Волькенштейн М.В. Общая биофизика

Подождите немного. Документ загружается.

7.3. ДВЕ

ФОТОХИМИЧЕСКИЕ СИСТЕМЫ

351

Установлена стехиометрия

1: 1

окисления Chia

восстановле-

ния

НАДФ

[43].

Восстановление

Chi a

полностью блокируется

ядом ДХММ.

Так как

этот

яд

специфически блокирует окисле-

ние

воды,

то

конечным донором электрона

для Chi af

служит

вода.

Свет

с 1<

7000

вызывает обратимые изменения поглоще-

ния

Chi aj. За

окислением

следует

восстановление

течение

мс.

Однако

далекой красной области

7000—7300

проис-

ходит

лишь окисление хлорофилла

а/. Как уже

сказано, свет

с энергией кванта

йсо/

вызывает окисление

Chi a

свет

энер-

гией кванта

Ьащ

поглощается

ФС

//, в

результате

чего элек-

троны

могут

быть использованы

для

восстановления

Chi a

Пигмент

ФС

может возбуждаться лишь

при к <

7000

А. Это,

по-видимому, также

Chi а,

обозначаемый СЫ

Различие

Chi

ai и

СЫ

ал,

возможно, сводится

различию

в их

окруже-

нии.

Первый

—

«длинноволновый», второй

—

«коротковолновый»

хлорофилл.

Время жизни

Chi ал в 100 раз

меньше,

чем Chi а

. Тем не

менее,

удалось выделить реакцию

Chi ал на

свету,

характери-

зуемую

отрицательными пиками

при

4350

6820

А [50].

Схема

реакции

имеет

вид

<20нс

СЫ

~ *" СЫ а*„.

0,2

МС

Как

связаны

ФС/ и

ФС//,

т.е. Chi а/ и Chi a

Окисление

НгО

блокируется ДХММ. Следовательно, этот

яд

должен

вы-

зывать исчезновение обратимых изменений

Chi а/ и Chi a

если

они

связаны последовательно.

присутствии ДХММ

ис-

кусственный донор электронов

МФС

может снабдить

Chi a

электронами

вместо

О.

Если

оба

хлорофилла связаны,

то

МФС

может реактивировать

Chi а

но не

СЫ

. Это и

наблю-

дается

соответствии

со

схемой

[44]:

ДХММ

<- МФС

НАДФ

<— СЫ а, •« СЫ

<-Н

О.

Приведенная

схема

следует

из

результатов, полученных

помощью импульсной методики.

Не

следует,

однако,

думать,

что

эта

методика

дает

исчерпывающие данные. Если какой-либо

из

доноров

акцепторов электрона, участвующий

фотосин-

352

ГЛ.

ФОТОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ

тетической системе, не имеет соответствующей полосы погло-

щения,

то он может быть не замечен. Так, перенос электрона с

Chi

cii на НАДФ идет в действительности через ферредоксин

(см.

далее стр. 353).

Приводимые здесь схемы (они заимствованы у Витта [44])

нельзя считать окончательными. По мере улучшения методики

увеличения точности результатов экспериментов картина все

более усложняется. Ясно, что в исследованиях сложных проблем

фотосинтеза должны применяться (и применяются) различные

методы, дополняющие

друг

друга.

Свойства Chi а

;

и Chi пц представлены в табл. 7.2 [44].

Свойства

хлорофиллов

I и II

Таблица

7.2

Свойства

Тип

реакции

Характеристические изменения

поглощения

Время появления

Время жизни (20 °С)

Потенциал

Область возбуждения

Область рН

Температура инактивации

Время старения (0 °С)

Действующая концентрация

ДХММ

Chi

Донор электрона

4380,

6600,

6820-7030

А.

Расщепление полос

<20 не

20 мс

0,45 В

7300

3-11

65 "С

Нет

СЫ

ац

Сенсибилизатор ?

4350,

6400,

6820

Нет расщепления

<20 не

0,2 мс

—

7000

55 °С

т « 95 час

с « 10~

М/л

Связь

ФС / и ФС// осуществляется посредством пластохи-

нонов

(ПХ). При экстрагировании петролейным эфиром хло-

ропласты утрачивают способность окислять

воду,

но эта спо-

собность восстанавливается при добавлении ПХ [51]. ПХ уча-

ствуют

в окислительно-восстановительных реакциях.

Возбуж-

денный Chi а'

восстанавливает ПХ до гидрохинона, Chla+

окисляет его вновь. ПХ расположены в виде

«пула»,

содержа-

щего около пяти молекул,

между

ФС / и ФС//. (Подробности,

относящиеся к кинетическому поведению ПХ, см. в [44], а так-

же далее, см. стр. 372).

Этим дело, однако, не ограничивается. В окислительно-вос-

становительной цепи две молекулы Chi a

находятся в кон-

такте с двумя молекулами неидентифицированного пока что

вещества X — возможно также пластохинона, но находящегося

другом

окружении. Вещество X восстанавливается Chla

, и

служит переносчиком электрона. Максимальные изменения в

7.3. ДВЕ ФОТОХИМИЧЕСКИЕ СИСТЕМЫ

353

дифференциальном

спектре X — положительная полоса при

3350

А. Таким образом, получаем

схему

НАДФ+

ч— ChlOi <— ПХ <— X <— СЫа„ ч— Н

О.

Схема эта не полна —

между

ПХ и Chi а, имеются промежу-

точные переносчики электронов, равно как

между

Chi Ui и

НАДФ

(ферредоксин).

Ранее

было известно, что в хлоропластах содержатся по

крайней

мере два цитохрома — цитохром Ь

с окислительно-вос-

становительным потенциалом,

близким

к 0,0 В, и цитохром / ^

с потенциалом, близким к |-

+0,42

В. Позднее был найден | ^

г\^/~~\

еще и цитохром £>з с потенциа-

I V

У—:...

- ..х Л >

лом около —0,15 В. Диффе- | * '

ч/ w

ренциальные спектры показы- §э

вают, что цитохромы (прежде |

всего цитохром /) испытывают >

обратимое окисление в осве- """и ™"" ™"" J™*-

щенных фотосинтезирующих

Длина

волны,

клетках. Дифференциальный р

ис

. 7.11. Дифференциальный спектр

спектр цитохромов, получен- цитохромов в фотосинтезирующих

ный

Дейзенсом и сотрудника- системах,

ми

[52], показан на рис. 7.11.

Потенциалы

цитохромов промежуточны

между

потенциалами

ФС

/ и ФС II, соответственно цитохромы занимают промежу-

точное положение

между

ФС / и ФС //. Фотоокисление цито-

хрома / происходит только на

свету,

поглощаемом ФС/, т.е.

Chi

cii в красных водорослях. Свет, поглощаемый ФС //, т. е.

фикоэритрином

в красных водорослях, вызывает усиленное вос-

становление окисленного цитохрома /.

Другие

факты, характе-

ризующие роль цитохромов, приведены в [44]. Получается

схема

НАДФ+

ч— Chi а, <— цит/ ч— ПХ <— X ч— СЫ а

ч— Н

О.

По-видимому, один из цитохромов — цитохром bz — функцио-

нирует в окисленной форме как первичный окислитель в

ФС II [53]. Он служит акцептором электронов, происходящих

из

О. Цитохром / может служить в восстановленной форме

донором электронов в ФС/, передающим электрон на пиридин-

нуклеотид. После этого цитохромы Ь

и / взаимодействуют, при-

чем снова возникает окисленное состояние первого и восстанов-

ленное

второго. При этом освобождается свободная энергия,

354

ГЛ. 7. ФОТОБИОЛОГПЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ

'10

-0,5

Chi

aj,

Ьш„

Потерлэнергии

"ПХ

цитГ

—\-Потеря

^энергии

Ш_

ФП

НАДФ

СМ

а,]

(7000)

Рис.

7.12. Энергетическая

схема

событий, происходящих в ФС / и ФС II.

ПЦ—пластоцианип,

ПХ —пластохинон, ФД —ферредоксин, ФП — флавопротеид.

0,8

Рис.

7.13.

Схема

фотосинтеза.

и Y — первичные доноры и акцепторы электронов световой реакции II. Р 700 и X — пер-

вичные доноры и акцепторы электронов реакции I, P 690—реакционный центр ФС //,

700 — реакционный центр ФС /, ПХ — пластохинон, ПЦ — пластоцианнн, ФД — ферредоксин.

По

оси ординат отложены окислительно-восстановительные потенциалы в

вольтах.

7.4.

ИССЛЕДОВАНИЯ

ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ

355

равная 0,4 эВ, которая может быть использована для синтеза

АТФ. На рис. 7.12 показана энергетическая диаграмма событий

в ФС / и ФС II [44], а на рис. 7.13 — общая

схема

фотосинтеза

(ср.

рис. 7.10 и 7.1). Наконец, на рис. 7.14 приведена весьма

детализированная

схема

переноса электронов от НгО к НАДФ

хлоропластах

[44]. На

схеме

указаны временные и спектро-

скопические характеристики

соответствующих

процессов. Вре-

мя

окисления ПХ 20 мс является лимитирующим. Одновремен-

но

функционируют две цепи переноса электронов. Это доказы-

вается следующими соображениями: образование пластогидро-

хинона за одну вспышку, в которой переносится только один

<20мс

Цбме

п,2мс

НАДФ

4070

42405970

ШО 3350

5555

Рис.

7.14. Схема переноса электронов от Н

О к НАДФ

в хлоропластах [44].

электрон, можно понять, лишь если две цепи

действуют

парал-

тельно; первый порядок реакции исчезновения Х~

3350

(донор

электрона для ПХ) можно объяснить лишь наличием

двух

це-

пей;

кооперация

двух

СЫ а

доказывается блокированием

двух

центров Chi a

одной молекулой ДХММ.

7.4.

ИССЛЕДОВАНИЯ

ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ

Изучение спектров флуоресценции фотосинтезирующей си-

стемы

дает

ценную информацию о ФС / и ФС II, несмотря на

трудности интерпретации получаемых данных. Флуоресцирую-

щая

фотосинтезирующая система состоит из различных форм

356

ГЛ.

ФОТОБМОЛОГМЧЕСКМЕ ПРОЦЕССЫ

100

5500

пигментов,

между

молекулами которых возможна миграция

энергии (см. далее, стр.370), что очень усложняет картину.

Квантовый

выход

флуоресценции Chi а составляет 30% in

vitro

и лишь 3—6% in

vivo.

В последнем

случае

флуоресцируют

несколько форм хлорофилла а, разнящиеся спектрами испуска-

ния

и квантовыми выходами. Эти формы характеризуются раз-

личной зависимостью флуоресценции от интенсивности осве-

щения

и различным образом изменяются во время индукцион-

ного периода. Квантовый

выход

флуоресценции фикобилинов

не зависит от интенсивности освещения. Энергия, запасаемая

в Chi а, может расходоваться

в фотоситезе или излучаться.

Малый

выход

флуоресценции

определяется именно тем, что

энергия

идет на фотосин-

тез.

Спектр флуоресценции

Chi

а показан на рис. 7.15 [1].

Главная полоса

6850

А и коле-

бательный спутник

7400

А от-

личаются колебательной

энер-

гией, отвечающей частоте

1460 см"

, характерной для де-

формационного колебания

Рис.

7.15. Спектр флуоресценции

СН группы П

ри сильном ОС-

хлореллы при возбуждении светом

^ ''F"

с X

4200

А (сплошная кривая) и

4800

А вещении, превышающем насы-

(пунктир).

щающее для фотосинтеза,

По

оси ординат —квантовый

выход

флуорес- КВЭНТОВЫЙ ВЫХОД флуОреСЦеН-

ценцни

в произвольных единицах.

ции

примерно уДВаИВавТСЯ. Он

возрастает также при низких

температурах. Квантовый

выход

сильно меняется при быстром

переносе клеток из темноты на свет во время периода индукции

фотосинтеза. Изменение флуоресценции в этом периоде отра-

жает работу цепи переноса электронов.

Главная полоса испускания Chi a in

vivo,

обозначаемая

685, в действительности содержит

вторую

более

слабую

ком-

поненту в области

7000А.

При возбуждении клеток хлореллы

светом с X

4400

А, поглощаемым Chi а, длинноволновая компо-

нента сильнее, чем при возбуждении светом с X

4800

А, погло-

щаемым Chi b. Следовательно, полоса флуоресценции при

7200

A (F 720) определяется ФС/. Главная полоса, напротив,

относится к ФС II. В красных и сине-зеленых водорослях зеле-

ный

свет, поглощаемый фикобилинами, более эффективен для

возбуждения флуоресценции Chi о, чем свет, поглощаемый са-

мим Chi а. Фикобилины содержатся преимущественно

вФС//.

Из

этих фактов вновь

следует,

что имеются две формы хлоро-

7000 7500

Длина

волны, А

7.4.

ИССЛЕДОВАНИЯ

ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ

357

филла

а —флуоресцентная СЫ а

и нефлуоресцентная (слабо

флуоресцентная) СЫ а

Допустим, что возбуждение молекулы завершается либо

излучением с вероятностью /, либо внутренней конверсией,

безызлучательным переходом, с вероятностью g. Число воз-

бужденных молекул п удовлетворяет дифференциальному урав-

нению

n = -(f + g)n (7.4)

решением

я (0 = л

(0)ехр

[-(/ + £)/]. (7.5)

Квантовый

выход

излучения равен

/l(/)£fte

74T

;

для среднего времени жизни имеем

о /о

Следовательно, х = Фто, где то = 1// — «естественное» время

жизни

в отсутствие тушения при g = 0. Для СЫ а то = 15 не и

квантовый

выход

vitro

Ф = т/то =

4,5/15

= 0,3. In

vivo

при

слабом освещении Ф = 0,05, при сильном — Ф = 0,09,

тогда

как

прямые

измерения

дают

соответственно значения 0,03 и 0,06.

Расхождение объясняется наличием значительной доли нефлуо-

ресцирующего СЫ a in

vivo.

Расхождение устранится, если не

светится около половины всего хлорофилла а.

Спектр

действия флуоресценции СЫ a in

vivo,

т. е. зависи-

мость Ф от длины волны возбуждающего света, характеризу-

ется, как и следовало ожидать, красным падением. Оно начи-

нается в области

6750

А. Красное падение, по-видимому, свя-

зано

не с СЫ а

6800,

а с минорной компонентой СЫ а/

6950,

на-

личествующей лишь в ФС /,

тогда

как компоненты

6700

6800

присутствуют в обеих фотосинтетических системах и

дают

при-

мерно равные вклады в флуоресценцию. Действительно, при

деструкции Chi a

6950

при помощи ультразвука красное паде-

ние

исчезает.

Сложность флуоресценции СЫ a in

vivo

подтверждается ее

изменением

во время индукционного периода фотосинтеза. Если

клетки

хлореллы подвергаются сильному освещению после

длительного пребывания в темноте,

выход

Ф практически мгно-

венно

достигает некоторого уровня. Через несколько миллисе-

358

ГЛ.

ФОТОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ

кунд Ф повышается примерно втрое, потом слегка убывает, за-

тем достигает максимального уровня, пятикратного по сравне-

нию с начальным. После этого Ф

убывает

до стационарного

значения,

достигаемого через несколько минут. Анализ такого

поведения показывает, что за него

ответственна полоса флуоресценции

6850

А, относящаяся к ФС//. Слабая

флуоресценция ФС / остается практи-

чески постоянной во времени.

При

низких температурах полосы

флуоресценции сужаются и уменьша-

ется их перекрывание. Так, при 4 К

были обнаружены три длинноволно-

вые полосы испускания при

6890,

6980

7250А.

Охлаждение способствует

излучению из ловушек, энергетическая

глубина которых оценивается в

—

2 ksT при комнатной температуре,

5—8 k

T при 77 К и

100—150

НТ при

4 К. Полоса

6950

А, наблюдаемая

лишь при температурах ниже 140 К, возможно, обусловлена

эмиссией из ловушек в ФС//. Полосы

6850

6980

А возбуж-

даются главным образом при поглощении в ФС //, а полоса

7250

А —при поглощении в ФС / [1].

В растворах хлорофилла, равно как и

других

красителей,

интенсивность флуоресценции F пропорциональна интенсивно-

сти освещения /, т.е. квантовый

выход

флуоресценции не зави-

сит от /. In

vivo,

однако,

выход

F/I идет к насыщению с ро-

стом / (рис. 7.16) [1]. При насыщении фотосинтеза

выход

при-

Таблица

7.3

Некоторые

характеристики

двух

фракций

вещества

хлоропластов

[1]

'О 50

Рис.

7.16. Зависимость вы-

хода

флуоресценции (в ус-

вещения (в условных еди-

ницах).

Свойства

Легкая

фракция

Тяжелая

фракция

Отношение Chi a/Chl b

Относительное содержание цито-

хрома

Отношение каротинол/каротин

Относительное содержание Fe

Относительное содержание Мп

Способность восстанавливать НАДФ

Доля поляризации флуоресценции,

возбужденной поляризованным све-

том, %

Квантовый

выход

флуоресценции

Спектр испускания при 77 К

5,3

1,9

1-5

Высокая

5,4

Низкий

Больше с Я

7200

2,3

3,3

Низкая

2,7

Высокий

Больше

с X

6960

§ 7.5. ФЕРМЕНТАТИВНЫЕ

ПРОЦЕССЫ

ФОТОСИНТЕЗА 359

мерно удваивается. Причина этого пока не ясна [1]. Изучение

спектральных свойств хлоропластов позволило локализовать

фотосинтетические системы — фракционирование вещества

хлоропластов и исследование спектров поглощения и флуорес-

ценции

двух

фракций — легкой и тяжелой — показывает, что

легкая фракция содержит преимущественно ФС/, а тяжелая —

ФС//

(табл. 7.3).

Существенные аргументы в пользу функционирования

двух

пигментных систем

следуют

из изучения флуоресценции. Одна-

ко

мы не располагаем пока сколько-нибудь полной интерпрета-

цией

флуоресценции растительных клеток in

vivo.

7.5.

ФЕРМЕНТАТИВНЫЕ

ПРОЦЕССЫ

ФОТОСИНТЕЗА

Основными

продуктами

двух

первичных фотохимических ре-

акций

являются восстановленное промежуточное соединение

ХН и окисленное Z (см. рис. 7.1). Окислитель Z окисляетН

до О

, ХН восстанавливает СО

до

углевода.

Процессы эти про-

текают с участием ферментов. Ферментативная система, уча-

ствующая в выделении О

, содержит марганец. Установлено,

что ион марганца

участвует

в реакции, фотокатализируемой

ФС//

(см. табл. 7.3). Пара Мп

/Мп

характеризуется высо-

ким

окислительно-восстановительным потенциалом (около

1,5 В). Можно предположить, что

Мп

испытывает фотоокис-

ление до

Мп

во второй световой реакции, а затем

Мп

окис-

ляет

воду

в темновой реакции:

2Мп

+ Н

О —>

+ 2Мп

+ 2Н

для чего нужно более чем +0,75 эВ. Конечно, речь здесь идет

Мп как кофакторе фермента.

Таким

образом, предположительно Z есть фермент, содер-

жащий трехвалентный марганец. Предполагалось, что X это

НАДФ

(пара НАДФ

/НАДФ-Н имеет потенциал

—0,35

В).

В действительности имеется не менее чем два предшественни-

ка—

железосодержащий белок ферредоксин ФД и фермент

ферредоксин-НАДФ-редуктаза. Установлено, что освещенные

хлоропласты восстанавливают пигмент вплоть до —0,6 В [44].

Предположительно потенциал X близок к этой величине. Схема

возможных реакций [1] записывается в виде

X ФД ФД-НАДФ- НАДФ +

ХН

Восст.

ФД

редуктаза

НАДФ-Н

-0,6В -0,4В

-0,35В

Гораздо лучше известен химический путь, ведущий от СО

(вос-

станавливаемого такими веществами, как НАДФ-Н) к

углеводу.

360

ГЛ. 7. ФОТОБИОЛОГИЧЕСКИЕ

ПРОЦЕССЫ

Этот путь был установлен Кальвином и его сотрудниками,

широко

использовавшими радиоактивную метку —

углерод

[54—56].

Стехиометрическое уравнение, описывающее брутто-реак-

цию

фиксации двуокиси

углерода,

имеет вид

6 РДФ + 6 С0

+ 18 АТФ + 12 НАДФ-Н —•

—>6 РДФ + ГФ + 18 АДФ + 17 Ф„

Здесь РДФ — рибозо-1,5-дифосфат

О ОН ОН

12НАДФ.

(Р)ОСН

-LU-

н н

СН

О(Р),

ГФ

— гексозофосфат. РДФ является первичным акцептором

СО

Путь

углерода

в фотосинтезе — последовательности тем-

новых реакций — описывается так называемым циклом Каль-

вина—Бассама.

Этот цикл состоит из 13 стадий, катализируе-

мых соответствующими ферментами (см. [55]). Суммарная ре-

акция

написана выше. В сокращенных обозначениях

6С5 + 6Ci = 6C5 + Сб>

где индексы обозначают число атомов

углерода

в соединении.

4Н

из

фтохимичее/гой

реакции,

Восстановление

7^\

Трцозофосфат

2АТФ

Kapfio/гештршние

Ри/?улаз00ифосфат

Рийулозофосфат

АДФ+Ф

АТФ

Рис.

7.17. Упрощённая

схема

цикла превращений

углерода

по Кальвину.

Упрощенная схема цикла Кальвина показана на рис. 7.17, бо-

лее детализированная его схема — на рис. 7.18. Результирую-

щий

гексозофосфат гидролизуется с отщеплением фосфата. На

образование одной молекулы гексозы из 6 молекул СО

расхо-

дуется

энергия 18 молекул АТФ. Именно эти молекулы обра-

зуются при переносе электронов в процессе фотосинтеза —