Карпов С.А. Строение клетки протистов

Подождите немного. Документ загружается.

121

В фазово-контрастном микроскопе структуры клетки выг-

лядят более темными, контрастными, чем в обычном микроско-

пе, а при больших увеличениях вокруг них образуется светлый

ореол, затрудняющий рассмотрение деталей строения клетки.

Интерференционный контраст (оптика Номарского) созда-

ет впечатление объемного изображения клетки. Изображение

при использовании оптики Номарского получается без ореола

и выгдядит более детальным.

С развитием электронных систем эта техника была приме-

нена и к интерференционно-контрастным микроскопам. В на-

чале 80-х была создана видеомикроскопия, которая позволи-

ла различать на живых клетках отдельные микротрубочки,

диаметр которых составляет 0,025 мкм, что почти в 20 раз мень-

ше длины световой волны. Для того, чтобы это стало возмож-

но, нужно было уменьшить интенсивность освещения, т.к.

человеческий глаз не может улавливать слабые различия в ос-

вещенности структур на ярком общем фоне, и, соответствен-

но, усилить слабый сигнал, поступающий от объекта. Для уси-

ления сигнала была применена чувствительная видеокамера,

сигнал от которой превращался в цифровое изображение и вы-

водился на экран монитора. Полученное изображение можно

было обрабатывать средствами электроники, которые позво-

ляли менять увеличение, яркость и контраст в широких пре-

делах. Этот метод оказался особенно перспективным для

усиления сигнала от слабых флюоресцентных меток, приме-

няемых на живых объектах.

Для изучения собственно одноклеточных протистов описан-

ных методов световой микроскопии вполне достаточно, т.к. клет-

ки имеют небольшие размеры и световой пучок их легко про-

свечивает. Однако для исследования некоторых аспектов

жизнедеятельности паразитических протистов бывает важно

проследить положение клетки в тканях хозяина, не используя

при этом обычные методы фиксации, заливки, резки с после-

дующим изучением срезов материала. Для исследования круп-

ных объектов, их трехмерной реконструкции используется кон-

фокальный микроскоп. Упрощенная схема, иллюстрирующая

принцип его работы, показана на рисунке 3.4.

122

ГЛАВА 3. ОСНОВНЫЕ МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ КЛЕТКИ

Принципиально он устроен так же, как флюоресцентный

микроскоп (рис. 3.2). Однако имеется 2 главных отличия. Ис-

точником света вместо ртутной лампы служит лазер, свет от ко-

торого проходит сквозь очень маленькое отверстие, чье изобра-

жение фокусируется на одной определенной точке объекта,

проходя через обычную систему двухронных зеркал. Флюорес-

центное свечение от объекта фокусируется в другом (конфо-

кальном) отверстии, откуда идет на воспринимающий детек-

тор. Весь свет, который отражается от частей объекта,

находящихся вне фокуса, отсекается и не маскирует нужное нам

изображение. Таким образом, точечное изображение источни-

Рис. 3.4. Упрощенная схема строения современного конфокаль-

ного микроскопа.

Лазерное излучение проходит сквозь «игольное ушко» и,

отражаясь от дихронного зеркала, фокусируется в одной точке

на объекте (А); он возбуждает молекулы флюоресцентного

красителя, который генерирует излучение большей длины

волны. Свет от объекта проходит сквозь дихронное зеркало и

фокусируется в конфокальном «игольном ушке», попадая

сквозь него на детектор (Д) (Б). Весь посторонний свет,

отражающийся от других частей объекта, практически не

проходит сквозь «игольное ушко» и, таким образом, не маски-

рует необходимое нам излучение (В).

123

ка света фокусируется на объекте, и только от объекта отражен-

ный свет попадает сквозь конфокальное отверстие на детектор.

Сканируя объект лучом лазера, мы получаем очень точные двух-

мерные изображения, которые можно анализировать и созда-

вать при помощи компьютера трехмерное изображение инте-

ресующих нас структур.

Электронная микроскопия

В электронном микроскопе используется принципиально

иной источник света. Вместо видимого света – поток электро-

нов, длина волны которого составляет всего 0,004 нм. Следова-

тельно, теоретически мы можем получить разрешение около

0,002 нм, или 0,02Å (рис. 70). Для сравнения, размер атома

водорода в 10 раз больше. Однако на практике паспортное раз-

решение микроскопа в 1,2-1,4 Å уже считается идеальным. Осо-

бенности приготовления биологических объектов для электрон-

ной микроскопии и различные погрешности при просмотре

таковы, что на практике разрешение в просвечивающем элект-

ронном микроскопе составляет около 2 нм. Тем не менее, это в

100 раз выше разрешения светового микроскопа, и позволяет

рассматривать микрофиламенты диаметром 2–4 нм.

Устройство просвечивающего (ПЭМ) и сканирующего

(СЭМ) электронных микроскопов в сравнении со световым по-

казано на рисунке 3.5.

Источником эмиссии электронов является нить накала като-

да. Рядом с ней располагается анод. Под действием ускоряю-

щего напряжения (80–100 Кв для ПЭМ, и 30–40 Кв для СЭМ)

пучок электронов направляется по узкому туннелю колонны

микроскопа, проходит сквозь объект и попадает на флюорес-

цирующий экран, на котором и формируется изображение. Для

улучшения качества изображения в колонне создается вакуум,

пучок электронов формируют магнитные линзы (по аналогии

со стеклянными линзами в световом микроскопе). Чтобы на эк-

ране получилось четкое изображение, объект должен быть, с

одной стороны, прозрачным для электронов, т.е. достаточно тон-

ким (50–100 нм), а с другой стороны, структуры его должны

быть достаточно плотными и могли отклонять электроны так,

чтобы на экране под ними получались соответствующие им тем-

124

ГЛАВА 3. ОСНОВНЫЕ МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ КЛЕТКИ

ные пятна и полосы. Это чередование на экране электронно-

плотных (темных) и электронно-прозрачных (светлых) полос

и представляет собой изображение объекта. Для окраски (кон-

трастирования) биологических объектов обычно используют

соли тяжелых металлов (свинца и урана), которые, оседая на

клеточных структурах, делают их непрозрачными для элект-

ронов.

Процесс приготовления объектов для ПЭМ довольно сложен

и имеет много нюансов. Однако эта процедура уже давно стала

рутинной и для овладения ею требуется лишь практика.

Наилучшими фиксаторами для ЭМ являются глутаровый аль-

дегид и четырехокись осмия (рис. 3.6), которые образуют кова-

Рис. 3.5. Сравнение светового (А) и электронных просвечиваю-

щего (Б) и сканирующего (В) микроскопов. Показано принци-

пиальное сходство основных рабочих узлов. Отличие

электронных микроскопов: объект помещен в вакуум, источник

излучения – поток электронов, вместо стеклянных используют-

ся магнитные линзы.

д – детектор, ис – источник света, кл – конденсорные линзы, л –

линза, м – монитор, об – объект, ок – окуляр, ол – объективная

линза, оу – отклоняющее устройство, пл – проекторная линза,

фэ – флюоресцентный экран.

125

лентные связи с макромолекулами объекта по месту двойных

связей.

Оба фиксатора дополняют друг друга. Глутаральдегид связы-

вает преимущественно белки, а четырехокись осмия – жиры. Уг-

леводы практически не взаимодействуют с этими фиксаторами.

После фиксации клетки обезвоживаются в спиртах и зали-

ваются в полимерные материалы, которыми обычно служат

эпоксидные смолы. В результате полимеризации при опреде-

ленных условиях смолы затвердевают, при этом не меняя свое-

го объема, т.е не искажая форму клетки. На специальном при-

боре (ультрамикротоме) получают ультратонкие срезы, которые

помещаются на маленькие ненамагничивающиеся сетки (обыч-

но из меди, вольфрама или платины) и контрастируются ура-

нилацетатом и цитратом свинца. После этого сеточки с объек-

том помещаются в микроскоп и просматриваются при нужном

увеличении.

В СЭМ используется тот же основной принцип формирова-

ния пучка, но изображение формируется иначе (рис. 3.5). Здесь

исследуется поверхность объекта, которая должна быть доста-

точно плотной, чтобы от нее отражались электроны. Для этого

объект покрывается (напыляется) тонким слоем тяжелого ме-

талла (золото, платина, сплав платины с палладием) и монти-

руется на специальный столик, который позволяет поворачи-

вать и наклонять объект. Отраженные от поверхности объекта

вторичные электроны улавливаются детектором, который уси-

ливает сигнал и подает его на монитор, где формируется изоб-

Рис. 3.6. Структурные формулы

молекул глутарового альдегида (А)

и четырехокиси осмия (Б).

126

ГЛАВА 3. ОСНОВНЫЕ МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ КЛЕТКИ

ражение. Таким образом, в ре-

зультате сканирования поверхно-

сти объекта электронным пучком,

на экране монитора формирует-

ся его трехмерное изображение с

достаточно высокой степенью

разрешения, хотя и меньшей, чем

в ПЭМ, но при большей глубине

фокуса.

Оттенение металлом

Исследование тонких поверх-

ностных структур клетки и даже

отдельных молекул можно про-

водить и в ПЭМ, получая при

этом более высокое разрешение

(рис. 3.7).

Для этого объект напыляют

металлом под определенным уг-

лом, чтобы получились тени от

его выпуклых частей, а затем

удаляют из-под пленки сам

объект, просто растворяя его в

том или ином растворителе. По-

лученную копию поверхности

(реплику) помещают на сеточку

и просматривают в ПЭМ как

обычный срез. Таким образом

исследуют очень тонкие структу-

ры вирусов и макромолекул.

Негативное окрашивание

Это еще один простой и распро-

страненный способ изучения

структуры макромолекул или

тончайших выростов поверхнос-

ти клетки. Для этого исследуемый

объект помещают на поверхность

пленки-подложки (лучше всего

Рис. 3.7. Приготовление

металлической реплики с

поверхности объекта. 1 –

объект (об), расположенный

на подложке (п),

2 – объект напыляется

слоем тяжелого металла под

углом, 3 – напыление углем

поверх металла для укрепле-

ния реплики. 4 – удаление

объекта в сильном раствори-

теле, 5 – отмывка реплики и

помещение ее на сеточку

для просмотра в ТЭМ.

127

угольной) и покрывают на 1 минуту раствором соли какого-либо

тяжелого металла (фосфорно-вольфрамовой кислоты или ура-

нилацетата). После высушивания сеточку с объектом помеща-

ют в ПЭМ и просматривают. Прозрачные для электронного пуч-

ка макромолекулы и другие органические структуры выглядят

светлыми на темном фоне, образованном солями тяжелого ме-

талла, который не прозрачен для электронов. Таким способом,

в частности, определяют строение мастигонем на поверхности

жгутиков, структуру вирусов, строение клеточной стенки бак-

терий.

Метод замораживания-скалывания

Метод получения реплик используется также для изучения

внутреннего строения мембран (рис. 3.8).

Для этого клетки быстро замораживаются до температуры

жидкого азота (-196° С). Обычно это происходит в присутствии

антифриза, который предотвращает образование в клетке кри-

сталлов льда, разрушающего клеточные структуры, или процесс

замораживания идет при температуре жидкого пропана (-80° С),

а потом объект помещается в жидкий азот. Затем заморожен-

Рис. 3.8. Метод замораживания-скалывания (А) и замораживания-

травления (Б).

В обоих случаях объект быстро замораживается и раскалывается. Затем

(А) получают реплику непосредственно со скола (см. рис. 3.7), или (Б)

помещают в вакуум, где часть цитоплазмы сублимируется и обнажаются

внутренние структуры клетки, а затем изготавливается реплика.

вл – выпаренный лед, вц – выпаренная цитоплазма, вч –

внутримембранные частицы, нпм – наружная плазматическая мембрана

и поверхность органелл, пм – плазматическая мембрана.

128

ГЛАВА 3. ОСНОВНЫЕ МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ КЛЕТКИ

ная клетка раскалывается лезвием бритвы, и поверхность скола

напыляется платиной. Далее процедура та же, что и при получе-

нии реплики с целого объекта: органический материал удаляет-

ся, а реплика просматривается в ПЭМ. Сколы обычно проходят

таким образом, что расщепляют мембраны, и мы можем наблю-

дать их внутреннее строение. Чаще всего таким образом изуча-

ют распределение внутримембранных белков.

Метод замораживания-травления (фризэтчинг)

Этот метод позволяет изучать как внешние, так и внутренние

структуры клетки (рис. 3.8). После быстрого замораживания

клетки, с нее получают скол, но перед напылением ее помеща-

ют в вакуум, где при низкой температуре происходит возгонка

льда. В результате обнажаются более глубокие структуры клет-

ки. После этого объект напыляют, затем растворяют, как и в

предыдущем методе, и полученную реплику просматривают в

ПЭМ. Этот метод дает прекрасные результаты при изучении

скелетных структур, т.к. позволяет наблюдать трехмерную кар-

тину содержимого клетки.

Криоэлектронная микроскопия

Этот метод требует достаточно сложного оборудования.

Объект сначала замораживают, затем получают с него срез на

криоультрамикротоме толщиной не более 100 нм. Полученный

срез помещают на сеточку, которую тут же вставляют в элект-

ронный микроскоп. При этом температура объекта должна со-

храняться на уровне -160° С, для чего используется специаль-

ный держатель. В вакууме микроскопа происходит возгонка

льда и можно наблюдать нативные структуры клетки ничем не

окрашенные, но и вполне контрастные. Так были получены

фотографии вирусов и белковых филаментов мышц насекомых.

Методы криофиксации (без использования химических ве-

ществ) важны и в теоретическом плане. При сложном способе

химической фиксации и последующей процедуре приготовле-

ния объекта для ПЭМ всегда остается сомнение в истинности

получаемой картины. Криометоды позволили получить очень

близкие результаты в отношении строения клетки и убедили ис-

следователей в том, что современные химические способы фик-

сации не вызывают артефактов.

129

ГЛАВА 4

Строение клетки протистов

Протисты являются эукариотами, поэтому им свойственны

те же основные системы (поверхностный аппарат, цитоплазма

и ядро), какие мы встречаем в клетках многоклеточных живот-

ных и растений. В цитоплазме протистов обнаруживаются ми-

тохондрии и хлоропласты, аппарат Гольджи и пероксисомы. В

то же время, их клетки имеют множество морфологических осо-

бенностей, которые встречаются только у протистов. Наиболее

разнообразны различные цитоскелетные образования, к кото-

рым можно отнести как внутренние цитоплазматические струк-

туры, так и как наружные образования (покровы), и, кроме того,

минерализованные скелетные элементы. По-видимому, имен-

но развитие цитоскелета, как основной интегрирующей систе-

мы клетки, отличает протистов от клеток других эукариот, по-

этому, помимо обычного набора органелл, особое внимание

будет уделено строению цитоскелета, а также структурам, ха-

рактерным только для протистов.

4.1. Покровы

Как у всякой эукариотной клетки, основу покровов протис-

тов составляет плазмалемма, образованная поверхностной мем-

браной и прилегающим к ней снаружи слоем гликокаликса. По-

верхностная мембрана образована билипидным слоем, и на

электронограммах выглядит как трехслойная структура. Она

обычно содержит внутримембранные частицы, или интеграль-

ные белки. Эти частицы часто образуют правильные агрегаты,

которые выявляются на сколах при расщеплении мембраны.

Назначение этих агрегаций не установлено. В состав гликока-

ликса входят периферические белки, выступающие наружу

хвостовые участки мембранных гликолипидов и гликопротеи-

нов, а также рабочие части интегральных белков. Морфологи-

130

ГЛАВА 4. СТРОЕНИЕ КЛЕТКИ ПРОТИСТОВ

чески он неотделим от мембраны и состоит преимущественно

из полисахаридов и гликопротеинов.

Очень многие протисты покрыты только плазмалеммой, но

существует и немало организмов, обладающих дополнительны-

ми структурами, усложняющими строение покровов, призва-

нными усиливать их защитную функцию или участвовать в ре-

ализации функций движения, хеморецепции, размножения,

поддержания формы клетки, питания, дыхания и энергетиче-

ского обмена. Многообразие покровов протистов очень велико,

Рис. 4.1. Схема строения покровов у протистов на поперечном

срезе клетки. (Ориг.)

А – плазмалемма, Б–Е – надмембранные усложнения покровов:

Б – гликостили, В – чешуйки, Г – клеточная стенка, Д –

перилемма, Е – домик, или лорика; Ж–Н – субмембранные

усложнения покровов: Ж – тубулемма, З – гребенчатая

тубулемма, И – перипласт, К – кутикула эвгленовых, Л –

двойная мембрана апузомонад, М – пелликула, Н – тека, или

амфиесма. а – альвеола, бп – белковая полоска, д – домик, гл –

гликокаликс, гс – гликостили, кс – клеточная стенка, мт –

микротрубочки, пл – перилемма, пм – плазматическая мембра-

на, тп – текальная пластинка, ч – чешуйки.