Калинина О.С., Паникар И.И., Скибицкий В.Г. Ветеринарная вирусология

Подождите немного. Документ загружается.

Лабораторна діагностика вірусних хвороб

335

2) специфічна сироватка;

3) 0,5%-ва суспензія еритроцитів

;

4) розчин Хенкса.

Постановка РЗГАд

1. З 4 – 8 пробірок з інфікованою культурою клітин зливають

живильне середовище, культуру промивають два рази розчином

Хенкса.

2. У половину пробірок додають по 0,2 см

специфічної сироватки

(нерозведеної або в розведенні 1 : 10) і 0,6 см

розчину Хенкса, в ін-

ші (контрольні) пробірки — тільки розчин Хенкса (по 0,8 см

), ви-

тримують 20 – 30 хв за кімнатної температури.

3. У всі пробірки вносять по 0,2 см

0,5%-ї суспензії еритроцитів,

витримують 10 – 15 хв за кімнатної температури або 30 – 40 хв при

+4 ºС, злегка струшують і розглядають під малим збільшенням мік-

роскопа.

4. Вірус вважається ідентифікованим, якщо в пробірках із спе-

цифічною сироваткою гемадсорбція відсутня, а в контрольних —

наявна.

Ідентифікація вірусу у РНГАд

Компоненти реакції:

1) дослідний вірус;

2) специфічна сироватка;

3) 0,5%-ва суспензія еритроцитів;

4) пробірки з неінфікованою культурою клітин;

5) розчин Хенкса і середовище для культури клітин.

Постановка РНГАд

1. Визначення робочої дози вірусу

а)

Готують послідовні 10-разові розведення дослідного вірусу на

розчині Хенкса або середовищі для культури клітин в об’ємі 0,5 см

б) Кожним розведенням вірусу заражають по 2 – 4 пробірки з

культурою клітин в об’ємі по 0,1 см

, витримують у термостаті при

+37 °С 3 – 5 діб і ставлять РГАд.

в) Найвище розведення вірусу, яке зумовлює гемадсорбцію, при-

ймають за одну гемадсорбівну одиницю (1 ГАдО). Для основного до-

сліду беруть вірус у робочій дозі 100 ГАдО/0,1 см

(на одну пробірку

з культурою клітин).

2. Основний дослід РНГАд

а) Змішують однакові об’єми (по 0,5 см

) дослідного вірусу в робо-

чій дозі 100 ГАдО/см

і специфічної сироватки (в розведенні 1 : 10).

б) Суміші вірусу із сироваткою струшують і витримують 1 – 2 год

за кімнатної температури або +37 °С чи 16 – 18 год при +4 °С залеж-

но від виду вірусу.

У реакціях, які базуються на явищі гемадсорбції (РЗГАд і РНГАд), використо-

вують також 0,4%-ву суспензію еритроцитів.

Розділ 11

336

в) З 2 – 4 пробірок із культурою клітин зливають середовище і

вносять по 0,2 см

суміші вірусу із сироваткою.

г) Для контролю заражають 2 – 4 пробірки з культурою клітин

тільки дослідним вірусом у робочій дозі 100 ГАдО/0,1 см

(у суміші із

середовищем 1 : 1 по 0,2 см

д) Пробірки витримують 30 хв. за кімнатної температури, вно-

сять по 0,8 см

середовища і поміщають у термостат при +37 °С.

е) У строки, оптимальні для появи ЦПД дослідного вірусу, в про-

бірки додають по 0,2 см

0,5%-ї суспензії еритроцитів, витримують

10 – 15 хв. за кімнатної температури або 30 – 40 хв при +4 °С, злег-

ка струшують і розглядають під малим збільшенням мікроскопа.

є) Вірус вважається ідентифікованим, якщо в пробірках, зараже-

них сумішшю вірусу зі специфічною сироваткою, гемадсорбція від-

сутня, а в контрольних пробірках — наявна.

Цю методику застосовують і для визначення титру антитіл.

При цьому дворазові розведення дослідної сироватки (від 1 : 4 до

1 : 256 і вище) змішують з еталонним штамом вірусу в робочій дозі

100 ГАдО/0,1 см

, після контакту заражають пробірки з культурою

клітин і через кілька днів ставлять РГАд. За титр антитіл прийма-

ють найвище розведення сироватки, при якому гемадсорбція не

спостерігається.

РЕАКЦІЯ ЗВ’ЯЗУВАННЯ КОМПЛЕМЕНТУ (РЗК)

Реакція зв’язування комплементу (РЗК)

ґрунтується на вза-

ємодії антигенів з антитілами в присутності комплементу. Реакція

використовується для діагностики багатьох вірусних хвороб (ящур,

везикулярний стоматит, хвороба Ауєскі, вірусна діарея ВРХ, адено-

вірусна інфекція ВРХ та ін.).

Компоненти РЗК: 1) вірусні антигени; 2) сироватки; 3) ком-

племент; 4) гемолізин (або гемолітична сироватка); 5) 3%-ва суспен-

зія еритроцитів барана.

У РЗК беруть участь дві системи антиген – антитіло: специфі-

чна (вірусологічна) і гемолітична. До специфічної системи нале-

жать вірусні антигени й сироватки з гомологічними антитілами, а

до гемолітичної — гемолізин та еритроцити барана.

Гемолізин являє собою антисироватку (антитіла) щодо еритроци-

тів барана (антигену). Гемолізин одержують на біофабриках шля-

хом гіперімунізації кролів еритроцитами барана.

Комплемент — це складний комплекс білків, присутніх у нор-

мальній сироватці крові людини і тварин. Як комплемент викорис-

товують сироватку крові морської свинки, яку випускають на біофаб-

риках у ліофілізованому вигляді. Комплемент має властивість при-

єднуватися до будь-якого комплексу антиген-антитіло (класів IgG i

IgM). Це призводить до його активації з утворенням біологічно ак-

Лабораторна діагностика вірусних хвороб

337

тивних речовин, які спричинюють лізис антигену. Зокрема, в при-

сутності гемолітичної сироватки комплемент спричинює гемоліз

еритроцитів барана.

Суть РЗК. Змішують вірус, сироватку і комплемент. Якщо вірус-

ний антиген та антитіла гомологічні, утворюються імунні комплек-

си, які адсорбують комплемент, і при додаванні гемолітичної систе-

ми спостерігається затримка гемолізу. У випадку невідповідності

антигену й антитіл комплемент залучається в реакцію з гемолітич-

ною системою, внаслідок чого виникає гемоліз (рис. 94).

Вірусні антигени для РЗК одержують із заражених біологічних

об’єктів: органів і тканин тварин, органів і екстраембріональних

рідин курячих ембріонів, культуральної рідини. Тому в антигенних

вірусних препаратах завжди міститься багато баластних речовин

клітин господаря, які здатні адсорбувати комплемент за відсутності

гомологічних антитіл. Іншими словами, вірусні антигени мають

антикомплементарні властивості, яких обов’язково потрібно по-

збутися. Для усунення антикомплементарності антигени потрібно

очищати від тканинних домішок шляхом обробки фторовуглецеви-

ми сполуками, ацетоном, ефіром, хлороформом, фреоном,

β-

пропіолактоном, метиловим або етиловим спиртом, а також багато-

разовим заморожуванням і відтаванням.

Антикомплементарність властива не тільки вірусним антигенам,

але й сироваткам, що також слід враховувати при проведенні реак-

ції. Одним із найпоширеніших методів позбавлення сироваток від

антикомплементарності є обробка їх комплементом (3 об’єми си-

роватки + 1 об’єм комплементу, інкубація 16 – 18 год при +4 °С, а

потім 30 хв при +37 °С). Після цього сироватки інактивують, як і

Рис. 94. Схема РЗК (Я.Є.Коляков, 1986)

Розділ 11

338

при інших серологічних реакціях, при +56…+60 °С 30 хв для руйну-

вання неспецифічних вірусних інгібіторів і власного комплементу.

Для запобігання появі антикомплементарних властивостей сирова-

тки зберігають у замороженому або ліофілізованому вигляді.

РЗК ставиться в кілька етапів: 1) титрування гемолізину; 2) ти-

трування комплементу; 3) основний дослід.

Для одержання достовірних результатів РЗК обов’язково потріб-

но визначити оптимальну концентрацію всіх відомих її компонен-

тів. Так, при надлишку комплементу відбувається його зв’язування

і з комплексом антиген – антитіло (якщо він утворився), і з гемолі-

тичною системою, внаслідок чого може виникнути гемоліз і буде по-

ставлений невірний діагноз. Недостача комплементу зумовить за-

тримку гемолізу при взаємодії його з гемолітичною системою і теж

призведе до діагностичної помилки.

Реакцію можна ставити в різних об’ємах:

1) по 0,2 см

кожного компонента, загальний об’єм 1 см

;

2) по 0,1 см

кожного компонента, загальний об’єм 0,5 см

;

3) по 0,025 см

кожного компонента, загальний об’єм 0,125 см

Треба мати на увазі, що загальний об’єм реакції є постійним. То-

му при титруванні тих чи інших компонентів або при постановці

контролю, якщо якийсь інгредієнт не використовується, замість ньо-

го дають 0,9%-й розчин NaCl.

Постановка РЗК для виявлення антитіл

Компоненти реакції:

1) дослідні сироватки;

2) специфічний і нормальний антигени;

3) специфічна і нормальна сироватки;

4) комплемент;

5) гемолізин;

6) 3%-ва суспензія еритроцитів барана;

7) 0,9%-й розчин NaCl.

1. Титрування гемолізину

Титрування гемолізину проводять при одержанні нової серії.

а) Гемолізин біофабричного виготовлення розводять спочатку

1 : 100. Для цього до 0,2 см

гемолізину додають 9,8 см

0,9%-го роз-

чину NaCl (враховуючи, що гемолізин консервований гліцерином

1 : 1).

б) З розведення гемолізину 1 : 100 готують основне розведення

1 : 1000 до 1 см

гемолізину 1 : 100 додають 9 см

0,9%-го розчину

NaCl.

в) З основного розведення гемолізину 1 : 1000 готують усі наступ-

ні розведення за схемою, наведеною в табл. 8.

г) Після приготування розведень гемолізин титрують за схемою,

наведеною в табл. 9.

Лабораторна діагностика вірусних хвороб

339

Таблиця 8. Схема приготування розведень гемолізину

Розведення гемолізину

Компоненти (см

)

1 : 1500 1 : 2000 1 : 3000 1 : 4000 1 : 5000

Гемолізин 1 : 1000 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

0,9%-й розчин NaCl 0,5 1,0 2,0 3,0 4,0

Таблиця 9. Схема титрування гемолізину

Розведення гемолізи ну

Компоненти (см

)

1 : 1000 1 : 1500 1 : 2000 1 : 3000 1 : 4000 1 : 5000

Гемолізин 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2

0,9 % -й розчин NaCl

(замість антигену і

сироватки)

0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4

Комплемент 1:10 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2

3%-ва суспензія ерит-

роцитів

0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2

Експозиція 10 хв при +37 ºС

Облік результатів – – ++ +++ ++++ ++++

д) Результати реакції оцінюють у плюсах (після осідання

еритроцитів):

++++ — 100%-ва затримка гемолізу (рідина безколірна, вираже-

ний осад еритроцитів);

+++ — 75%-ва затримка гемолізу (рідина злегка забарвлена, ви-

ражений осад еритроцитів);

++ — 50%-ва затримка гемолізу (рідина забарвлена, осад час-

тини еритроцитів);

+ — 25%-ва затримка гемолізу (рідина інтенсивно забарвлена

незначний осад еритроцитів);

– — повний гемоліз (рідина інтенсивно забарвлена, осаду

еритроцитів немає).

е) За титр гемолізину приймають найменшу його кількість,

здатну спричинити повний гемоліз 3%-ї суспензії еритроцитів у

присутності комплементу (1 : 10) при експозиції 10 хв при +37 °С

Згідно з табл. 9, титр гемолізину становить 1 : 1500.

є) Для основного досліду беруть гемолізин у потрійному титрі,

який становить у даному випадку 1 : 500. Отже, для приготування

робочого титру гемолізин біофабричного виготовлення розводять у

500 разів (з урахуванням консервації його гліцерином), тобто до

0,2 см

цільного гемолізину додають 49,8 см

0,9%-го розчину NaCl.

ж) Для приготування гемолітичної системи змішують однакові

об’єми гемолізину в робочому титрі і 3%-ї суспензії еритроцитів ба-

В інших модифікаціях РЗК титр гемолізину — це найменша його кількість, що

зумовлює повний гемоліз 2%-ї суспензії еритроцитів у присутності комплементу в

розведенні 1 : 20 при експозиції 10 хв при +37 °С.

Розділ 11

340

рана. Перед використанням гемолітичну систему витримують 30 хв

при +37 °С (для сенсибілізації еритроцитів).

з) Одночасно ставлять контролі:

y еритроцитів для виключення спонтанного гемолізу (0,2 см

3%-ї

суспензії еритроцитів + 0,8 см

0,9%-го розчину NaCl);

y гемолізину для виключення гемолізу еритроцитів без участі

комплементу (0,2 см

гемолізину 1 : 1000 + 0,2 см

3%-ї суспензії

еритроцитів + 0,6 см

0,9%-го розчину NaCl);

y комплементу для виключення гемолізу еритроцитів без участі

гемолізину (0,2 см

комплементу 1 : 10 + 0,2 см

3%-ї суспензії ерит-

роцитів + 0,6 см

0,9%-го розчину NaCl);

y гемолізину для підтвердження гемолізу еритроцитів у присут-

ності комплементу (0,2 см

гемолізину + 0,2 см

комплементу 1 : 10 +

+ 0,4 см

0,9%-го розчину NaCl).

У перших трьох контролях має бути повна затримка гемолізу, а в

четвертому — повний гемоліз.

2. Титрування комплементу

Титрування комплементу проводять у день постановки основного

досліду.

а) Спочатку готують розведення комплементу з коефіцієнтом 1,5

за схемою, наведеною в табл. 10.

Таблиця 10. Схема приготування розведень комплементу

Розведення комплементу

Компоненти

(см

)

1 :10 1 : 15 1 : 20 1 : 25 1 : 30 1 : 40 1 : 60 1 : 80

0,9%-й розчин

NaCl

1,8 1,4 0,5 2,4 0,5 0,5 0,5 0,5

Комплемент

(цільний)

0,2 0,1

–

0,1 –

–

– –

1 2 3 4 5 6 7 8

№№ пробірок

Примітка: — послідовність перенесення комплементу.

б) Після приготування розведень комплемент титрують за схе-

мою, наведеною в табл. 11.

в) За титр комплементу приймають найменшу його кількість,

у присутності якої гемолізин у потрійному титрі зумовлює повний

гемоліз 3%-ї суспензії еритроцитів при експозиції 30 хв при +37 °С.

Згідно з табл. 11, титр комплементу становить 1 : 40 (1 ОД компле-

менту).

г) Для основного досліду беруть комплемент із надлишком, вра-

ховуючи антикомплементарність вірусних антигенів і сироваток:

0,5 0,5

0,5

0,5 0,5

Лабораторна діагностика вірусних хвороб

341

1,25 ОД, 1,5 ОД і 2 ОД. У даному випадку для приготування робо-

чих доз комплемент розводять на 0,9%-му розчині NaCl 1 : 32

(1,25 ОД), 1 : 26,6 (1,5 ОД) і 1 : 20 (2 ОД)

Таблиця 11. Схема титрування комплементу

Розведення комплементу

Компоненти (см

)

1 : 10 1 : 15 1 : 20 1 : 25 1 : 30 1 : 40 1 : 60 1 : 80

Комплемент 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2

0,9%-й розчин NaCl

(замість антигену і

сироватки)

0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4

Гемолітична систе-

ма

0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4

Експозиція 30 хв при +37 °С

Облік результатів – – – – – – ++ +++

д) Одночасно ставлять контроль гемолітичної системи для ви-

ключення гемолізу еритроцитів без участі комплементу (0,4 см

ге-

молітичної системи + 0,6 см

0,9%-го розчину NaCl).

3. Основний дослід РЗК

а) Готують дворазові розведення дослідної сироватки від 1:4 до

1 : 256 на 0,9%-му розчині NaCl (рН 7,2 – 7,4) в об’ємі 0,2 см

(3 ряди).

б) До кожного розведення сироватки додають по 0,2 см

специфіч-

ного антигену в робочій дозі

в) До кожної суміші сироватки з антигеном додають по 0,2 см

ком-

плементу в робочих дозах (1,25 ОД, 1,5 ОД і 2 ОД у 3 ряди), витриму-

ють 18 – 20 год. при +4 ºС

***

і 20 – 30 хв за кімнатної температури.

г) До кожної суміші сироватки, антигену і комплементу додають

по 0,4 см

гемолітичної системи, витримують у термостаті або водя-

ній бані при +37 ºС 45 хв.

д) Результати реакції оцінюють у плюсах відразу після прогрі-

вання й остаточно — через 2 год. експозиції за кімнатної темпера-

тури.

Оскільки вірусні антигени і сироватки мають різний ступінь антикомплементар-

ності, з метою уточнення робочої дози комплементу проводять його титрування

(0,5 ОД, 1 ОД, 1,5 ОД і 2 ОД) в присутності антигенів (специфічного і нормального в

робочій дозі) і сироваток (дослідної, специфічної та нормальної в розведенні 1 : 8).

Для основного досліду розраховують робочі дози комплементу за тим інгредієнтом,

який зв’язує його більше.

Робочу дозу антигену визначають шляхом його титрування в присутності спе-

цифічної сироватки за квадратною (шаховою) схемою, що дає змогу виявити оптима-

льне кількісне співвідношення між антигенами й антитілами. При цьому змішують

дворазові розведення антигену (1 : 2…1 : 64) і специфічної сироватки (1 : 8…1 : 128),

додають комплемент (2 ОД) і гемолітичну систему. За титр антигену приймають

найбільше його розведення, яке дає повне зв’язування комплементу з найбільшим

розведенням сироватки (100%-ва затримка гемолізу). Для основного досліду беруть

антиген у подвійному титрі.

***

Контакт сироватки, антигену і комплементу можна проводити при +37

1 год, але чутливість реакції при цьому знижується в 4 рази і більше.

Розділ 11

342

е) При наявності в дослідній сироватці антитіл буде затримка

гемолізу (на 2 – 4 плюси), а при їхній відсутності спостерігається

повний гемоліз. За титр антитіл приймають найвище розведен-

ня сироватки, яке зумовлює затримку гемолізу не менше як на 2

плюси з найменшою дозою комплементу.

є) Одночасно ставлять контролі:

y специфічності (постановка основного досліду РЗК із специфіч-

ною та нормальною сироватками, дослідною сироваткою й нормаль-

ним антигеном);

y сироваток (дослідної, специфічної та нормальної) на антикомп-

лементарність (0,2 см

сироватки в розведенні 1 : 4 + 0,2 см

0,9%-го

розчину NaCl + 0,2 см

комплементу в робочих дозах +

0,4 см

гемолітичної системи);

y специфічного і нормального антигенів на антикомплемен-

тарність (0,2 см

антигену + 0,2 см

0,9%-го розчину NaCl + + 0,2 см

комплементу в робочих дозах + 0,4 см

гемолітичної системи);

y специфічного і нормального антигенів на гемотоксичність (0,2 см

антигену + 0,4 см

0,9%-го розчину NaCl + 0,4 см

гемолітичної сис-

теми);

y гемолітичної системи (з комплементом і без нього):

1) 0,4 см

гемолітичної системи + 0,2 см

комплементу в робочих

дозах + 0,4 см

0,9%-го розчину NaCl;

2) 0,4 см

гемолітичної системи + 0,6 см

0,9%-го розчину NaCl.

Наведену вище методику РЗК можна застосовувати також для

ідентифікації вірусу з допомогою специфічної сироватки.

Незважаючи на трудомісткість, РЗК знайшла широке практичне

застосування в лабораторній діагностиці багатьох вірусних хвороб

тварин.

РЕАКЦІЯ РАДІАЛЬНОГО ГЕМОЛІЗУ (РРГ)

Реакція радіального гемолізу (РРГ) (

син.: реакція раді-

ального гемолізу в гелі — РРГГ)

заснована на здатності еритро-

цитів, які сенсибілізовані вірусними антигенами, лізуватися під ді-

єю антитіл у присутності комплементу в гелевому середовищі. Реа-

кція використовується для ретроспективної діагностики грипу ссав-

ців і птиці, респіраторно-синцитіальної інфекції ВРХ, чуми ВРХ,

інфекційної катаральної гарячки овець, ньюкаслської хвороби та ін.

Компоненти реакції:

1) дослідні сироватки;

2) специфічна сироватка;

3) вірус;

4) нормальний антиген;

5) 10%-ва суспензія еритроцитів;

Лабораторна діагностика вірусних хвороб

343

6) комплемент;

7) 0,9%-й розчин NaCl і ФБР;

8) 1,5%-ва агароза (на ФБР рН 7,2 з 0,1 % натрію азиду).

Постановка РРГ:

1. Сенсибілізація еритроцитів

Використовують еритроцити різних видів ссавців і птахів, що ви-

значається біологічними властивостями вірусів, до яких виявляють

антитіла. Гемаглютинувальні віруси легко адсорбуються на натив-

них еритроцитах. У випадку негемаглютинувальних вірусів еритро-

цити попередньо обробляють 10 хв при +20 – 22 °С 0,001 М розчином

калію перйодату, 0,05 М розчином хрому хлориду або таніном, відми-

вають три рази 0,9%-м розчином NaCl шляхом центрифугування при

1000 об/хв 10 хв і ресуспендують у ФБР до 10%-ї концентрації. Змі-

шують однакові об’єми 10%-ї суспензії еритроцитів (нативних або ста-

білізованих) із вірусовмісним матеріалом (гомогенат мозку й інших

тканин мишенят, алантоїсна рідина курячих ембріонів, культураль-

на рідина). Режим сенсибілізації — від 5 хв до 1 год при +4, +20 або

+37 °С і рН 6,0 – 9,0 (залежно від біологічних властивостей вірусів).

Сенсибілізовані еритроцити центрифугують, відмивають 2 – 3 рази

ФБР, готують 5 – 10%-ву суспензію, яку зберігають при +4 °С упро-

довж кількох днів. Сенсибілізовані еритроцити можна зберігати три-

валий час при – 70 °С у вигляді заморожених у рідкому азоті кра-

пель 33%-ї суспензії еритроцитів у 20%-му розчину декстрану.

2. До 5 – 10%-ї суспензії сенсибілізованих еритроцитів додають

комплемент, витримують 3 – 5 хв у водяній бані при +42…+45 °С.

Суміш вносять у розплавлену й охолоджену до +42 – 45 °С 1,5%-ву

агарозу (на ФБР рН 7,2 з додаванням 0,1 % натрію азиду), обережно

перемішують і переносять піпеткою на пластмасову пластинку або в

чашку Петрі (з розрахунку 1 см

розплавленої агарози на 7 – 8 см

Кінцева концентрація сенсибілізованих еритроцитів у гелевій су-

міші становить найчастіше 1,5 % (може коливатися в межах 0,5 –

5 %), а комплементу — біля 2,5 ГАО/см

3. Після застигання гелю з допомогою металевих матриць виго-

товляють лунки, куди вносять дослідні сироватки (нерозведені або у

дворазових розведеннях), витримують 16 – 20 год у вологій камері

при +4, +20 або +37 °С. У разі інкубації при +4 °С пластинки і чаш-

ки додатково витримують 2 – 3 год при +37 °С.

4. При наявності в дослідній сироватці антитіл навколо відповід-

ної лунки виникає прозора зона гемолізу внаслідок утворення на

поверхні еритроцитів комплексів антиген – антитіло – комплемент.

Результати реакції враховують візуально, вимірюючи лінійкою зони

гемолізу, діаметр яких прямо пропорційний титру антитіл.

5. Одночасно ставлять контролі:

y специфічна сироватка (у дворазових розведеннях) + сенсибілі-

зовані вірусним антигеном еритроцити + комплемент;

Розділ 11

344

y ФБР + сенсибілізовані вірусним антигеном еритроцити +

комплемент;

y специфічна сироватка + сенсибілізовані нормальним антиге-

ном еритроцити + комплемент;

y дослідна сироватка + сенсибілізовані нормальним антигеном

еритроцити + комплемент;

Перевагою РРГ є можливість кількісного визначення вмісту ан-

титіл на основі дослідження нативної сироватки без приготування

дворазових розведень, оскільки діаметр зони чітко корелює з кон-

центрацією антитіл. Недоліком реакції є неможливість виявлення

IgM, які погано дифундують у гелі, а також труднощі в стандарти-

зації антигенів.

РЕАКЦІЯ ДИФУЗІЙНОЇ ПРЕЦИПІТАЦІЇ (РДП)

Реакція дифузійної преципітації (РДП) (

син.: реакція ди-

фузійної преципітації в агарі — РДПА; реакція імунодифу-

зії — РІД)

заснована на здатності антигенів та антитіл дифундува-

ти в агаровому гелі та при взаємодії утворювати лінії або кільця

преципітації. Реакція використовується для діагностики сказу, хво-

роби Ауєскі, лейкозу ВРХ, вірусної діареї ВРХ, чуми м’ясоїдних, хво-

роби Марека та ін.

Є різні модифікації РДП. У вірусологічній практиці частіше за-

стосовують метод подвійної імунодифузії за Оухтерлоні, коли оби-

два імунореагенти (антигени й антитіла) дифундують в агарі, та

реакцію одиночної радіальної імунодифузії (РОРІД, РРІД), за якої у

склад гелю включають один імунний компонент, а другий — дифун-

дує в ньому.

Компоненти РДП:

1) дослідні вірусовмісні суспензії або сироватки;

2) специфічна і нормальна сироватки;

3) специфічний і нормальний вірусні антигени;

4) 1 – 2%-й агар (консервований фенолом 0,1 % або натрію мер-

тиолатом 1 : 10 тис.);

5) 0,9%-й розчин NaCl.

Постановка РДП (за Оухтерлоні):

1. На знежирені предметні скельця або в чашки Петрі налива-

ють розплавлений 1 – 2%-й агар (найкраще американської фірми

«Difco») завтовшки 1 – 1,5 мм. Після застигання з допомогою мета-

левих матриць вирізають лунки.

2. В одні лунки вносять дослідні вірусовмісні суспензії (або дослід-

ні сироватки — цільні чи у дворазових розведеннях), в інші — спе-

цифічні сироватки (або специфічні вірусні антигени) (рис. 95, 96).

3. Предметні скельця і чашки Петрі поміщають у вологу камеру,

витримують 24 – 48 год за кімнатної температури або в термостаті

при +37 ºС.