Калинина О.С., Паникар И.И., Скибицкий В.Г. Ветеринарная вирусология

Подождите немного. Документ загружается.

Розділ 1

лів та багатьох інших збудників. Моноклональні антитіла широко

застосовують не тільки для вдосконалення методів лабораторної

діагностики, а й технології виготовлення вакцин (так звані антиіді-

отипові вакцинні препарати), для вивчення антигенної структури

вірусів, патогенезу та імуногенезу при вірусних інфекціях. За роз-

робку методу отримання моноклональних антитіл Дж. Келеру (Ні-

меччина) і Ц. Мільштейну (Велика Британія) в 1984 р. присуджено

Нобелівську премію.

Для експрес-діагностики вірусних хвороб інтенсивно розробля-

ються метод молекулярної гібридизації нуклеїнових кислот і полі-

меразна ланцюгова реакція (ПЛР), які ґрунтуються на індикації

вірусних геномів безпосередньо в дослідному матеріалі. Важливою

перевагою цих методів є можливість виявити вірусні нуклеїнові кис-

лоти в тих пробах, в яких вірус вже втратив інфекційні та антигенні

властивості. Методи незамінні для індикації вірусів, що не культи-

вуються в лабораторних умовах, а також персистувальних вірусів і

провірусів. ПЛР може принести велику користь при дослідженні

проб із об’єктів довкілля, оскільки їх складно вивчати через значну

контамінацію різноманітними мікроорганізмами. К.Б. Мюлліс

(США), який розробив ПЛР у 1985 р., був удостоєний Нобелівської

премії.

У лабораторній діагностиці вірусних хвороб перспективним є ре-

стрикційний аналіз у поєднанні з методом секвенування. Вони

дають змогу скласти фізичні карти вірусних геномів із точністю до

одного нуклеотиду, що гарантує точну типізацію близькоспорідне-

них вірусів. Рестрикційний аналіз має велику цінність для стандар-

тизації та контролю біопрепаратів.

За останні десятиліття відбувся значний прогрес у специфічній

профілактиці вірусних інфекцій. Окрім традиційних живих та інак-

тивованих цільновіріонних вакцин створено сучасні субодиничні

вакцини, що складаються тільки з протективних вірусних антиге-

нів, які зумовлюють утворення вірусонейтралізувальних антитіл.

Проте імуногенність субодиничних вакцин, як правило, нижча, ніж

цільновіріонних. Так, імуногенність гемаглютиніну вірусу грипу А в

складі цільних віріонів у 100 разів вища порівняно з ізольованим

гемаглютиніном і в 10

разів перевищує імуногенність мономерного

поліпептиду, синтезованого в бактеріях. Мономерний поліпептид

VР1 вірусу ящуру в 10

разів менш імуногенний, ніж еквівалентна

його кількість у складі віріона. Це пов’язано з конформаційними

відхиленнями білкових макромолекул. Для підвищення імуноген-

ності субодиничні вакцини потрібно вводити з ад’ювантами та іму-

номодуляторами або конструювати у вигляді віросом, включаючи

протективні білки вірусів у ліпосоми.

Широкі можливості й перспективи для створення і промислового

виробництва вірусних вакцин відкриває генна інженерія. На основі

Введення у вірусологію

технології рекомбінантної ДНК розроблено чотири типи генно-

інженерних вакцин. Це — субодиничні вакцини, отримані шляхом

мікробіологічного синтезу на основі плазмідного або фагового век-

тора, в

який вбудовано гени протективних білків вірусів (гепатиту

В, грипу А, сказу, ящуру). Реасортантні вакцини виготовляють із

генетично стабільних реасортантів у вірусів із фрагментованим ге-

номом (віруси грипу А) або делеційних мутантів (вірус хвороби Аує-

скі). Рекомбінантні вакцини конструюють на основі вірусу віспо-

вакцини, в геном якого вбудовують гени протективних білків вірусів

(гепатиту В, грипу А, сказу, хвороби Ауєскі, везикулярного стомати-

ту, ньюкаслської хвороби). Перспективними є ДНК-вакцини, що яв-

ляють собою плазміди із вбудованими генами протективних вірус-

них білків.

Велика увага приділяється створенню полівалентних вакцин.

Технологія рекомбінантної ДНК відкриває широкі можливості в

цьому плані. Отримано рекомбінант вірусу вісповакцини, який міс-

тить гени протективних білків вірусів гепатиту В, грипу А і простого

герпесу. На основі вірусу вісповакцини розроблено полівалентну

вакцину проти гепатиту В, грипу А, простого герпесу і малярії. У

плазмідну ДНК можна вбудувати гени протективних білків кількох

вірусів і гени цитокінів, що регулюють імунну відповідь. На думку

фахівців, технологія рекомбінантної ДНК дасть змогу сконструюва-

ти полівалентні вакцини проти 12 і більшої кількості хвороб, у тім

числі вірусних, бактеріальних й паразитарних.

? Контрольні запитання

1. Розкажіть про історію відкриття вірусів. 2. Схарактеризуйте основні

періоди розвитку вірусології та становлення її як фундаментальної біологіч-

ної науки. 3. Що таке віруси, які їхні кардинальні відмінності від клітин-

них форм життя? 4. Чому віруси стали незамінною моделлю для молекуляр-

ної біології, генетики, генної інженерії, при вирішенні загальнобіологічних

проблем? 5. Чи є вірус організмом (індивідом)? 6. Які вірусоподібні струк-

тури ви знаєте? 7. Назвіть основні гіпотези походження вірусів. 8. Яка роль

вірусів у інфекційній патології людини, тварин і рослин? 9. Розкажіть про

досягнення і завдання ветеринарної вірусології в діагностиці та профілак-

тиці вірусних хвороб тварин.

Розділ 2

МОРФОЛОГІЯ ТА ХІМІЧНИЙ СКЛАД

ВІРУСІВ

ФІЗИЧНА СТРУКТУРА ВІРУСІВ

Віруси є облігатними внутрішньоклітинними генетичними пара-

зитами тварин, рослин, грибів, найпростіших і бактерій. Вони здат-

ні розмножуватися тільки в живих клітинах, куди вносять лише

свою генетичну інформацію.

Віруси існують у двох формах: позаклітинній (віріон) та внутріш-

ньоклітинній (вірусний геном).

Віріон — це неактивна форма існування вірусів. Розміри віріонів

коливаються в широких межах: від 15 до 970 нм (1 нанометр = 10

–9

м).

Найменші віруси (цирко-, парво-, пікорнавіруси) наближаються за

розмірами до білкових молекул, а найбільші (покс-, параміксо-, фі-

ловіруси) — близькі за розмірами до найдрібніших бактерій. Покс-

віруси (зокрема, віруси віспи ссавців і птахів та контагіозної ектими

овець і кіз) можна побачити у світловому мікроскопі.

Формування віріонів підпорядковується точним математичним

законам побудови просторових структур — від кристалів до архітек-

турних споруд — законам, які ґрунтуються на утворенні структур із

найменшим рівнем вільної енергії. Тому поняття «структура віріонів»

часто заміняли більш точним визначенням — «архітектура віріонів».

Віріон — це метаболічно інертна вірусна частинка, в якій нуклеїно-

ва кислота, що представляє геном (ДНК або РНК), оточена білковою

оболонкою — капсидом (від лат. сapsa — футляр). Капсид складається

з найменших функціонально-еквівалентних структурних одиниць, до

складу яких входить одна або кілька молекул білка (в останньому ви-

падку структурна одиниця поділяється на білкові субодиниці). Група

структурних одиниць утворює морфологічну одиницю — капсомер, яку

можна виявити за допомогою електронного мікроскопа.

Нуклеїнова кислота разом із капсидом утворює нуклеокапсид. У

просто організованих вірусів віріони представлені лише нуклеокап-

сидами. У складно організованих вірусів нуклеокапсид оточений

зовнішньою ліпопротеїновою оболонкою — суперкапсидом, або пеп-

лосом (від грец. рeplos — покрив, мантія).

До складу суперкапсиду входять ліпіди і вуглеводи клітини-

хазяїна, причому глікопротеїни формують на поверхні віріона мор-

фологічні субодиниці — пепломери, видимі в електронному мікро-

Розділ 2

Морфологія та хімічний склад вірусів

скопі. Пепломери виглядають як ості (шипи) завдовжки 7 – 10 нм

різної форми. Так, у РС-вірусу ості мають форму пляшки, а в коро-

навірусів вони булавоподібні.

Деякі складно організовані віруси крім суперкапсиду мають ще

одну проміжну оболонку — білкову мембрану, утворену М-білком

(матриксний, або мембранний, білок), яка оточує нуклеокапсид і

формує разом з ним нуклеоїд, або серцевину. Окремі віруси, неза-

лежно від складності їхньої організації, містять серцевину, представ-

лену нуклеїновою кислотою в комплексі з внутрішніми білками.

Вірусні капсиди мають надзвичайно впорядковану організацію.

Існує два типи будови капсидів віріонів, які забезпечують утворен-

ня структур із мінімумом вільної енергії: спіральний та кубічний

(ікосаедральний) типи симетрії (рис. 1).

Спіральний тип симетрії характеризується розміщенням кап-

сомерів у вигляді спіралі навколо молекули нуклеїнової кислоти. Біл-

кові субодиниці вкладені в спіраль так, що відносно поздовжньої осі

всі вони (за винятком кінцевих) знаходяться в однаковому положен-

ні. У разі спірального типу симетрії капсомери утворюють трубку

(стрижень), усередині якої дуже компактно упакована нуклеїнова

кислота. Її довжина значно перевищує розміри віріона. Наприклад,

довжина вірусу тютюнової мозаїки становить 300 нм, а довжина його

РНК сягає 4000 нм. При цьому РНК настільки міцно зв’язана з кап-

сидом, що її не можна звільнити, не пошкодивши капсид. За спіраль-

Рис. 1. Модель просто організова-

них вірусів зі спіральним (а) та іко-

саедральним (б) типами симетрії

(С.С.Дяченко та ін., 1974;

В.М.Сюрін та ін., 1998

)

Розділ 2

ного типу симетрії спостерігається максимально регулярна взаємодія

між білковими субодиницями капсиду і нуклеїновою кислотою.

Віріони зі спіральним нуклеокапсидом мають паличко- або нитко-

подібну форму. Це стосується вірусів рослин. Серед вірусів тварин

спіральний тип симетрії властивий вірусам, геном яких представле-

ний одноланцюговою РНК, причому нуклеокапсиди в них завжди

оточені зовнішньою ліпопротеїновою оболонкою. Форма віріонів у та-

ких вірусів сферична. Виняток становлять рабдовіруси (наприклад,

вірус сказу), що мають кулясту форму, а також філовіруси (віруси

Марбург та Ебола), яким властива ниткоподібна форма.

У разі кубічного (ікосаедрального) типу симетрії капсоме-

ри вкладаються у формі геометричної фігури ікосаедра (20-гран-

ника), утворюючи порожнисте ізометричне тіло, в центрі якого зна-

ходиться нуклеїнова кислота. При цьому не існує регулярної взає-

модії між нуклеїновою кислотою та кожною білковою субодиницею.

Ікосаедр сформований 20 рівносторонніми трикутниками. Він має

12 вершин, до кожної з яких сходяться кути 5 трикутників, і 30 ре-

бер, де з’єднуються сторони сусідніх трикутників. Такі віріони є си-

метричними в трьох взаємно перпендикулярних напрямках.

Для побудови ікосаедра потрібно мінімум 60 (або кратних 60)

структурних одиниць, які зв’язані між собою осями симетрії 2-, 3- і

5-го порядків. Вісь симетрії 2-го порядку проходить через центр

будь-якого ребра, де структурні одиниці агрегуються в димери. Вісь

симетрії 3-го порядку проходить через центр будь-якої трикутної

грані, де групуються тримери.

Вісь симетрії 5-го порядку про-

ходить через кожну вершину,

де утворюються пентамери

(рис. 2).

У багатьох вірусів капсомери

формують багатогранник — іко-

садельтаедр, якщо грані ікоса-

едра поділяються на менші рів-

носторонні трикутники. При цьо-

му утворюється вісь симетрії 6-го

порядку, коли до вершин схо-

дяться кути 6 трикутників, де

групуються гексамери (рис. 3).

Серед вірусів тварин ікосае-

дральний тип симетрії власти-

вий майже всім ДНК-вмісним

вірусам (за винятком поксвіру-

сів) і багатьом РНК-вмісним

вірусам, незалежно від склад-

ності їхньої організації.

Рис. 2. Будова ікосаедра

(Д.Каспар, А.Клаг, 1962):

1 — три осі симетрії ікосаедра; 2 — ікосаедр

з боку осі симетрії 2-го порядку; 3 — ікоса-

едр з боку осі симетрії 3-го порядку; 4

—

ікосаедр з боку осі симетрії 5-го порядк

Морфологія та хімічний склад вірусів

Ізометричні віріони просто

організованих вірусів ма-

ють здебільшого форму іко-

саедра (хоча трапляються й

інші форми, наприклад,

пентагондодекаедра). У

складно організованих ві-

русів, у яких ікосаедральні

нуклеокапсиди оточені су-

перкапсидною оболонкою,

форма віріонів сферична.

Виняток становить вірус

АЧС із родини Asfarviridae,

який має ікосаедральну

форму.

Існують віруси зі скла-

дним (комбінованим) типом симетрії: поксвіруси, ретровіру-

си, фаги.

Поксвіруси мають порівняно з іншими вірусами нетрадиційну

будову (рис. 5). Зовнішня оболонка віріона оточує серцевину у

вигляді двовгнутого диска, по боках якого знаходяться овальні

структури — бокові тіла. Серцевина містить дволанцюгову ДНК,

оточену внутрішньою гладенькою мембраною та зовнішнім шаром із

циліндричних субодиниць.

Рис. 4. Структура складно організованих вірусів зі спіральним (а)

та ікосаедральним (б) типами симетрії (Д.Каспар, А.Клаг, 1962):

1 — суперкапсид; 2 — капсид; 3 — структурна одиниця (субодиниця); 4 — морфо-

логічна одиниця (капсомер); 5 — нуклеїнова кислота

а б

Рис. 3. Групування капсомерів

за ікосаедрального типу симетрії

(Б.Філдс, Д.Найп, 1989):

а — ікосаедр (60 субодиниць); б — ікосадельта-

едр (180 субодиниць)

Розділ 2

У ретровірусів є два типи симе-

трії: суперкапсидна оболонка вкри-

ває серцевину, яка складається з

ікосаедрального капсиду і розмі-

щених усередині двох спіральних

нуклеокапсидів (рис. 6).

Два типи симетрії спостеріга-

ються також у фагів колі-

дизентерійної групи (Т-парних,

рис. 7). Так, фаг Т2 складається з

головки і відростка. Головка утво-

рена білковими молекулами, які

формують ікосаедр, і містить усе-

редині дволанцюгову ДНК. Відрос-

ток являє собою порожнистий

стрижень, оточений чохлом, що

здатний скорочуватися подібно до

м’язів. Чохол складається з білко-

вих субодиниць, розміщених за

спіральним типом симетрії. Відрос-

ток закінчується шестигранною

базальною пластинкою із шістьма

зубцями, від яких відходять нитки — фібрили, що забезпечують ад-

сорбцію фага на бактеріальній клітині.

Рис. 5. Структура поксвірусів

(В.М. Сюрін, Н.В. Фоміна, 1979):

1 — зовнішня оболонка; 2 — серцевина;

3 — дволанцюгова ДНК; 4 — бокові тіла

Рис. 6. Структура ретровірусів

(Д.Б. Голубєв, В.З. Солоухін, 1989):

1 — суперкапсид; 2 — ікосаедраль-

ний капсид; 3 — спіральні нуклео-

капсиди

Рис. 7. Структура Т-парних фагів

(В.І. Покровський, О.К. Поздєєв,

1999):

1 — головка; 2 — відросток; 3 — база-

льна пластинка; 4 — фібрили

Морфологія та хімічний склад вірусів

ХІМІЧНИЙ СКЛАД ВІРУСІВ

НУКЛЕЇНОВІ КИСЛОТИ

Клітини всіх живих організмів містять два типи нуклеїнових кис-

лот — ДНК і РНК. Вони побудовані з чотирьох типів нуклеотидів,

які, сполучаючись між собою, утворюють довгі полінуклеотидні лан-

цюги (нитки). До складу нуклеотидів входять залишки азотистої

основи (аденін, гуанін, цитозин, тимін у ДНК і урацил у РНК) і фос-

форної кислоти. Первинну структуру нуклеїнових кислот досить міц-

но стабілізують ковалентні зв’язки, а саме: глікозидний зв’язок між

азотистою основою й вуглеводним компонентом, ефірний зв’язок

між дезоксирибозою або рибозою і фосфорною кислотою та

фосфодиефірний зв’язок між нуклеотидами.

Клітинна ДНК — це двонитчаста молекула, в якій полінуклео-

тидні ланцюги з’єднані водневими зв’язками, що утворюються між

азотистими основами згідно з законом комплементарності (аденін –

тимін, гуанін – цитозин). Двонитчаста ДНК — це клітинний геном,

що виконує функції збереження і реплікації спадкової інформації.

Лише одна нитка ДНК кодувальна, тобто несе генетичну інформа-

цію про білки. Обидві нитки ДНК слугують матрицею для репліка-

ції — синтезу точних копій клітинного геному.

Клітинна РНК є однонитчастою молекулою, яка представлена

трьома класами:

1) інформаційні РНК (іРНК) утворюються в результаті транскрип-

ції геному і передають генетичну інформацію на білок-синтезуваль-

ний апарат клітини;

2) рибосомальні РНК (рРНК) є структурним елементом рибосом;

3) транспортні РНК (тРНК) доставляють амінокислоти до рибосом.

На відміну від клітинних форм життя, в складі віріонів вірусів

міститься лише один тип нуклеїнової кислоти — ДНК або РНК.

Відповідно всі віруси поділяються на ДНК-вмісні (або ДНК-геномні)

та РНК-вмісні (або РНК-геномні). Саме існування РНК-геномних

вірусів свідчить про те, що вірусна РНК, так само як і ДНК, є носієм

спадкової інформації, причому більшість вірусів тварин і людини

(близько 80 %) — РНК-вмісні. Вірусний геном гаплоїдний, за винят-

ком ретровірусів, які мають диплоїдний геном, представлений дво-

ма ідентичними молекулами одноланцюгової РНК.

Молекулярна маса вірусних нуклеїнових кислот коливається в

широких межах: у ДНК-вмісних вірусів від 1,5 × 10

Д (парвовіруси)

до 250 × 10

Д (покс- та іридовіруси); у РНК-вмісних вірусів —

від 2,5 × 10

Д (пікорнавіруси) до 20 × 10

(реовіруси).

Вірусні нуклеїнові кислоти характеризуються надзвичайною різ-

номанітністю форм (рис. 8).

Д (дальтон) — це маса одного атома водню, становить 1,67 × 10

–24

г.

Розділ 2

Вірусні ДНК бувають

одно- і дволанцюговими,

лінійними і кільцевими.

У вірусних дволанцюгових

ДНК, на відміну від клітин-

ної ДНК, генетична інфор-

мація закодована, як прави-

ло, на обох нитках. Це свід-

чить про максимальну еко-

номію генетичного матеріалу

у вірусів, що є невід’ємною

властивістю їх як генетичних

паразитів.

Структура ДНК в основ-

ному унікальна: більшість

нуклеотидних послідовностей

трапляється лише один раз.

Але на кінцях молекул бува-

ють повтори, коли в кінцевому

фрагменті ДНК дублюється її

початкова ділянка. Повтори

можуть бути прямими та ін-

вертованими — з нуклеотид-

ними послідовностями у

зво-

ротному порядку, які здатні

утворювати шпилькові струк-

тури. У цих повторах закла-

дена потенційна здатність до утворення кільцевої форми, яка має ве-

лике значення для вірусів. По-перше, кільцева форма забезпечує стій-

кість нуклеїнової кислоти до нуклеаз — ферментів, які послідовно

відщеплюють нуклеотиди з кінців полінуклеотидного ланцюга. По-

друге, стадія утворення кільцевої форми є обов’язковою для процесу

інтеграції вірусної ДНК із клітинним геномом. І, нарешті, кільцева

форма — це зручний та ефективний спосіб регулювання транскрипції

й реплікації ДНК. Кільцеву дволанцюгову ДНК мають папілома-, по-

ліома- і гепаднавіруси. В інших вірусів двонитчасті ДНК набувають

кільцевої конфігурації тимчасово, ймовірніше — під час реплікації.

ДНК багатьох вірусів має деякі специфічні особливості. Так,

ДНК папілома- й поліомавірусів надспіралізована і за своєю конфі-

гурацією подібна до хромосоми клітини. У гепаднавірусів плюс-

нитка ДНК дефектна — на 15 – 60 % коротша за мінус-нитку

У поксвірусів обидва ланцюги ДНК ковалентно замкнені на кінцях.

Плюс-нитка вірусної ДНК або РНК має таку саму послідовність нуклеотидів,

що й вірусна іРНК, а мінус-нитка — комплементарна іРНК.

ДНК

дволанцюгові одноланцюгові

РНК

одноланцюгові дволанцюгові

1 3 4 3

Рис. 8. Типи і форми вірусних нуклеїно-

вих кислот:

1 — лінійна; 2 — кільцева; 3 — фрагментова-

на; 4 — фрагментована кільцева

Морфологія та хімічний склад вірусів

Одноланцюгова ДНК характерна для парво- та цирковірусів. У

складі віріонів цирковірусів, як правило, міститься ДНК однієї по-

лярності (мінус-нитка). Геном автономних парвовірусів також пред-

ставлений в основному мінус-нитчастою ДНК, хоч у частини віріо-

нів (1 – 50 %) виявляють плюс-нитки. ДНК обох полярностей міс-

тять парвовіруси комах і аденоасоційовані віруси, які є дефектними

і здатні розмножуватися лише в присутності вірусу-помічника. При

дезінтеграції віріонів in vitro плюс- і мінус-нитки ДНК можуть вза-

ємодіяти між собою, утворюючи дволанцюгову ДНК.

Однонитчаста ДНК буває лінійною, наприклад, у парвовірусів,

або кільцевою, як у цирковірусів і деяких фагів.

Вірусні РНК, так само, як і клітинні, дуже різноманітні. Вони

бувають одно- і двонитчастими, лінійними, фрагментованими і кі-

льцевими.

Для однонитчастої РНК характерна полярність. Віруси, що міс-

тять одноланцюгову РНК, поділяються на дві групи: плюс-нитчасті

(або віруси з позитивним геномом) і мінус-нитчасті (або віруси з не-

гативним геномом). У плюс-нитчастих вірусів віріонна РНК вико-

нує функцію іРНК, тобто здатна безпосередньо переносити генетич-

ну інформацію на рибосоми. Позитивний геном мають пікорна-, то-

га-, флаві-, артері-, корона-, каліци-, нода- й астровіруси. Плюс-

нитчастими є також ретровіруси, але вони реалізують свою генетич-

ну інформацію через комплементарну ДНК-копію. У мінус-нит-

частих вірусів віріонна РНК не має властивостей іРНК. У таких

вірусів на матриці мінус-нитки РНК синтезується комплементарна

їй іРНК за участю вірусного ферменту транскриптази, який обов’яз-

ково входить до складу віріонів. Негативний геном мають парамік-

со-, ортоміксо-, рабдо-, філо-, борна- арена- і буньявіруси, причому в

арена- і буньявірусів частина генів із позитивною полярністю.

Однонитчаста РНК в ортоміксовірусів є фрагментованою (скла-

дається з 7 – 8 фрагментів). Арена- і буньявіруси також містять од-

нонитчасту фрагментовану РНК (відповідно 2 і 3 фрагменти). У бу-

ньявірусів кожен фрагмент має кільцеву форму, а в аренавірусів

фрагментована РНК може бути як лінійною, так і кільцевою.

Для дволанцюгової РНК характерна фрагментованість. Цей тип

нуклеїнової кислоти властивий реовірусам (10 – 12 фрагментів) і

бірнавірусам (2 фрагменти).

Нуклеїнові кислоти зумовлюють інфекційні властивості вірусів.

Багато вірусних нуклеїнових кислот інфекційні самі по собі, тобто

здатні спричинити інфекційний процес за відсутності вірусоспецифі-

чних білків (ферментів). Інфекційні властивості виявляють нуклеїно-

ві кислоти більшості ДНК-вмісних вірусів (за винятком покс-, іридо-,

асфар- і гепаднавірусів) і плюс-нитчастих РНК-вмісних вірусів (окрім

ретровірусів). Генетична інформація інфекційної ДНК переписується

на іРНК за участю клітинної транскриптази, а плюс-нитчаста РНК