Волькенштейн М.В. Общая биофизика

Подождите немного. Документ загружается.

7.6. ХЛОРОПЛАСТЫ

361

происходит фотофосфорилирование АДФ. Суммарная реакция

имеет вид

НАДО

п'АДФ

+ п'Ф„ +

nha>

НАДФ-Н

л'АТФ

+ О

+ (п' — 2) Н

О.

Эта реакция реализуется в полной системе с участием пигмент-

ных систем и цепи переноса электронов. Главные физические

РиНулозофвсфт

Ри/>ул03пфосфат

/(силулозв-

РиНулшфосфат

J+ff

ФГК ФГК ФГК ФГК ФГК ФГК

ФГА

ФГА ФГА ФГА ФГА ФГА

Диотиацеттфасфат\

• В

НАДФ-Н

т—4

Фру/гтазофосфат

—

ацетон-

Рис. 7.18.

Путь

углерода

фотосинтезе.

ФГК

—

З-фосфоглицерат,

ФГА — глицеральдегид-3-фосфат.

проблемы фотосинтеза относятся к механизму фотофосфорили-

рования,

т.е. превращения световой энергии в химическую

энергию макроэрга. Эти проблемы рассматриваются в следую-

щих

двух

параграфах.

§ 7.6. ХЛОРОПЛАСТЫ

Как

уже сказано, фотосинтез происходит в органоидах ра-

стительных клеток, именуемых

хлоропластами.

На рис. 7.19

приведена электронная микрофотография среза хлоропласта из

листа кукурузы [57]. Хлоропласты имеют диаметры, варьирую-

щие

от 3 до 10 мкм, и толщину от 1,5 до 3 мкм. Таким обра-

зом,

хлоропласт заполняет почти всю клетку зеленой водоросли.

На

рис. 7.19 в хлоропласте видны примерно параллельные ла-

меллы,

погруженные в более

светлую

строму. У высших расте-

ний

ламеллы плотно упакованы параллельно

друг

другу

образуют стопки, называемые

гранами.

Ламеллы представляют

собой сечения уплощенных замкнутых мешочков — тилакоидов,

имеющих диаметр около

5000

А. Число тилакоидов в хлоропла-

сте порядка 1000. Модель структуры хлоропласта, предложен-

ная

Вейером [58], показана на рис. 7.20 [57]. Мембрана тила-

коида имеет толщину около 100 А.

362

ГЛ.

ФОТОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ

Ряд

фактов показывает, что все процессы фотосинтеза ло-

кализованы

в тилакоидных мембранах. Именно в них содер-

жатся активные пигменты, прежде всего хлорофилл. Фрагмен-

ты тилакоидов реализуют реакцию Хилла и фотофосфорили-

рование.

Из

фактов, изложенных выше,

следует,

что молекулы хлоро-

филла

в хлоропластах

действуют

независимо

друг

от

друга,

но

Рис.

7.19. Электронная микрофотография среза хлоропласта

согласованно, что обусловливается, по-видимому, наличием

определенных функциональных единиц, локализованных в ти-

лакоидах. Установлено, что некоторая доля молекул Chi а по-

глощающих свет вблизи

7000А,

ориентирована в хлоропласте

определенным образом. Об этом свидетельствуют измерения ди-

хроизма [59, 60]. Цитохром f, по-видимому, расположен близко

этим ориентированным молекулам хлорофилла. При освеще-

нии

зеленых листьев поглощение в цитохроме f при

5530

уменьшается, т.е. он окисляется. Это происходит и при низких

температурах. Одновременно наблюдаются и изменения в

спектре Chi а. Отметим, что при низких температурах

затруд-

нен

транспорт электрона на большие расстояния. Отсюда мо-

жно заключить, что цитохром f каким-то образом ассоциирован

с СЫа или с Р700 [57, 61] (см. также § 7.7).

7.6. ХЛОРОПЛАСТЫ

363

Как

указывалось выше, фотосинтез происходит в

двух

фо-

тохимических системах. Проблема пространственной локализа-

ции

этих систем в

хлоропластах

очень актуальна.

При

деструкции хлоропластов

ультразвуком

было установ-

лено,

что частицы с константой седиментации 385, имеющие

диаметр порядка 300 А, сохраняют способность к реакции Хил-

ла [62]. Частицы объемом менее 15 • 10

уже не активны [63].

Отсюда

следует,

что наи-

меньшее число молекул хло-

рофилла, активных в фото-

синтезе,

равно

40—120

[57].

При

освещении хлоро-

пластов или целостных фо-

тосинтезирующих организ-

мов (водорослей) наблюда-

ются два сигнала ЭПР. Пер-

вый

сигнал (R) представ-

ляет собой резкий пик, бы-

стро возникающий и быстро

исчезающий. Второй сигнал

(S)—широкий,

медленно

возрастающий и еще мед-

леннее исчезающий. /?-сиг-

нал

приписывается Chi а и,

возможно,

Р 700, т. е. ФС/,

S-сигнал

— ФС// [64]. ^-си-

гнал генерируется наимень-

шими

частицами, получаю-

щимися

при разрушении

хлоропластов, напротив,

S-сигнал

исчезает уже у гораздо больших фрагмен-

тов [65].

Опыты по сегментации хлоропластов показывают, что фото-

синтетическая активность действительно присуща отдельным

тилакоидам (см. [57, 66]). Более точная локализация пигмент-

ных систем пока не установлена. Для этого нужно было бы

провести опыты по реконструкции фотосинтетической системы

из

неактивных фрагментов.

Структурные исследования тилакоидов методом электронной

микроскопии

показывают, что тилакоиды

содержат

регулярные,

кристаллоподобные системы плотно упакованных

гранул

[66,

67].

На рис. 7.21 показана электронная микрофотография среза

тилакоида из листа шпината. На ней хорошо видны гранулы,

размером 185 X 155 X 100 А

. На некоторых микрофотографиях

удается

увидеть,

что эти частицы в свою очередь построены из

четырех

или большего числа субъединиц. Молекулярный вес

Рис.

7.20. Модель структуры хлоро-

пласта.

364

ГЛ.

ФОТОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ

гранулы оценивается в 2 • 10

Зная

состав ламелл, можно, ис-

ходя из этой оценки, определить число молекул различных ве-

ществ в грануле. Соответствующие данные приведены в

табл. 7.4 [67].

Число

молекул хлорофилла, равное 230, находится в разум-

ном

согласии с независимой оценкой для фотосинтетической

единицы

(см. стр. 337).

Рис.

7.21. Электронная микрофотография среза тилакоида.

Значение

этих гранул снижается тем обстоятельством, что

их упаковка варьирует в зависимости от условий роста расте-

ния.

Частицы, обладающие размерами, близкими к указанным,

способны

реализовать реакцию Хилла, но не полный фотосин-

тез,

даже

если к ним добавлены растворимые компоненты хло-

ропластов [57].

Рассеяние

рентгеновых лучей под малыми углами

дает

ин-

формацию

о размерах ламелл [69]. Каждый тилакоид состоит

из

корпускулярного слоя, построенного из частиц диаметром

31—36

А. Внутри слоя находится непрерывный элемент толщи-

ною в 42 А. Общая толщина тилакоида, состоящего из замкну-

того корпускулярного слоя, окружающего замкнутый же двой-

ной

непрерывный слой, равна 178А. Корпускулы диаметром

7.6.

ХЛОРОПЛАСТЫ

365

Таблица 7.4

Состав гранулы из

Лшшдная фракция

(числа молекул)

230 хлорофиллов

48 каротиноидов

48 хинонов

116 фосфолипидов

144 дигалактозилди-

глицеридов

366 моногалактозил-

диглицеридов

48 сульфолипидов

Стероиды

Неидентифицирован-

ные липиды

Итого

Молекулярный

нес

206 400

27 100

31 800

90 800

134 000

268 000

41 000

15 000

175 000

988 400

тилакоида шпината

Белкопая

фракция

Белок

2 атома марганца

12 атомов железа,

том числе содер-

жащиеся в

двух

ци-

тохромах

6 атомов меди

Итого

Молекулярный

вес

928 000

ПО

672

218

929 000

31 А соответствуют 'Д гранулы. Таким образом, результаты ис-

следования рассеяния рентгеновых лучей в какой-то мере со-

гласуется с построением гранул из субъединиц. Однако нет пол-

ного соответствия

между

данными электронной микроскопии

результатами изучения рассеяния рентгеновых лучей.

Два факта заслуживают особенного внимания — кристалло-

подобная

структура,

показанная на рис. 7.20, и отсутствие пол-

ной

фотосинтетической активности у частиц, имеющих размеры

гранул. Возможно, что для такой активности необходим именно

упорядоченный коллектив гранул, достаточно большой «кри-

сталл».

Высокая упорядоченность и периодичность структуры,

не

наблюдаемая в

других

мембранах, заставляет

думать

о воз-

можности применения представлений физики твердого тела к

механизму фотосинтеза (см. § 7.7). Это пока лишь гипотетиче-

ские

соображения. Вместе с тем, нельзя считать исключенными

артефакты, создаваемые оттенением посредством OsO

или

КМпО

применяемым в электронной микроскопии [69] (ср.

стр. 290).

Обработка детергентами (дигитонином) с последующим цен-

трифугированием и электрофорезом позволяет определить со-

держание и состав белков в хлоропластах [171, 172] Более

детальная информация о расположении и ориентации белко-

вых молкул в мембранах получена иммунологическими и

366 ГЛ. 7. ФОТОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ

другими методами. Установлено, что в хлоропластах имеются ча-

стицы

двух

сортов: легкие диаметром

70—110

А и тяжелые диа-

метром

150—180

А. Легкие частицы содержат больше Chi а, они

способны

к циклическому фосфорилированию и к восстановле-

нию

НАДФ

в присутствии аскорбата [173]. Тяжелые частицы

содержат больше Chi b, они способны восстанавливать на

свету

феррицианид

(реакция Хилла) и проводить нециклическое фос-

форилирование.

На этих основаниях легкие частицы отождеств-

ляются с ФС/, тяжелые — с

ФСII.

На квадратном микрометре

поверхности тилакоида содержится около

4000

легких частиц и

около

2000

тяжелых [174]. Из изложенного

следует,

что число

ФС

/ и ФС II должно быть примерно одинаково. Отсюда можно

заключить, что в каждой тяжелой частице содержится две

ФС//.

В работающих хлоропластах наблюдаются медленные изме-

нения

поглощения при

4750

и 5150 А, происходящие за секун-

ды [70]. В этих же спектральных областях наблюдаются быст-

рые изменения поглощения со временем появления полос, мень-

шим

10~

с, и временем исчезновения 20 мс [71]. Быстрые изме-

нения

являются индикаторами окислительно-восстановитель-

ных реакций. Установлено, что они происходят параллельно с

фосфорилированием.

Они отражают изменения электрического

поля

поперек мембраны, их исчезновение связано с транспор-

том протонов и

других

ионов. Действительно, при увеличении

проницаемости

мембраны для ионов в

результате

осмотического

шока

изменения исчезают быстрее. Это происходит и при дей-

ствии разобщителей фосфорилирования, увеличивающих про-

ницаемость для протонов. Наконец, ионофоры, такие как гра-

мицидин

D, увеличивающие проницаемость к щелочным ионам,

также ускоряют исчезновение спектральных изменений [44],

причем имеется четкая зависимость от концентрации грамици-

дина. Были проведены опыты со слоями Chi a, Chi Ъ и каро-

тиноидов на стеклянных пластинках. Слои подвергались дей-

ствию электрических полей с напряженностью до

В/см

измерялись

изменения поглощения. Они оказались совпадаю-

щими

с изменениями в хлоропластах, индуцированными све-

том [44]. Изменение поглощения А/// = АЛ линейно зависит от

изменения

потенциала Аг|з

Аф

= q

/c =

АЛ. (7.8)

Здесь q — заряд, перенесенный через мембрану, С — емкость

мембраны, примерно равная 1 мкФ, а ж 50 мВ/ДЛ. Кроме того,

работает «молекулярный амперметр», и ток через него равен

dhA „

79)

7.6. ХЛОРОПЛАСТЫ 367

При

вспышке, вызывающей один оборот, через мембрану пере-

носится два элементарных заряда е на одну электронную цепь.

Из

экспериментальных данных

следует,

что при этом

Aif>

« 50 мВ, при длительных вспышках Дяртах ~ 200 мВ, а при

стационарном освещении Дф « 100 мВ. Исследование световых

реакций показывает, что поле создается наполовину реакцией

в ФС / и наполовину — реакцией в ФС II [44].

помощью стеклянного электрода и индикаторов обнару-

жены и изменения рН, сопровождающие фотосинтез. При убы-

вании

электрического поля одновременно нарастает рН [72].

Согласно оценке отношение числа поглощенных протонов к

числу перенесенных электронов равно 2 (дальнейшие подроб-

ности см. в [44]).

Эти

результаты

качественно

согласуются

с хемиосмотиче-

ской

теорией Митчелла (см. § 6.4), согласно которой перенос

электронов

дает

свободную энергию для фосфорилирования в

форме градиентов г|) и рН (см. также [73]).

При

вспышке, вызывающей один оборот, Дф ^ 50 мВ, но

ДрН очень мало, значительно меньше единицы. Значит, в этих

условиях фотосинтез протекает независимо от ДрН. Показано,

что при единичной вспышке фосфорилирование действительно

происходит за

счет

Дт|з с

выходом

АТФ 0,30 на вспышку и не-

зависимо от интервала

между

вспышками. Фосфорилирование

блокируется грамицидином D. При значениях Дг{\ больших

50 мВ, количество возникающего АТФ пропорционально Aif.

Отсюда

следует,

что электрическая энергия используется для

продукции АТФ [74].

На

рис. 7.22 показана общая

схема

сопряжения различных

процессов в фотосинтезе, предложенная Виттом [44]. На ри-

сунке показан участок тилакоидной мембраны. При фотосин-

тезе

происходят

следующие

события, перенумерованные на ри-

сунке:

1. Миграция и диссипация энергии. Энергия запасается и

затем диссипирует в Саг*, а также в

результате

флуорес-

ценции.

2. Световые реакции, описанные выше (см. стр. 366).

3. Образование электрического поля вследствие направлен-

ного переноса электронов перпендикулярно к мембране, опре-

деляемого анизотропной ориентацией молекул.

4. Перенос электрона и втекание в мембрану протонов в

соответствии с теорией Митчелла (см. §§ 6.4, 6.5): два электро-

на

на внешней стороне мембраны замещаются

двумя

ионами

ОН,

а две дырки (-(-) на внутренней стороне мембраны — дву-

мя

протонами. Возможный механизм — протеолитические реак-

ции,

сопряженные с переносом электрона от Н

О к НАДФ

368

ГЛ. 7. ФОТОБМОЛОГПЧЕСКНП ПРОЦЕССЫ

5. Образование АрН. Связанные ОН~ и 11

могут

замещать-

ся

С1~ и К

. ОН~ и Н

диффундируют соответственно во внеш-

нюю и внутреннюю фазы, что создает разность АрН.

Рис.

7.22. Схема сопряжения молекулярных процессов в фотосинтезе по

Витту.

6. Управляемое полем истечение протонов и убывание АрН.

7. Управляемое нолем истечение К

8. Диффузионная убыль АрН.

9. Фосфорилирование, сопряженное с разрядкой электриче-

ски

энергизованной мембраны в соответствии с теорией Мит-

челла.

7.5. ХЛОРОПЛЛСТЫ 369

10. Регуляция внутреннего значения рН

;

. При рН' л; 8 К

проводимость мембраны больше, чем Непроводимость. При

генерации Н

(п. 4) возрастание [Н

]' замедляет поток элек-

тронов,

что, в свою очередь, замедляет генерацию Н

. Возра-

стание [Н

]

;

увеличивает вытекание Н

, что происходит за счет

вытекания

. [Н

]' поддерживается на определенном уровне.

Она

возрастает с увеличением частоты вспышек или интенсив-

ности

света. В свою очередь, ускоряется процесс 6 и фосфори-

лирование (процесс 9).

Таким

образом, энергия световых квантов заряжает мембра-

ну. В правой части рис. 7.22 показано, как используется эта

энергия.

Положения,

суммированные в приведенной схеме, подтверж-

даются многочисленными и разнообразными опытными фак-

тами. Однако механизмы соответствующих процессов еще не

установлены, и эту

схему

следует

пока считать гипотетической.

Вместе с тем, как подчеркивается в монографии [170], при-

менение

теории Митчелла к фотосинтезу встречается с трудно-

стями

при количественных оценках. В этой теории свободная

энергия

протонов должна превышать энергию фосфорилиро-

вания

пнбн>О

(7.10)

Здесь Сф « 0,5 эВ ж 11,5 ккал/моль, п

— число протонов, пе-

ремещение которых приводит к фосфорилированию. В естест-

венных условиях при Аг|) = 50 мВ и ДрН «*

2—2,5

имеем

Сн

= еД1|?+

7'-2,3

ДрН« 0,18 эВ.

(7.11)

Следовательно, «н должно быть не менее

трех

[175, 176]. В ра-

боте [177] дается близкая оценка — утверждается, что для син-

теза 1 моля АТФ нужны 4 протона. С

другой

стороны, из соот-

ношения

АТФ/е~ = 2 и Н+/е~ = 2

следует,

что на 1 моль АТФ

расходуются 2 протона. В условиях импульсного освещения

по-прежнему Дт|> = 50 мВ, а ДрН = 0. Число протонов состав-

ляет

0,5/0,005=

10. Но отношения АТФ/е- и Н

/е~ те же и,

значит, не

хватает

энергии восьми протонов.

Таким

образом, для применения теории Митчелла к фосфо-

рилированию при фотосинтезе необходим дальнейший анализ,

прежде всего уточнение количественных характеристик про-

цесса.

Вместе с тем феноменологическая картина, следующая из

всех

имеющихся данных, хорошо согласуется с теорией Мит-

челла.

370 ГЛ. 7.

ФОТОБИОЛОГИЧЕСКИЕ

ПРОЦЕССЫ

§ 7.7. ПЕРВИЧНЫЕ ФИЗИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ

ФОТОСИНТЕЗА

Рассмотрим в заключение физику элементарных процессов,

определяющих фотосинтез. Классификация этих процессов —

первичных процессов фотосинтеза— дана Борисовым [75]. Рас-

смотрению подлежат следующие четыре типа явлений.

а. Поглощение света хлорофиллом и вспомогательными

пигментами.

б. Перенос (миграция) энергии от поглотивших свет моле-

кул на реакционные центры.

в.

Первичное разделение зарядов разного знака.

г. Стабилизация новых носителей энергии во времени для

сопряжения

с последующими химическими стадиями.

Первая

группа явлений хорошо изучена и описана выше.

Обратимся теперь к миграции энергии в фотосинтетической си-

стеме. В работах Дейзенса [76] и

других

авторов было показа-

но,

что миграция энергии в этой системе действительно суще-

ствует

и происходит по резонансному механизму. В принципе

возможны четыре различных механизма миграции [75]. При

полупроводниковом механизме возбуждение молекулы светом

переводит электрон в зону проводимости, после чего образовав-

шаяся

пара разноименных зарядов (электрон и дырка) переме-

щается в упорядоченной молекулярной системе, в молекуляр-

ном

кристалле. Однако в хлоропластах молекулярных кристал-

лов нет, строгий порядок присущ лишь относительно малым

ансамблям молекул хлорофилла. Поэтому полупроводниковый

механизм маловероятен [75]. Вместе с тем измерения фотопро-

водимости слоев Chi а и Chi b показали, что в максимуме фото-

чувствительности

7050

А свободные носители тока появляются

через короткое время после освещения (не более чем через

10"

с)

[77]. Хлорофилл образует в этих слоях кристаллоподоб-

ные

упорядоченные структуры.

Упорядоченность молекул пигментов в хлоропластах доста-

точна для миграции энергии по другим механизмам [78, 79].

Возможна миграция энергии триплетных возбужденных состоя-

ний

[16] или резонансная миграция энергии экситонного или

индуктивного типа. В

двух

последних случаях диполь-диполь-

ное

взаимодействие приводит к переносу энергии синглетного

возбужденного состояния на невозбужденную молекулу [16, 75,

80].

При экситонной миграции она происходит за времена, срав-

нимые

с периодами колебаний (т.е. за

10~

—10~

с), на рас-

стояния

до

15—18А.

Это наиболее быстрый механизм. При

миграции

индуктивного типа ей предшествует установление тер-

мического равновесия возбужденной молекулы со средой, и

скорость миграции сильно зависит от температуры. Ряд экспе-