Волькенштейн М.В. Общая биофизика

Подождите немного. Документ загружается.

7.2. ХЛОРОФИЛЛ И ДРУГИЕ ПИГМЕНТЫ

341

Таблица 7.1

Спектральные характеристики растительных пигментов

Тип

пигмента

Максимумы поглощения, А

органических

растворителях

клетках

Растения,

содержащие

пигмент

X Л О р О ф II Л Л Ы

ChU

Chlb

Chic

Chid

Бактериовиридин

В Chi a

В Chi b

II.

Каротиноиды

Па.

Каротины

a-каротин

^-каротин

•у-каротин

Пб.

Каротинолы

(ксантофиллы)

Лютеол

Виолоксантол

Фу кокса нтол

Спириллокса нтол

4200,

6600

4530,

6430

4450,

6250

4500,

6900

Две формы:

4250,

6500

4320,

6600

3650,

6050,

7700

3680,

5820,

7950

В гексане

4200,

4400,

4700

В гексане

4250,

4500,

4800

В гексане

4400,

4600,

4950

В этаноле

4250,

4450,

4750

В этаноле

4250,

4500,

4750

В гексане

4250,

4500,

4750

В гексане

4640,

4900,

5240

4350,

6700-

6800

(не-

сколько

срирм^

4800,

6500

Полоса

6450

Полоса

7400

Полосы

7500

или

7600

Полосы

8000,

8500,

8900

Полоса 10 170

Все фотосинтезирую-

щие растения кро-

ме бактерий

Высшие растения и

зеленые водоросли

Диатомеи и бурые во-

дирисли

Некоторые красные

водоросли

Зеленые бактерии

Пурпурные и зеленые

бактерии

Штамм пурпурных

бактерий

Rhodop-

seudomonas

Многие листья и во-

доросли. Главный

каротин в красных

водорослях и в груп-

пе зеленых водоро-

СЛ6И

Главный каротин во

всех

других

расте-

ниях

Главный каротин в зе-

леных серных бак-

териях

Главный в зеленых и

красных водорослях

Второй важнейший ка-

ротинол листьев

Главный в диатомеях

бурых

водорослях

Пурпурные бактерии

342

ГЛ. 7. ФОТОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ

Таблица

7.1

(продолжение)

Тип

пигмента

III.

Фикобилины

Фикоэритрин

Фикоцианины

Аллофико

цианины

Максимумы поглощения, А

органических

растворителях

В Н

О и in

vivo

4900,

5460,

5760

В Н

О и in

vivo

6180

В фосфатном

буфере,

рН

6,5

6540

клетках

Растения,

содержащие

пигмент

Главные в красных

водорослях

Главные в сине-зеле-

ных водорослях

Красные

и сине-зеле-

ные

водоросли

хлорофилл может быть окислен вновь. По-видимому, возбужден-

ные

светом молекулы хлорофилла восстанавливаются in

vivo

за

счет воды. Таким образом, главный пигмент растительных кле-

ток—

хлорофилл — непосредственно

участвует

в окислительно-

восстановительных реакциях

т*

при освещении. К этим резк-

Ь, -

S*-

/ циям относится и обратимое

Фотохимия

фотоокисление хлорофилла

\ ферри-ионом [14]:

СЫ

+++

z*. Chl

"' Каков же механизм реакции

Рис.

7.5. Схема электронных уровней Красновского?

хлорофилла по Красновскому [11].

На ОСНО

вании исследований

спектров поглощения и флуо-

ресценции

хлорофилла и его аналогов можно считать, что элек-

тронные уровни хлорофилла расположены так, как показано на

рис.

7.5. В темноте молекула находится на нижнем синглетном

электронном

уровне 5

. Полосы поглощения СЫ соответствуют

переходам 5

->-5* (в красной области) и

->S\

(в синей об-

ласти спектра). Обратный переход

S\->S*—

безызлучательный

(показан

волнистой стрелкой); флуоресценция соответствует пе-

реходу

S*->5

. С уровня S* возможен безызлучательный пере-

ход в триплегное состояние Т, являющееся метастабильным. При

поглощении

света в этом состоянии СЫ переходит в возбужден-

ное

триплетное состояние Т*. Об образовании метастабильного

триплетного состояния хлорофилла свидетельствует фосфорес-

ценция

его замороженных растворов [15]. Схема рис. 7.5 дана

упрощенном виде, на ней не указаны колебательные уровни.

7.2. ХЛОРОФИЛЛ И ДРУГИЕ ПИГМЕНТЫ 343

Теренин рассмотрел роль триплетных состояний в фотохимии

красителей (пигментов) [16]. В этих состояниях молекула нахо-

дится в неустойчивой активной конфигурации, несущей

большую

часть поглощенной энергии светового кванта. Такие молекулы

способны эффективно

участвовать

в химических превращениях

в процессах миграции энергии. Роль триплетных состояний оп-

ределяется большой длительностью их жизни и химической не-

насыщенностью вследствие наличия неспаренных электронов.

Соответственно, обратимое фотовосстановление хлорофилла

можно представить схемой

> -Chi-

• СЫ

•

+ АН 5± -СИГ +

•

АН

Точка изображает неспаренный электрон, по-видимому, делока-

лизованный в системе сопряженных связей порфиринового цикла.

Красновский

и его сотрудники доказали методом ЭПР, что при

фотовосстановлении хлорофилла возникают свободные радикалы

[11,

17—20].

Как

уже сказано, хлорофилл подвергается и фотоокислению,

в частности, кислородом при интенсивном освещении растворов

Chi

на

воздухе.

Эти явления также были детально изучены в

работах

Красновского и его школы [11, 21—25].

Таким образом, хлорофилл,

будучи

возбужден

светом, может

играть роль и донора, и акцептора электрона.

— е —е

Донор

ч=к Chi ч=^

Акцептор

— е —е

Сказанное

относится и к

ряду

других

порфириновых соедине-

ний—

аналогов хлорофилла.

Спектр поглощения Chi a in

vivo

характеризуется сложным

характером его красной полосы поглощения [26]. Это заставляет

думать

о наличии нескольких форм хлорофилла. Жизнь расте-

ния

несомненно связана с химическими превращениями хлоро-

филла, биосинтез которого является важной особенностью фото-

синтезирующих клеток (см. [27]). Красная полоса поглощения

смещается, когда листья живого растения, выросшие в темноте,

постепенно зеленеют на

свету.

Наличие нескольких форм хлоро-

филла доказывается тем, что во время постепенной его экстрак-

ции

из листьев спектр поглощения меняется [28]. Различные

формы,

возможно, связаны с разными типами специфической

агрегации молекул хлорофилла.

0,09

0,08

п.07

0,05

ОМ

344 ГЛ. 7. ФОТОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ

Энергия света, поглощенного хлорофиллом и другими пиг-

ментами, как уже сказано, может запасаться, переноситься от

молекулы одного пигмента к молекуле

другого,

мигрировать

между

тождественными молекулами, излучаться в актах флуо-

ресценции и фосфоресценции и рассеиваться, превращаясь в

тепло. Проблемы, связанные с этими явлениями, рассматривают-

ся

далее. Во

всех

случаях первичный акт фотохимического про-

цесса состоит в поглощении света. Эффективность использова-

ния

энергии световых квантов, поглощенных вспомогательными

пигментами, варьирует от 20 до 100% эффективности использо-

вания

энергии, поглощенной Chi а. По-видимому, одна из функ-

ций

вспомогательных пигментовсо-

стоит в снабжении хлорофилла а

поглощенной энергией.

Количественное исследование фо-

тохимического процесса

требует

прежде всего изучения спектра дей-

ствия света, т. е. зависимости ско-

рости продукции кислорода Р от

числа поглощенных квантов /

длины волны к. Спектром действия

Мш шщ А называется функция

Рис.

7.6. Спектр действия р/[ = f (}J)

(7.2)

(квантовый

выход) фотосин-

теза для хлореллы. Если Р — число молекул СЬ, проду-

цируемых в 1 с, 1

— число кван-

тов, поглощаемых в 1 с, то f(i) означает квантовый

выход

фо-

тосинтеза, обозначаемый Ф(к). На рис. 7.6 показан график

функции

Ф{Х) для хлореллы [29]. Снижение квантового выхода

в области

4500—5000

А, соответствующей поглощению света

каротиноидами, заставляет

думать,

что эти вещества являются

относительно слабыми сенсибилизаторами фотосинтеза. Напро-

тив, в области поглощения света фикобилинами такого падения

Ф(Х) нет и, следовательно, фикобилины имеют такую же

эффек-

тивность, как и Chi а. Из анализа спектров действия

следует,

что

эффективность каротиноидов меняется от 20 до 50% эффектив-

ности Chi а, эффективность фикоэритрина — от 60 до 100%.

Абсолютное значение максимального квантового выхода ха-

рактеризует число квантов, необходимых для выделения одной

молекулы Ог- Пользуясь методом дифференциальной маномет-

рии,

Эмерсон и Чалмерс [30] определяли порознь выделение О

поглощение СОг при фотосинтезе. Это было осуществлено

также другими методами. Количественные данные показывают,

что число квантов, поглощаемых при выделении одной моле-

кулы кислорода, равно 8 (см. [1]). Отсюда

следует,

что для пере-

носа каждого атома водорода от Н

О к СО

нужно два кванта.

7.2. ХЛОРОФИЛЛ И ДРУГИЕ ПИГМЕНТЫ 345

По

другим данным число квантов, приходящихся на молекулу

варьирует от 8 до 12.

Характерной особенностью кривых Ф(к) является резкое па-

дение квантового выхода в длинноволновой, красной, области

спектра («красное падение»). Оно наблюдается вблизи

6800

в зеленых водорослях и вблизи

6500

А — в красных. Сходный

эффект

обнаруживается в спектре действия реакции Хилла [1].

Как

мы увидим, объяснение красного падения не тривиально.

Chi

а поглощает свет в этой области. Соответственно возникает

вопрос, отвечает ли красная полоса поглощения Chi а одному

или нескольким электронным переходам. Если справедливо вто-

рое, то одни переходы

могут

быть эффективными,

другие

— не-

эффективными

при фотосинтезе.

В работах лабораторий Красновского (см. [11, 31]) и Ливинг-

стона [32] было показано, что хлорофилл частично агрегирует в

неполярных растворителях, вероятно, образуя димеры. Примене-

ние

современных методов исследования — электронографии [33],

инфракрасной

спектроскопии и спектроскопии ЯМР к изучению

агрегации пигментов позволило обосновать представление о том,

что в димере образуется координационная связь карбонильной

группы одной молекулы Chi с центральным атомом Mg

другой

молекулы [34]. Агрегированные формы Chi а и

других

пигментов

получены в модельных системах — в концентрированных раство-

рах, монослоях и пленках [35]. В модельных системах наблю-

даются спектры поглощения и люминесценции, сходные с тако-

выми, in

vivo.

Установлено, что обратимые окислительно-восста-

новительные фотореакции свойственны как мономерным, так и

агрегированным формам (см. [11]).

Как

уже указывалось, в растениях наблюдается ряд «спект-

ральных форм» хлорофилла, в частности, Chi а. Среди них

имеются и агрегированные. В работах Литвина и сотрудников

[35, 36] установлено, что в различных фотосинтезирующих орга-

низмах фигурирует один и тот же набор форм хлорофилла.

Число таких форм велико, для Chi а оно более 10.

Допустим, что длинноволновая часть полосы поглощения при-

надлежит димерам, Chl

, в которых происходит более быстрая

конверсия энергии электронного возбуждения в колебательную

энергию. В этом

случае

димер СЫ

малоэффективен в фотосин-

тезе, и красное падение объясняется.

Другое

объяснение со-

стоит в том, что Chi a in

vivo

фигурирует в нескольких формах,

разнящихся положением полос поглощения, а также фотохими-

ческой эффективностью и выходом флуоресценции. Действи-

тельно, как показано на рис. 7.6, красная полоса Chi а состоит

из

двух

компонентов примерно равной интенсивности,

6700

6800

А. Имеются указания на наличие третьего слабого компо-

нента у

6950

А.

346 ГЛ. 7. ФОТОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ

Ряд дополнительных фактов показывает, однако, что красное

падение

требует

более сложного объяснения. Здесь очень важен

эффект

Эмерсона,

состоящий в том, что свет, неэффективный в

далекой красной области, становится полностью эффективным

при

одновременном освещении более коротковолновым излуче-

нием,

например при комбинированном воздействии светом с

Я,

7000

6500

А [37]. Эффект Эмерсона показан на рис. 7.7. Дей-

ствие двойного облучения неаддитивно, выделение О

существен-

но

больше суммарного эффекта при освещении

двумя

типами

излучения, примененными порознь. Количественно эффект Эмер-

сона характеризуется величиной

ДО

(комбинированное

— ДО

(коротковолновое

освещение) освещение)

,_ „-,

ДО

(длинноволновое

освещение)

' \ • )

где ДОг — скорость выделения кислорода. Спектр действия эф-

фекта, т. е. зависимость е от длины волны добавочного коротко-

волнового света, показывает, что е

особенно велико, когда большая

часть этого света поглощается од-

ним

из вспомогательных пигмен-

тов — Chi b в зеленых водорослях,

СЫ

с или фикоксантолом в диато-

меях и фикобилином в красных и

сине-зеленых водорослях.

Отсюда

следует,

что для полной эффектив-

ности фотосинтеза нужно поглоще-

ние одного кв

анта хлорофиллом а

другого

— одним извспомогатель-

Рис.

7.7. Эффект Эмерсона

ых пигментов. Красное падение

в хлорелле. происходит в области, в которой

/ — график Ф (А) при длинноволно .-,, ,

вом освещении, 2 — график Ф

(К)

при СВвТ ПОГЛОЩаетСЯ ТОЛЬКО СП! п.

добавочном коротковолновом осве- g

красных ВО

ДОрОСЛЯХ ПЭДеНИе

квантового

выхода

происходит при

сравнительно малой длине волны

6500

А. Это наглядно объяс-

няется предполагаемым поглощением

двух

квантов. Красные

водоросли не

содержат

Chi b и область поглощения Chi a

простирается в них примерно до

6500

А, при более длинных вол-

нах становится заметным поглощение света фикоцианином.

Однако предложенная интерпретация не свободна от неяс-

ностей. Фикобилин сенсибилизирует флуоресценцию СЫ а в

красных водорослях. Иными словами, кванты, поглощаемые

вспомогательными пигментами, переносятся на СЫа. Перенос

является количественным. Остается непонятым, каким образом

те же кванты

могут

нести иную фотохимическую функцию.

7.3. ДВЕ

ФОТОХИМИЧЕСКИЕ СИСТЕМЫ

347

Более детальное исследование эффекта Эмерсона показало,

что наряду с максимумами е(А,), соответствующими вспомога-

тельным пигментам, в полосе поглощения СЫ а имеется макси-

мум при

6800

А (рис. 7.8) [38]. Этот

результат

показал, что эф-

фект

Эмерсона определяется поглощением одного кванта одной

формой

хлорофилла а и второго кванта —

другой

его формой.

Максимумы на кривой спектра действия связаны не с поглоще-

нием

вспомогательных пигментов, но с резонансным переносом

энергии

возбуждения с этих пигментов

на

активную форму СЫ а.

Из

изложенных фактов

следует

гипо-

теза о

двух

фотохимических системах,

' °

действующих в фотосинтезе — ФС / и

ФС//

[1, 39]. Система // флуоресцирует

сильно,

система / — слабо. В зеленых

растениях ФС // содержит хлорофилл а

с максимумами поглощения

6700

6800

А, но не

6950

А. ФС / содержит все

эти

три формы СЫ а. Кванты, поглощен-

ные

СЫ а

6700

и СЫ а

6800,

переносятся

ФС / на СЫ а

6950

и энергия их дис-

сипирует, чем и объясняется низкий вы-

ход флуоресценции. Появление пика при

6700

А на кривой е(Х) объясняется тем,

что ФС // содержит большую долю Chi a

6700,

чем ФС /.

Если

две фотохимические системы

сенсибилизируют две последовательные

фотохимические реакции, то они должны действовать с оди-

наковой

скоростью. Свет поглощается одновременно в обеих

системах, но в неодинаковой степени. При А >

6500

А в крас-

ных водорослях и при

Х>6800А

в зеленых водорослях си-

стема / получает избыточную, а система // недостаточную

энергию,

чем и объясняется красное падение. Нарушается ба-

ланс,

необходимый для совместной работы

двух

систем. Баланс

этот улучшается при одновременном освещении более коротко-

волновым светом [1].

6500 6900

Длина

волны,

Рис.

7.8. Спектр действия

эффекта Эмерсона для

хлореллы.

§ 7.3. ДВЕ ФОТОХИМИЧЕСКИЕ СИСТЕМЫ

Если

световые реакции, сенсибилизированные двумя фотохи-

мическими

системами, происходят последовательно, то можно

определить спектр поглощения каждой системы, измерив спект-

ры действия фотосинтеза при сильном, но не насыщающем

воздействии светом, поглощаемым

другой

системой. Скорость

общей реакции в этом

случае

определяется лимитирующим

348

ГЛ.

ФОТОБИОЛОГИЧЕСКИЕ

ПРОЦЕССЫ

процессом.

Если избыточный свет поглощается системой /, то

скорость реакции, а значит, и спектр действия, лимитируется си-

стемой // и наоборот. Соответствующие измерения привели к

установлению спектров поглощения обеих систем (рис. 7.9) [40].

ФС//

несколько богаче Chi b и Chi а

6700,

ФС / содержит боль-

ше Chi а

6800

и Chi а

6950.

Нельзя, следовательно, считать, что

Chla6700 служит сенсибилизатором одной фотохимической ре-

акции,

Chi a

6800

— другой. Обе реакции связаны

друг

другом

относительно медленным темновым процессом.Это доказывается

тем, что эффект Эмерсона наблюдается и при вхождении в ре-

акционный

сосуд

под прямым

углом

друг

другу

двух

лучей

(СН

6400

6700

7000

7300

Длина

волны,

Рис.

7.9. Спектры погло-

щения ФС / и ФС // в

хлорелле.

По

оси

ординат

—оптическая

плотность.

Рис.

7.10.

Схема

фотосинтеза с

двумя

фотохимическими стадиями, сенси-

билизированными ФС / и ФС II.

света разной длины волны. При таких условиях коротко- и длин-

новолновый

свет поглощается клетками водорослей в разное

время.

Эффект Эмерсона обнаруживается при прерывистом воз-

действии света с разной длиной волны с интервалом

между

вспышками,

достигающим нескольких секунд [41]. В красных во-

дорослях

Porphyridium

выделение Ог при вспышке зеленого

света усиливается, если ей предшествует вспышка красного

света, поглощаемого Chi а в ФС /. Отсюда

следует,

что при этом

получается долгоживущее промежуточное соединение. Время

его полураспада оценивается в 18 с. Напротив, выделение О

при

вспышке красного света не усиливается, если ей предшест-

вует

вспышка зеленого; таким образом, зеленый свет, поглощае-

мый

ФС //, не создает долгоживущих промежуточных соединений.

Из

сказанного

следует,

что общую

схему

фотосинтеза можно

представить рис. 7.10. Мы пришли к уточнению схемы, показан-

ной

на рис. 7.1 [1].

Каким

образом поглощенные кванты распределяются

между

двумя системами так, что они работают с одинаковой ско-

ростью? Здесь предложены две гипотезы. Согласно первой из

7.3. ДВЕ ФОТОХИМИЧЕСКИЕ СИСТЕМЫ 349

них, избыточная световая энергия, поглощенная ФС //, «перели-

вается»

в ФС/, но не наоборот, так как переход энергии возбуж-

дения

с Chi a

6950

на хлорофиллы а

6800

6700

затруднен вы-

соким

барьером. «Переливание» приводит к сбалансированному

возбуждению обеих систем в области спектра, в которой больше

света поглощается ФС II, чем ФС/. Оно объясняет красное па-

дение при X >

6800

А, где свет поглощается главным образом

СЫа6950 в ФС/. В водорослях, содержащих фикобилин, Chi a

основном содержится в ФС/, и красное падение начинается

при

6500

А.

Вторая гипотеза исходит из пространственного разделения

ФС/

ФСII,

находящихся в

«отдельных

пакетах»

(см. [42]).

Эта гипотеза более правдоподобна, так как пространственное

разделение систем подтверждается опытами по фракционирова-

нию

вещества хлоропластов. Сбалансированное возбуждение оп-

ределяется в этом

случае

не переносом энергии от ФС II к ФС/,

но

наличием в обеих системах одинаковых пигментов, хотя и в

разных пропорциях. Квантовый

выход

фотосинтеза должен при

этом иметь минимумы в областях, в которых одна из систем по-

глощает свет сильнее, чем другая. Соответствующая тонкая

структура

спектра действия была действительно обнаружена.

Изучение дифференциальных спектров поглощения дало бо-

гатую

информацию о

двух

фотохимических системах. Дифферен-

циальные спектры исследуются при одновременном поглощении

света, возбуждающего фотосинтез. Возбуждающий пучок на-

правлен перпендикулярно к аналитическому. Исследуются из-

менения

в дифференциальном поглощении слабого света при

наличии

сильного монохроматического освещения (в частности

вспышечного) по сравнению с темнотой. Дифференциальный

спектр

дает

сведения о пигментах, испытывающих обратимые

изменения

при фотосинтезе. Варьируя длину волны возбужде-

ния,

удается получить спектр действия и определить пигменты,

сенсибилизирующие изменения в поглощении. Этот метод был

развит Дейзенсом [42], вспышечная техника — в работах Кока

[43] и Витта [44]. Именно при помощи вспышечной техники, под-

робно описанной в [44], была получена наиболее детализирован-

ная

информация о молекулярных событиях при фотосинтезе. Эта

техника

дает

возможность измерять времена жизни т возникаю-

щих промежуточных соединений и времена их появления и ис-

чезновения

в интервале от 10~' до 10~

с. Времена эти широко

варьируют для разных процессов.

В клетках хлореллы и в хлоропластах зеленых растений при

освещении

обнаружены изменения поглощения с временем жизни

т = 3 мкс и временем появления промежуточных соединений,

меньшим

25 не [45, 46]. Дифференциальный спектр этих измене-

ний

имеет три отрицательных пика при

4300,

4600

4900

А и

350 ГЛ. 7.

ФОТОБИОЛОГИЧЕСКИЕ

ПРОЦЕССЫ

положительный при

5200

А. Таким образом, в синей области

происходит выцветание. Оно интерпретируется как переход не-

коего каротиноида в метастабильную форму

<25

не

Саг

~ *- Саг'.

3 мкс

Это доказывается рядом фактов. Спектр исследуется при тем-

пературах, меньших—160 °С, при которых заблокированы все

химические реакции. Он наблюдается при блокировке фотосин-

теза добавленным ядом 3-(3,4-дихлорфенил)-1,1-диметилмоче-

виной

(ДХММ) и исчезает полностью в присутствии парамаг-

нитных тушителей (О

). В гексане метастабильные состояния

каротиноидов характеризуются полосой 5140 А, близкой к

5200

А. Возникновение Саг* имеет очевидный биологический

смысл. При избыточном освещении энергия должна диссипиро-

вать, что и осуществляется через посредство Саг*. Каротиноиды

защищают хлорофилл от фотоокисления при избытке света.

Изучение ФС / показало, что содержащийся в ней СЫ а, обо-

значаемый СЫ

а.1,

окисляется на

свету.

Этот процесс, представ-

ляемый схемой

<20нс

СЫ

а, ~ *• СЫ а,.

20 мс

обнаруживается по появлению в дифференциальном спектре от-

рицательных полос при

4380,

6600,

6820

7000

А [47]. Первая

последняя полосы сильные. При добавлении феррицианида к

суспензиям хлоропластов амплитуды этих изменений сильно

убывают. СЫ ai окисляется феррицаанидом в темноте и восста-

навливается в темноте N-метилфеназониумсульфатом

(МФС).

В бутаноле фотоокисление чистого СЫ а сопровождается появ-

лением отрицательных полос при

4320

6660

А [48], что согла-

суется с результатами, полученными Красновским [11, 49].

Очень быстрое окисление хлорофилла СЫ а

показывает, что

это первичный продукт. Электрон переходит с СЫ a

на НАДФ+,