Елинов Н.П. Основы биотехнологии

Подождите немного. Документ загружается.

к адгезии, но без реверсии в нормальные клетки по физиолого-би-

охимической сущности, то есть они все равно остаются опухоле-

выми.

Следует отметить, что в культуру давно введены клетки крови,

соединительной ткани и другие (см., например, раздел 11.4). Сое-

динительнотканные клетки — фибробласты (от лат. fibra — нить,

волокно; от греч. blastos — почка, росток, отпрыск) характеризу-

ются выраженной адгезивностью благодаря обильной продукции

ими фибронектина (см. рис. 152), поэтому их монослойные куль-

туры всегда удаются с определенным успехом.

искусственных условиях удается культивировать клетки эпи-

дермиса кожи, то есть диплоидные и "продвинутые" в дифферен-

циации клетки. Направленность такой работы, главным образом,

практическая и результаты ее бесценны для ожоговых клиник. По

сообщению немецких ученых (1988) за 6—7 недель из кусочка

кожи размером 2 см

можно получить "кожу" размером 1—2 м

Для этого у пациента, которому предстоит пересадка кожи, берут

кожный лоскут и помещают в раствор специальных ферментов,

эпидермис отделяется от подлежащих слоев кожи, его промывают

и переносят в питательную жидкость. Клетки делятся, а в присут-

ствии стимуляторов их рост еще более ускоряется.

11.3.

Получение инсектопатогенных вирусов в клеточных

культурах. Культуры клеток и тканей насекомых приобрели боль-

шое значение в различных биологических науках (эндокринология,

биохимия, вирусология и др.) ив биотехнологии. Это стало воз-

можным благодаря разработкам соответствующих сред, на кото-

рых хорошо развиваются указанные биообъекты, а на объектах, в

свою очередь, можно с успехом поддерживать рост соответствую-

щих патогенов, поражающих растения, животных и человека

(членистоногие паразиты и вирусы). Более того, на культурах

клеток и тканей насекомых можно обеспечить продукцию виру-

лентных инсектовирусов и рекомбинантных белков, используя

вирусы насекомых в качестве векторов. В этой связи велика роль

таких культур в контроле за чумой, используя биотехнологию.

Прогресс в получении клеточных линий насекомых был после-

довательно обеспечен трудами В. Трагера в конце 30-х годов

текущего столетия, С. Вьятта (1956), Т. Д. С. Грейса (1962). Грейс

модифицировал среду Вьятта, включавшую

аминокислоту, пять

солей, три сахара, три органические кислоты (рН=6,3—6,5), доба-

вив в нее 9 витаминов комплекса В. В результате ему удалось

изолировать 4 культуры, ставшие стабильными линиями клеток

555

насекомых.

последующие годы были получены самые различные

клеточные линии от насекомых, относящихся к различным поряд-

кам, но с преобладанием Diptera (мухи, комарьО

и,

Lepidoptera —

бабочки (от греч. di(s) — два, дважды, двух; pteron — крылышко;

lepis -— чешуя). Для них наиболее часто используют среды Дяс.

Митсухаси и К. Марамороша (среда ММ), Шилда и Санга (среда

МЗ),

Шнейдера; Эхальера и Оганесяна (среда

D-22),

IPL-41

и другие,

фирма Sigma (США) выпускает указанные среды в сухом виде.

Технология выращивания вирусов на культурах клеток насе-

комых принципиально'мало чем отличается от выращивания дру-

гих вирусов на клетках животных и Человека (см. раздел 11.1).

11.4.

Интерфероны. Интерферон открыт А; Айзексом и Дж.

Линдеманом в 1957 г. в клетках цыпленка, зараженных вирусом

гриппа. Это видоспецифическое белковое вещество, синтезируе-

мое лейкоцитами в ответ на воздействие интерфероногенов. При-

менительно к млекопитающим и, прежде всего, человеку под

названием "лейкоциты" объединяют все белые клетки крови (от

греч. leikos — белый, kytos

—-

ячейка, клетка) — сегментоядерные

лейкоциты (нейтрофильные, эозинофильные, базофильные), или

микрофаги, лимфоциты (Т и В) и моноциты. Все эти клетки

являются ядерными и участвуют в обеспечении постоянства внут-

ренней среды макроорганизма (гомеостаза), включая неспецифи-

ческую и специфическую защиту, или иммунитет. Однако сегмен-

тоядерные лейкоциты относят к разряду полинуклеарных, тогда

как моноциты — к разряду мононуклеарных. Мононуклеарными

фагоцитами (наравне с моноцитами) являются также гистиоциты,

или'макрофаги. К ним относят макрофаги соединительной ткани,

звездчатые клетки Купфера в печени, альвеолярные макрофаги в

легких, -свободные- й фиксированные т*акрофаги в лимфоузлах и

селезенке, гистиоциты в коже, остеокласты в костной ткани,

фиксированные макрофаги в костном мозге, макрофаги в серо-

зных полостях (плевральной и брюшной); макрофаги в нервной

ткани (клетки микроглии).

С учетом топологии и/или функции макрофаги подразделяют

еще на резидентные, эксудативные (макрофаги воспалительного

эксудата), активированные, индуцированные.

Моноциты, макрофаги и их предшественники объединены в

так называемую систему мононуклеарных фагоцитов (СМФ). Ге-

неалогия (от греч. genea — рождение, происхождение, logos —

обсуждение) клеток крови изучена достаточно глубоко.

Лейкоциты и другие клетки млекопитающих, в частности, при

556

заражении вирусами продуцируют не один интерферон, а больше,

объединяемых в семейство интерферонов, ингибирующих продук-

тивный цикл репликации вирусов.

Вот

почему

они

являются

оружием первой линии защиты против вирусных инфекции.

Однако

обычных (неиндуцированных) клетках интерфероны

не выявляются. Некоторые характеристики отдельных интерфе-

ронов приведены

таблице 56.

Таблица 56 Некоторые характеристики интерферонов человека

Тип

интер-

ферона

Характеристики

клетки

проду-

центы

лейко-

циты

пери-

фери-

ческой

крови

фиб-

робла-

сты

лимфо-

циты

индук-

тор

вирус-

ная

индук-

ция,

двух-

нитевая

РНК

—"—

митоге-

ны

(для

несен-

сибили-

зиро

ван-

ных

ЛИ№'

фоци-

тов),

Шци-

фичес

АГ

(сенси-

билизи-

рован-

ные лим-

фоциты}

число

генов

интер-

фе-

рона

15?»

локали-

зация

«хро-

мосо-

мах

-,-9

9,2,5

нали-

чие

нитро-

нов в

генах

<ЧВь^

стабиль-

ность

при

рНг

да

нет

'актив-

ность в

присут-

ствии

ДОС

-да

да

нет

длина

сигналь-

ной

после-

дова-

телычо-

стти"

(ч.амк-т)

ч.

амк-т

в пер-

вичной

моле-

куле

166

в окон-

чатель-

ной

моле-

куле

143

145

146

ММ,

кДа

Примечание: ДДС

—

натрия додецилсульфат;

ч.

амк-т

молекулярная масса

килодальтонах; АГ -

число аминокислот,

ММ

- антигены.

Как следует из таблицы размеры молекул интерферонов близки

по числу аминокислот

молекулярной массе, хотя

по

другим

признакам они различны; интерфероны

являются гликопро-

теинами, тогда как интерферон

— протеином.

557

Интерфероны — клеточные белки и поэтому они видоспеци-

фичны, то есть каждому виду животного свойственен свой интер-

ферон, но не являются вирусоспецифическими. При смешанной

вирусной инфекции один вирус подавляет другой за счет интер-

фероногенности первого — феномен вирусной интефе-

р е н ц и и. Иногда эта видоспецифичность очень узкая, например,

для курицы, утки, мыщи и крысы, но не перекрестно в группах

птиц и грызунов или между группами. Однако есть исключения —

человеческий интерферон защищает клетки крупного рогатого

скота лучше, чем коровий интерферон.

Человеческие интерфероны а и Р продуцируются преимуще-

ственно лейкоцитами, В-димфобластами и соединительнотканны-

ми клетками мезенхимного происхождения — фибробластами в

ответ на вирусную инфекцию. Интерферон у прежде называли

иммунным, или тип 2; он образуется несенсибилизированными

лимфоидными клетками Т-лимфобластами в ответ на митогены, и

сенсибилизированными лимфоцитами при стимуляции специфи-

ческими антигенами (таблица 57).

Таблица 57. Виды индуцируемых интерферонов

Интерфероны

лейкоцитарный-а

лимфобластный-а

фибробластный-р

имунный-у

Система

индуктор

вирус

—"—

митоген

специфический

антиген

клетки-продуценты

лейкоциты периферической

крови

В-лимфобласты

фибробласты

лейкоциты периферической

крови или Т-лимфобласты

лимфоциты

Установлено, что индукторами интерферонов могут

быть:

инак-

тивированные температурой или УФЛ вирусы гриппа, рео-, рота-

и другие вирусы; двухнитевые РНК (например, реовирусная);

некоторые полианионные вещества (бактериальные эндотоксины,

поликарбоновые кислоты, сополимеры пирана); синтетические

двухнитевые полирибонуклеотиды, например, полиИ: полиЦ —

558

можно достичь супериндукции интерферона, если обрабатывать

клетки полиИ: полиЦ вместе с циклогексимидом (ингибитором

синтеза белка), а спустя 5 часов — актиномицином Д. Механизмы

индукции интерферона до конца еще не изучены и трудно объяс-

нить почему, например, двухнитевые РНК стимулируют образова-

ние интерферона, а двухнитевая ДНК не обладает аналогичным

действием.

На практике интерферон-сс выделяют из лейкоцитов при низ-

коскоростном центрифугировании свежевыделенной крови чело-

века. Лейкоциты переносят в культуральную среду, содержащую

либо сыворотку крови человека или казеин молока, в среду вносят

вирус — интерфероноген (вирус Сендай или вирус ньюкаслской

болезни), выдерживают в течение ночи, после чего лейкоциты

отделяют центрифугированием, вирус — интерфероноген инакти-

вируют любым из приемлемых способов. Супернатант (от лат.

supematans — плавающий на поверхности), или надосадок пред-

ставляет собой нативный интерферон.

Его

лиофильно высушивают

и выпускают в ампулах. Это

—?•

пористый, серовато-коричневый

порошок, легко растворимый в

воде.

Растворенный препарат имеет

розовато-красноватый цвет и слегка опалесцирует. Из нативного

интерферона можно получить концентрированный интерферон

путем очистки колоночной хроматографией на сефадексах. Пол-

ученный препарат после высушивания имеет вид пористого по-

рошка серовато-белого цвета, хорошо растворимый в воде. Тот и

другой интерфероны должны быть стерильными.

Активность препаратов определяют титрованием на первичных

культурах клеток, например, кожно-мышечной ткани эмбриона

человека с вирусом везикулярного стоматита. Противовирусная

активность (так называемая удельная активность) нативного ин-

терферона должна быть не менее 32 единиц, концентрированного

— 100 единиц. Для очистки интерферона можно прибегнуть и к

высоко эффективной жидкостной хроматографии.

Интерферон Р получают из фибробластов, выращенных в

монослойной культуре, индуцированной полиИ: полиЦ в присут-

ствии циклогексимида и актиномицина Д. Обычно интерфероны

продуцируются в малых количествах (около

мг на

л тканевой

культуральной жидкости) и, к тому же, после 48—72 часов клет-

ки-продуценты отмирают. Вот почему производство лейкоцитар-

ных интерферонов относят к разряду дорогостоящих и экономи-

чески

—

мало выгодных. Поэтому успешно завершившиеся работы

559

по генно-инженерному интерферону помогли решить и эти про-

блемы.

В начале 80-х годов XX в. британская фирма The Wellcome

Foundation LTD передала на клинические испытания природную

смесь а-интерферонов, полученную в глубинной суспензионной

культуре вирусоиндуцированных человеческих лимфобластов.

Препарат был назван "велфероном". Выпускается в виде стериль-

ной, прозрачной, бесцветной жидкости по 1 мл (3 мегаединицы-

МЕ).

К 1988 году уже три фирмы выпускали ос-интерфероны:

1) выше названный велферон — фирма Wellcome Found.,

2) интрон А — фирма Kirby-Warrick,

3) роферон А — фирма Roche.

Интрон А и роферон А являются генно-инженерными препа-

ратами, содержащими лишь один субтип оинтерферона и разли-

чающиеся по одной аминокислоте. Так, роферон А обозначается

как интерферон а2а; он содержит в полипептидной цепи лизин в

позиции

23.

Интрон А

это ос2Ь-интерферон, содержащий аргинин

вместо лизина. Как оказалось, роферон А индуцирует антителооб-

разование примерно у 25% больных, у которых благодаря этому

нейтрализуется введенный интерферон. Технологическая схема

получения генно-инженерных интерферонов (как одна из возмож-

ных) принципиально сводится к следующему:

индукция синтеза и выделение интерфероновой мРНК из

клеток,

получение кДНК, комплементарной интерфероновой мРНК

из лейкоцитов,

встраивание кДНК в плазмиду,

введение реконструированной плазмиды в клетки Е. coli,

размножение бактерий, содержащих реконструированную

плазмиду, в культуральной среде,

6. сепарирование клеток Е. coli,

дезинтеграция и экстракция клеток Е. coli,

8. осаждение (например, полиэтиленамином) с последующим

центрифугированием,

9. высаливание интерферона из супернатанта аммония сульфа-

том,

10.

диализ осадка интерферона,

11.

растворение интерферона, пропускание раствора через

колонку

иммуносорбентом (пришитыми моноклональными анти-

телами, рис. 159).

560

12.

элюция интерферона с последующей хроматографией на

целлюлозном катионообменнике.

Рис. 159. Схема очистки

брекомбинантного интерферо-

Eia с помощью моноклональ-

ных антител (МкАТ): 1 - диа-

лизат с интерфероном и дру-

гими бактериальными белка-

ми,

2 - интерферон, 3 - балла-

i стные белки, 4 - МкАТ, 5 -

интерферон, связывавший с

МкАТ, 6 - слабая кислота.

Из указанных 12 стадий только 8 последних фактически реа-

лизуются в производственных условиях, тогда как первые 4 стадии

выполняются в лабораторных условиях. Кстати сказать, эти 4

стадии наиболее трудные и сложные (рис. 160).

Рис. 160. Этапы клониро-

р BR322 вания гена интерферона:

мРНК - интерфероновая

мРНК из индуцированных

клеток, кДНК1 - комплемен-

ДНК

тарная ДНК однонитевая,

кДНК2 - комплементарная

ДНК двухнитевая, 3 - обрат-

ная транскриптаза, 4

синтез

двуспиральной кДНК, 5

кон-

цевая трансфераза, 6 - ре-

стрикция,

7 -

кДНК с липкими

концами, 8 - отжиг, 9 - интер-

фероновая ДНК, 10 - включе-

ние в клетки E.coli плазмиды-

химеры, КО - клонирование

и отбор колоний, содержа-

щих клетки с заданными

плазмидами, БРП - "библио-

тека" рекомбинантых плаз-

мид.

Бактерии с генами интерферона человека продуцируют специ-

фический белок в количестве 200—250 мкг/л бактериальной сус-

пензии. Кроме Е. coli удается получать человеческий интерферон

с помощью Вас. subtilis, способную секретировать синтезируемые

белки в окружающую среду (у Е. coli они накапливаются в

561

периплазматическом пространстве), а также с помощью

Saccharomyces cerevisiae, растущих на средах с более дешевыми

субстратами, на них не действуют фаги, они крупнее бактерий и

легче сепарируются, в их клетках осуществляется процессинг

преинтерферонов. Применяют также культуры бактерий из родов

Methylomonas, Pseudomonas, Salmonella. Все названные микроор-

ганизмы конститутивно (не адаптивно) образуют интерфероны, не

отличающиеся от природных. Против всех классов интерферонов

получены моноклональные антитела, с помощью которых проводят

быструю и высококачественную очистку продуктов, применяя

иммуноафинную хроматографию.

В молекуле интерферона имеются два консервативных домена

— один локализуется на NH 2-конце, а другой

—

на СООН-конце.

Первый, очевидно, помогает связыванию с рецептором на повер-

хности клетки, а второй

—

моделирует это связывание и опосредует

другие биологические функции.

Интерфероны

ос,

(3, и у иммунологически различны и, напри-

мер,

сс-антисыворотка не инактивирует гетерологичные интерфе-

роны.

Интерфероны обладают двумя типами биологической активно-

сти — противовирусной и противоклеточной. В отношении виру-

сов действие трех интерферонов сравнимое по эффективности, но

в отношении клеток более активен интерферон у, причем против

опухолевых клеток он активнее, нежели против нормальных кле-

ток.

На практике интерфероны применяют при вирусных инфек-

•циях, ревматоидном артрите (интерферону), при иммунопатологии

и в онкологии.

11.5.

Получение и использование гомо-, гетеро- и синкариоти-

ческих гибридов. Материалы этого раздела базируются на данных

по геномной инженерии и, в частности, на клеточной инженерии,

или соматической гибридизации.

Понятия о гомо- и гетерокарионах чаще относили к дейтеро-

мицетам и некоторым другим грибам, которым присущ так назы-

ваемый парасексуальный процесс размножения. При

этом наблюдается слияние (копуляция) нитей одного и того же или

562

различных типов спаривания, происходит объединение в одной

клетке содержимого протопластов, включая ядра. Так возникают

гомокарионы и гетерокарионы, функционирующие самостоятель-

но,

не сливаясь. Образующиеся в результате деления "дочерние"

ядра распределяются по мицелию. Время от времени такие ядра

сливаются, затем делятся при помощи меойза. Слившиеся ядра

называют синкарионами.

Владея техникой клеточно-инженерного эксперимента, можно

искусственно получать гомо-, гетеро- и синкариотические особи.

Это нашло воплощение, например, в иммунобиотехнологии. Им-

мунобиотехнология является составной частью биотехнологии и

связана с получением и производством иммунопрепаратов, обла-

дающих свойствами антигенов или антител. Теоретической базой

ее является учение об иммунитете, практической базой — иммун-

ная система макроорганизма.

11.5.1.

Основные представления об иммунной системе. Иммун-

ная система — это система органов и клеток, реагирующая на

генетически чужеродную информацию и участвующая в защите

макроорганизма от такой информации. Иммунная система во

взаимодействии с другими системами (нервной, эндокринной,

сердечно-сосудистой, пищеварительной и др.) обеспечивает защи-

ту организма от внедрения и развития в нем патогенных микробов

(вирусов, бактерий, грибов, протозоа), а также от воздействия

антигенов разной другой природы и специфичности (тканевые

трансплантаты; растительные и животные

яды;

аутоантигены, опу-

холи).

Она выполняет функцию иммунологического надзора во

благо поддержания постоянства внутренней среды (гомеостаза)

макроорганизма, обеспечивая

его

целостность и индивидуальность.

Иммунная система состоит из трех главных компонентов:

клеточного, молекулярного и генетического. Первый из них вклю-

•

чает макрофаги, Т- и В-лимфоциты, второй — пять классов иммун-

ных глобулинов (Ig): IgM, IgG, IgA, IgE, IgD, третий — множество

генов (таблица 58).

563

Таблица 58. Генетический компонент иммунной системы

Название

Иммуноглобулиновые гены

Гены

главного

комп-

лекса

гито-

совме-

стимо-

сти

(МНС),

или

HLA

гены

области I (HLA-D)

1г-гены

гены, кодирующие

1а-антигены

гены иммуно-

медиаторо»

другие области

Гены дифференциации

клеточных антигенов и

рецепторов

Функция »

Определяют» структуру вариабельных (v) и

константных (С) областей, Н (ц, у, а, е, 5).- и L

(к, \ - цепей иммуноглобулиновых генов на В-

лимфоцитах; v - область также образует часть

рецепторов для антигенов на Т-лимфоцитах»

Ответственны за взаимодействия макрофагов,

Т- и В-лимфоцитов (CI; от англ. cellinteraction)

Определяют индивидуальную чувствительность

организма к заболеванию благодаря

регулированию силы ответа' на

соответствующие антигены (от англ. Irhmune

response)

Ответственны глайным образом за смешанную

реактивность лимфоцитов и за реакции типа

"трансплантат против хозяина" (от англ. Immune

antigen) •

вовлечены в синтез таких иммуномедиаторов,

как цитокииы (лимфокины, включая

интерлейкины • (IL); ^"Интерферон,

нёйротрансмиттерыЛ фактор задержки

миграции макрофагов (MIF) и др.

определяющие: большой и малый

трансплантационные антигены, связанные с

отторжением трансплантантов и опухолей;

взаимодействия с патогенными вирусами;

синтез компонент^в^сйстемы комплемента

определяющие лимфоцитарные антигены

(Lyt-1,

2,3 для различных субпопуляций Т-лимфоцитов;

Lyb-3,

5 и др., дифференциально

экспрессирующиеся на определенных В-

лимфоцитах); Fc-рецепторы (FcRy - на В-

лимфоцитах, макрофагах и Т-супрессорах; FcRji

на макрофагах и Т-хелперах), рецепторы

комплемента на субпопуляциях В- и

Т-клеток

Примечание:

Н1А — от англ. Human Leucocyte Antigen. МНС состоит из ts генов,

расположенных в 6-й паре хромосом.

Иммунная система — одна из самых гетерогенных и сложных

систем организма. У человека она включает примерно 2

•

лимфоцитов и 10

молекул антител, обладающих с одной стороны

564