил аскорбат. Восстановленный

4000 5000

ВООО

7000

Длина

волны,

Рис.

7.4. Полосы поглоще-

ния

хлорофилла

а (/), каро-

тиноида (2), фикоэритри-

на (3) и фикоцианина (4).

По

оси

ординат—оптическая

плотность.