Калинина О.С., Паникар И.И., Скибицкий В.Г. Ветеринарная вирусология

Подождите немного. Документ загружается.

Лабораторна діагностика вірусних хвороб

345

4. Реакція вважається позитивною, якщо в агарі між лунками з

дослідними вірусовмісними суспензіями (дослідними сироватками) і

специфічною сироваткою (специфічним вірусним антигеном) утво-

рюються білі лінії преципітації. При ретроспективній діагностиці

за титр антитіл приймають найвище розведення сироватки, яке

зумовлює утворення ліній преципітації.

5. Одночасно ставлять контролі:

y специфічна сироватка + специфічний антиген;

y специфічна сироватка + нормальний антиген (при ідентифіка-

ції вірусу);

y нормальна сироватка + специфічний антиген (при виявленні

антитіл).

Рис. 95. Схема РДП для виявлення антитіл

Рис. 96. Схема РДП для титрування (а) та ідентифікації (б) вірусу:

— С

— дослідні сироватки; А

— А

— дослідні антигени; СС — специфічна

сироватка; СН — нормальна сироватка; АС — специфічний антиген; АН — норма-

льний антиген; 1 : 2 … 1 : 64 — розведення дослідної сироватки

Розділ 11

346

Постановка РРІД для виявлення антитіл:

1. У розплавлений і охолоджений до +50…+55 °С 2%-й агар до-

дають специфічний вірусний антиген (у концентрації 0,2 мг/см

перемішують і по 4 см

суміші наносять на предметні скельця.

2. Після застигання гелю за допомогою металевих матриць виго-

товляють лунки, куди додають дослідні сироватки (цільні або у дво-

разових розведеннях).

3. Предметні скельця поміщають у вологу камеру і витримують

16 – 18 год за температури +18…+22 або +37 °С.

4. Реакція вважається позитивною, якщо біля лунок утворюється

кільце преципітації у вигляді опалесціюючої зони, діаметр якої пря-

мо пропорційний концентрації антитіл. При постановці реакції з різ-

ними розведеннями сироватки за титр антитіл приймають най-

вище її розведення, яке зумовлює утворення кільця преципітації.

5. Одночасно ставлять контролі:

y специфічна сироватка + специфічний антиген;

y нормальна сироватка + специфічний антиген.

РРІД використовується також для ідентифікації вірусу. Для

цього в агар вносять специфічну сироватку (1 – 5 %), а в лунки —

дослідні вірусовмісні суспензії. Збудник вважається ідентифікова-

ним при утворенні кільця преципітації, діаметр якого корелює з

титром дослідного антигену.

Перевагою РДП є проста техніка постановки, швидкість отриман-

ня результатів. Недолік — недостатня чутливість: у реакції виявля-

ють антигени або антитіла за умови їхньої високої концентрації.

ЗУСТРІЧНИЙ ІМУНОЕЛЕКТРОФОРЕЗ (ЗІЕФ)

Зустрічний імуноелектрофорез (ЗІЕФ)

ґрунтується на по-

єднанні імунодифузії в гелі (рідше — на ацетатоцелюлозних мем-

бранах) з електрофорезом: антигени й антитіла переміщуються в

електричному полі назустріч один одному і при взаємодії утворюють

лінії преципітації. На відміну від РДП і РРІД, у ЗІЕФ дифузія іму-

нореагентів відбувається не вільно у всіх радіальних напрямках, а

назустріч один одному під

впливом електричного поля.

При цьому негативно заря-

джені в лужному середовищі

вірусні антигени рухаються

до аноду, а нейтральні ан-

титіла — до катоду внаслі-

док електроендоосмосу (рис.

97). ЗІЕФ використовується

для діагностики багатьох

вірусних інфекцій (хвороба

Рис. 97. Схема ЗІЕФ

(Т.В. Перадзе, П. Халонен, 1985)

Лабораторна діагностика вірусних хвороб

Ауєскі, ящур, чума ВРХ, чума свиней, трансмісивний гастроентерит

свиней та ін.).

Компоненти ЗІЕФ:

1) дослідні вірусовмісні суспензії або сироватки;

2) специфічна і нормальна сироватки;

3) специфічний і нормальний вірусні антигени;

4) 1%-й агар або агароза;

5) вероналовий буферний розчин;

6) 0,9%-й розчин NaCl або ФБР.

Постановка ЗІЕФ:

1. На скляні пластинки наносять розплавлений гель товщиною

1,2 – 1,7 мм. Після застигання з допомогою металевих матриць ви-

готовляють лунки.

2. У лунки біля катода вносять дослідні вірусовмісні суспензії (або

відомі вірусні антигени), а в лунки біля анода — специфічні сироватки

(або дослідні сироватки: цільні чи у дворазових розведеннях).

3. Пластинки поміщають в апарат для ЗІЕФ. Електрофорез про-

водять 30 – 60 хв частіше з використанням вероналового буферного

розчину (рН 8,6) при відповідному робочому режимі, який відпра-

цьовують у попередніх дослідженнях. У більшості випадків оптима-

льна напруга струму становить 120 – 150 В, сила струму — 20 –

30 мА, температура — кімнатна.

4. Проводять попередній облік результатів. Потім пластинки

промивають у кількох змінах 0,9%-го розчину NaCl або в 0,15 М

ФБР упродовж доби, фарбують 0,1%-м розчином тиазинового черво-

ного й остаточно враховують результати реакції (в прохідному світлі

на темному фоні).

5. Реакція вважається позитивною, якщо в гелевому середовищі

між дослідними антигенами (дослідними сироватками) і специфіч-

ними сироватками (специфічними антигенами) утворюються лінії

преципітації. При ретроспективній діагностиці за титр антитіл

приймають найвище розведення сироватки, яке зумовлює утворен-

ня ліній преципітацій.

6. Одночасно ставлять контролі:

y специфічна сироватка + специфічний антиген;

y специфічний антиген + нормальна сироватка (при виявлення

антитіл);

y специфічна сироватка + ФБР (при ідентифікації вірусу).

Існує багато різних модифікацій

ЗІЕФ, інтерес становить, зокрема,

подвійний ЗІЕФ. Цей метод застосо-

вують при дослідженні матеріалу, в

якому можуть знаходитися одночас-

но як вірусні антигени, так і антиті-

ла (наприклад, слиз, цільна кров). У

такому разі в лунки біля катоду

Рис. 98. Схема подвійного ЗІЕФ

(Т.В. Перадзе, П. Халонен, 1985)

Розділ 11

348

вносять специфічний антиген, в лунки біля аноду — специфічну

сироватку, а між ними — дослідний матеріал. Вірусні антигени

утворять лінії преципітації між середньою й анодною лунками, а

антитіла — між середньою та катодною лунками (рис. 98).

ЗІЕФ характеризується високою специфічністю, простою технікою

постановки, стабільністю отримуваних результатів. Проте за чутливі-

стю цей метод дещо поступається іншим серологічним реакціям.

РЕАКЦІЯ ІМУНОФЛУОРЕСЦЕНЦІЇ (РІФ)

Реакція імунофлуоресценції (РІФ) (

син.: метод флуорес-

ціюючих антитіл — МФА)

ґрунтується на взаємодії антигенів із

міченими флуорохромом антитілами, внаслідок чого виникає сві-

тіння при люмінесцентній мікроскопії. Серед флуорохромів, запро-

понованих для мічення антитіл, найчастіше використовують флуо-

ресцеїнізотіоціанат (ФІТЦ), який зумовлює люмінесценцію зеле-

ного кольору. Для люмінесцентної мікроскопії використовують мік-

роскопи «Люмам И-1», «МЛ-2», «МЛД» та ін. із ртутно-кварцовою

лампою ДРШ-250, збуджувальними фільтрами ФС-1-2, СС-15-2,

БС-8-2 і запірними фільтрами № 1 або № 2. РІФ застосовується для

Рис. 99. Схема РІФ (М.І.Троценко та ін., 1989):

а — прямий метод: 1 — антиген; 2 — флуоресціююче тіло; 3 — флуоресціюючий

комплекс антиген – антитіло; б — непрямий метод: 1 — антиген; 2 — антитіло; 3

—

комплекс антиген – антитіло; 4 — флуоресціююче антивидове антитіло; 5 — флуо-

ресціюючий комплекс антиген – антитіло – антивидове антитіло; в — метод анти-

комплементарної імунофлуоресценції; 1 — антиген; 2 — суміш комплементу та

антитіл; 3 — комплекс антиген – антитіло – комплемент; 4 — флуоресціююче анти-

комплементарне антитіло; 5 — флуоресціюючий комплекс антиген – антитіло

–

комплемент – антикомплементарне антитіло

Лабораторна діагностика вірусних хвороб

349

діагностики багатьох вірусних хвороб (сказу, хвороби Ауєскі,

парагрипу-3 ВРХ, вірусної діареї ВРХ та ін.).

РІФ ставиться двома методами: прямим і непрямим (рис. 99).

Прямий метод РІФ

Компоненти реакції:

1) дослідний вірус (мазки-відбитки або гістозрізи з патологічного

матеріалу хворих тварин, препарати із зараженої культури клітин);

2) флуоресціюючі специфічна і нормальна сироватки;

3) немічені специфічна і нормальна сироватки;

4) препарати з органів здорових тварин або незараженої культу-

ри клітин.

Постановка реакції:

1. Препарати фіксують 10 – 15 хв у охолодженому ацетоні

(–10…–15 ºС), висушують на повітрі.

2. На препарати наносять флуоресціюючу специфічну сироватку,

витримують 30 хв у вологій камері за кімнатної температури або у

термостаті при +37 ºС (залежно від виду вірусу).

Рис. 100. Дифузне світіння антигену вірусу

діареї ВРХ у препаратах із легень (а), нирок

(б), слизових оболонок трахеї (в) і тонких

кишок (г) заражених телят

(О.С. Калініна, 1983)

Розділ 11

350

3. Препарати відмивають 0,01 М ФБР (рН = 7,2…7,4) тричі по

10 хв, споліскують дистильованою водою, висушують на повітрі й

досліджують у люмінесцентному мікроскопі, застосовуючи нелюмі-

нуючу олію для імерсії.

4. Результати реакції оцінюють у плюсах за інтенсивністю і спе-

цифічністю флуоресценції дослідного об’єкта при чіткій морфології

клітин:

++++ — яскраве світіння смарагдово-зеленого кольору;

+++ — яскраве світіння зеленого кольору;

++ — слабке світіння жовто-зеленого кольору;

+ — дуже слабке світіння невизначеного кольору;

– — відсутність флуоресценції.

5. Реакція вважається позитивною, якщо в препараті в трьох по-

лях зору виявляється не менше як по 3 – 5 уражених вірусом клітин,

що флуоресціюють яскраво-зеленим кольором на 3 – 4 плюси (в ре-

зультаті утворення ком-

плексів антиген – анти-

тіло). Флуоресценція бу-

ває дифузною та грану-

лярною залежно від виду

вірусу і стадії його нагро-

мадження в клітині (рис.

100, 101, 102, 103).

6. Одночасно ставлять

контролі:

y незаражені клітини,

оброблені флуоресціюю-

чою специфічною сиро-

ваткою;

y заражені клітини,

оброблені флуоресціюю-

чою нормальною сирова-

ткою;

y заражені клітини,

оброблені спочатку немі-

ченою специфічною си-

роваткою, а потім —

флуоресціюючою специ-

фічною сироваткою;

y заражені клітини,

оброблені спочатку немі-

ченою нормальною сиро-

ваткою, а потім — флуо-

ресціюючою специфічною

сироваткою.

Рис. 101. Гранулярне світіння антигену віру-

су сказу в перещеплюваній культурі клітин

ВНК-21 (а, б, в, г) і мозковій тканині (д, е)

заражених мишей (М.І. Троценко та ін., 1989)

Лабораторна діагностика вірусних хвороб

351

Непрямий метод РІФ (РНІФ)

Компоненти реакції:

1) дослідний вірус (препарати з

патологічного матеріалу хворих тва-

рин або зараженої культури клітин);

2) специфічна і нормальна сироватки;

3) флуоресціююча антивидова сироватка

;

4) препарати з органів здорових тварин або незараженої культу-

ри клітин.

Постановка реакції:

1. На фіксовані в ацетоні препарати наносять специфічну сиро-

ватку, витримують 30 хв у вологій камері за температури +18…+22 ºС

або +37 ºС, потім відмивають (так само, як при прямому методі РІФ).

2. На препарати наносять флуоресціюючу антивидову сироватку,

витримують 30 хв у вологій камері за температури +18…+22 ºС або

+37 ºС, потім відмивають, висушують на повітрі й досліджують у

люмінесцентному мікроскопі.

3. При наявності вірусного антигену виникає флуоресценція за-

ражених клітин (у результаті утворення складних комплексів анти-

ген – антитіло – антивидове антитіло).

4. Одночасно ставлять контролі:

y незаражені клітини, оброблені флуоресціюючою антивидовою

сироваткою;

y заражені клітини, оброблені флуоресціюючою антивидовою

сироваткою;

y заражені клітини, оброблені спочатку нормальною сироваткою,

а потім флуоресціюючою антивидовою сироваткою;

Антивидові (антиглобулінові) сироватки одержують шляхом гіперімунізації тва-

рин певного виду глобулінами, виділеними із сироваток інших видів тварин, які

слугують продуцентами противірусних сироваток. Наприклад, антиглобулінові сиро-

ватки кроля отримують на вівцях або козах.

Рис. 102. Гранулярне світіння антигену

аденовірусу птиці в гепатоцитах курей

(І.І. Панікар, 1990)

Рис. 103. Дифузне світіння ан-

тигену ротавірусу ВРХ у пере-

щеплюваній культурі клітин

MDBK (В.Г. Скибіцький, 1997)

Розділ 11

352

y заражені клітини, оброблені спочатку специфічною сироваткою

(після попередньої адсорбції антитіл гомологічним антигеном), а

потім — флуоресціюючою антивидовою сироваткою.

Непрямий метод РІФ має переваги. Він потребує лише однієї

флуоресціюючої сироватки — антивидової, з допомогою якої можна

виявити антигени різних вірусів (за умови, що специфічні сироват-

ки до цих вірусів одержані шляхом імунізації тварин одного виду).

Крім того, РНІФ використовується не тільки для ідентифікації віру-

су, але й для виявлення антитіл. Для цього на фіксовані препара-

ти з культури клітин, зараженої відомим вірусом, наносять спочат-

ку дворазові розведення дослідної сироватки (від 1 : 10 до 1 : 1280), а

після контакту — флуоресціюючу антивидову сироватку. Специфіч-

ні антитіла в дослідних сироватках виявляють за яскраво-зеленим

світінням вірусного антигену в заражених клітинах. За титр ан-

титіл приймають найвище розведення сироватки, при якому спо-

стерігається чітка флуоресценція гомологічного антигену.

Розроблена модифікація РНІФ — метод антикомплементарної

імунофлуоресценції (див. рис. 99). Він полягає в обробці фіксованих

препаратів спочатку специфічною сироваткою та комплементом, а

потім — міченою антикомплементарною сироваткою. При наявності

вірусного антигену виникає флуоресценція заражених клітин у ре-

зультаті утворення складних комплексів антиген – антитіло – ком-

племент – антикомплементарне антитіло. Цей метод використовують

як для ідентифікації вірусу, так і для виявлення антитіл.

РІФ характеризується високою чутливістю, специфічністю і шви-

дким одержанням результатів. Особливо цінна ця реакція для іден-

тифікації тих вірусів, які не мають цитопатогенних, гемаглютину-

вальних і гемадсорбівних властивостей. РІФ дає можливість вивчи-

ти процеси взаємодії вірусів із клітинами, дослідити динаміку на-

громадження вірусних антигенів у клітинах, антигенні зв’язки ві-

русів, а також патогенез вірусних інфекцій. Особливо важливе зна-

чення цього методу при дослідженні асоційованих і хронічних інфе-

кцій. Недолік РІФ — випадки неспецифічної флуоресценції, яка

може бути спричинена наявністю в специфічних сироватках норма-

льних антитіл або антитіл до гетерогенних тканинних білків, фік-

сацією мічених антитіл на лейкоцитах, кров’яних пластинках, воло-

кнах тощо.

ІМУНОФЕРМЕНТНИЙ АНАЛІЗ (ІАФ)

Імуноферментний аналіз (ІФА)

ґрунтується на взаємодії ан-

тигенів із міченими ферментом антитілами. Цей метод характери-

зується високою специфічністю і чутливістю, яка в сотні разів пере-

вищує чутливість інших серологічних реакцій. ІФА використо-

вується для діагностики багатьох вірусних хвороб (інфекційний ри-

Лабораторна діагностика вірусних хвороб

353

нотрахеїт ВРХ, чума ВРХ, сказ, ринопневмонія коней, хвороба Ма-

река, ньюкаслська хвороба та ін.).

Існують два варіанти ІФА: 1) гістохімічний варіант, або імуно-

пероксидазна реакція; 2) методи твердофазного ІФА.

Імунопероксидазна реакція

Цей метод за суттю аналогічний РІФ. Він базується на викорис-

танні антитіл, мічених ферментом пероксидазою хрону (імуноперо-

ксидазний кон’югат). Утворення комплексу антиген – антитіло ви-

являють за допомогою бензидинового субстрату (диамінобензидин-

тетрахлорид). Субстрат під дією ферменту розкладається, утворюю-

чи кольоровий продукт ферментативної реакції, видимий у світ-

ловому мікроскопі (спочатку блакитного кольору, який швидко пе-

реходить у коричневий).

Реакцію ставлять прямим і непрямим методами (рис. 104, 105).

Прямий імунопероксидазний метод

Компоненти реакції:

1) дослідний вірус (мазки-відбитки або гістозрізи з патологічного

матеріалу хворих тварин, препарати з інфікованої культури клітин);

Рис 104. Схема прямого імунопероксидазного методу ІФА

(В.М. Сюрін та ін., 1986):

1 — антиген; 2 — мічене антитіло (імунопероксидазний кон’югат); 3 — комплекс

антиген – антитіло – фермент; 4 — бензидиновий субстрат; 5 — комплекс антиген

–

антитіло – фермент, який виявляють за допомогою субстрату

1 2 3 4 5

Рис 105. Схема непрямого імунопероксидазного методу ІФА

(В.М. Сюрін та ін., 1986):

1 — антиген; 2 — антитіло; 3 — комплекс антиген – антитіло; 4 — антивидове анти-

тіло (антивидовий імунопероксидазний кон’югат); 5 — комплекс антиген – антиті-

ло – антивидове антитіло – фермент; 6 — бензидиновий субстрат; 7 — комплекс ан-

тиген – антитіло – антивидове антитіло – фермент, який виявляють за допомогою

субстрату

1 2 3

4 5 6 7

Розділ 11

354

2) імунопероксидазний кон’югат;

3) бензидиновий субстрат;

4) препарати з культури клітин, зараженої відомим вірусом;

5) препарати з органів здорових тварин або незараженої культу-

ри клітин:

6) 0,9%-й розчин NaCl

Постановка реакції:

1. Препарати фіксують 10 хв у охолодженому ацетоні (–10…–20

С),

висушують на повітрі.

2. На препарати наносять імунопероксидазний кон’югат, витри-

мують 1 – 2 год (для гістозрізів — 6 год) у вологій камері при +37 °С,

промивають 0,9%-м розчином NaCl 15 хв, споліскують дистильова-

ною водою, висушують на повітрі.

3. На препарати наносять бензидиновий субстрат, витримують

5 – 10 хв у вологій камері за кімнатної температури, знову проми-

вають 0,9%-м розчином NaCl 15 хв, споліскують дистильованою во-

дою, висушують і розглядають у світловому мікроскопі під імерсією.

4. Реакція вважається позитивною, якщо в клітинах виявляють

дифузне жовто-коричневе забарвлення або гранули коричнево-

чорного кольору.

5. Одночасно ставлять контролі:

y заражені відомим вірусом клітини, оброблені імунопероксидаз-

ним кон’югатом;

y незаражені клітини, оброблені імунопероксидазним кон’югатом.

Непрямий імунопероксидазний метод

Компоненти реакції:

1) дослідний вірус (препарати з патологічного матеріалу хворих

тварин або зараженої культури клітин);

2) специфічна сироватка;

3) антивидовий імунопероксидазний кон’югат;

4) бензидиновий субстрат;

5) препарати з культури клітин, зараженої відомим вірусом;

6) препарати з органів здорових тварин або незараженої культу-

ри клітин;

7) 0,9%-й розчин NaCl.

Постановка реакції:

1. На фіксовані в ацетоні препарати наносять специфічну сиро-

ватку, витримують 1 – 2 год у вологій камері при +37 ºС, промива-

ють 0,9%-м розчином NaCl 5 хв, висушують на повітрі.

2. На препарати наносять антивидовий імунопероксидазний

кон’югат, витримують 1 – 6 год у вологій камері при +37 ºС, проми-

вають 0,9%-м розчином NaCl 15 хв, споліскують дистильованою во-

дою, висушують.

3. Препарати обробляють бензидиновим субстратом 5 – 10 хв у

вологій камері за кімнатної температури, промивають 0,9%-м роз-