Лабораторные работы и задачи по биохимии, практическое пособие

Подождите немного. Документ загружается.

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ВОРОНЕЖСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

ЛАБОРАТОРНЫЕ РАБОТЫ И ЗАДАЧИ ПО БИОХИМИИ

Практическое пособие

по специальностям «Биология» (011600), «Фармация» (040500)

Воронеж

2003

Утверждено научно-методическим советом биолого-почвенного

факультета, протокол № 10 от 13.11.02

Составители : Матасова Л.В .,

Попова Т .Н.,

Текунова Н.А.,

Семенихина А . В .

Подготовлено на кафедре аналитической и медицинской биохимии и

микробиологии биолого-почвенного факультета Воронежского

государственного университета.

Рекомендуется для студентов 3 курса вечернего отделения биолого-

почвенного факультета и студентов 2 и 3 курса фармацевтического

факультета.

СОДЕРЖАНИЕ

СОДЕРЖАНИЕ....................................................................................................3

ВВЕДЕНИЕ ..........................................................................................................3

Работа 1. Цветные реакции на белки..................................................................4

Работа 2. Осаждение белков ................................................................................5

Работа 3. Определение изоэлектрической точки белков ...................................6

Задачи по теме «Аминокислоты и белки» ..........................................................7

Работа 4. Влияние температуры , активаторов и ингибиторов на скорость

ферментативной биохимической реакции. Определение специфичности

амилазы слюны .....................................................................................................9

Работа 5. Определение константы Михаэлиса и максимальной скорости

ферментативной реакции...................................................................................10

Работа 6. Определение типа и константы ингибирования...............................12

Работа 7. Ферменты поджелудочной железы . Определение активности

амилазы в сыворотке крови...............................................................................13

Работа 8. Метаболизм глюкозы в организме человека и его нарушения.

Определение концентрации глюкозы в сыворотке крови и моче.

Качественные реакции на кетоновые тела ........................................................17

Работа 9. Обмен холестерина в организме человека и его нарушения.

Определение концентрации холестерина в сыворотке крови.........................22

Работа 10. Методы определения и классификация витаминов .

Колориметрический метод определения аскорбиновой кислоты в плазме....26

Задачи по теме «Витамины»..............................................................................28

Работа 11. Количественное определение пировиноградной кислоты в крови

колориметрическим методом (по Умбрайту )...................................................31

Работа 12. Биологическое окисление. Количественное определение АТФ и

креатинфосфата мышц.......................................................................................32

Задачи по теме «Метаболизм»..........................................................................36

Работа 13. Минеральный обмен в организме человека. Определение

концентрации кальция и хлоридов в сыворотке крови....................................39

Работа 14. Азотистый обмен. Определение концентрации мочевины в

сыворотке крови.................................................................................................45

Работа 15. Определение концентрации креатинина в сыворотке крови и в

моче. Расчет клиренса креатинина....................................................................48

Работа 16. Механизм действия адреналина. Определение адреналина в

сыворотке крови.................................................................................................51

Задание по теме «Перенос генетической информации» ..................................53

ЛИТЕРАТУРА ....................................................................................................54

ВВЕДЕНИЕ

Биохимия (греческое bios - жизнь) - это наука о молекулярных основах

жизни. Она изучает химический состав организмов , превращение веществ и

энергии, которое осуществляется в процессе их жизнедеятельности . Вопросы

и задачи , представленные в данном методическом пособии, призваны

акцентировать внимание студента на основных вопросах учебной

программы, вызвать интерес к познанию этой увлекательной области науки.

Лабораторные работы дают возможность в ходе их выполнения освоить

основные приемы выделения и количественного определения биомолекул и

научиться оценивать информативность биохимических тестов при некоторых

патологических состояниях

Работа 1. Цветные реакции на белки

1. Биуретовая реакция: обусловлена наличием пептидных связей в

белках и полипептидах , благодаря которым в щелочной среде с солями меди

образуют Си— Nа-комплексную соль полипептидов и белков сине-

фиолетового цвета. К 1 мл раствора белка добавляют 1 мл 10%-го раствора

NaOH и 1-2 капли 1%-го раствора CuSO

. Появляется фиолетовое

окрашивание.

2. Ксантопротеиновая реакция основана на способности

присутствующих в молекуле белка ароматических аминокислот (тирозина,

триптофана и фенилаланина) образовывать с концентрированной азотной

кислотой при подогревании желтоокрашенные нитросоединения. К 1 мл

раствора белка приливают 0,5 мл концентрированной HNO

. Выпадает

осадок , который при подогревании частично растворяется, при этом раствор

приобретает желтую окраску. Если после охлаждения в пробирку добавить 1

мл концентрированного раствора аммиака, то желтое окрашивание

переходит в оранжевое вследствие превращения нитропроизводных

циклических аминокислот в соли хиноидной структуры . Фенилаланин лучше

нитруется при добавлении смеси концентрированных НNО

и H

3. Реакция на триптофан. К 1 мл раствора белка приливают 2 мл

концентрированной НСl и нагревают, не доводя до кипения, чтобы не

улетучился хлористый водород . Осадок , выпавший при добавлении кислоты ,

при подогревании растворяется, и жидкость окрашивается в фиолетовый

цвет. Эта реакция указывает на наличие в яичном белке не только

триптофана, но и углеводов : триптофан реагирует с оксиметилфурфуролом ,

образующимся из моносахаридов , в результате чего возникает фиолетово-

красное соединение.

5. Реакция с ацетатом свинца. Положительная реакция указывает на

наличие в белковой молекуле атомов серы цистеина и цистина. К 1 мл

раствора белка добавляют 2 мл 1%-го NaOH, перемешивают, кипятят 2-3

мин., затем прибавляют 1-2 капли 5%-го (CH

COO)

Pb и продолжают

нагревать до выпадения черного осадка PbS. Реакция идет по следующему

уравнению:

R-SH+2NaOH → Na

S+R-OH+H

S+(CH

COO)

→

РbS+2СНзСО ONa

6. Нингидриновая реакция указывает на присутствие в аминокислотах

α - аминогрупп. При этом происходит выделение СО

. К 0,2-0,5 мл раствора

аминокислот прибавляют 2-3 капли 0,1 %-го ацетонового раствора

нингидрина, кипятят 2 мин. Появляется сине- фиолетовое окрашенное

соединение вследствие взаимодействия двух молекул нингидрина с

аминокислотой .

Работа 2. Осаждение белков

Характерным свойством белковых веществ является их способность

осаждаться из растворов под воздействием различных факторов среды .

Осаждение белков нейтральными солями («высаливание» ), например

(NH

)

, NaCL, Nа

, нашло широкое применение в их очистке,

поскольку после удаления соли белки восстанавливают свои биологические

функции. При нагревании белков , добавлении солей тяжелых металлов ,

экстремальных значениях рН и действии других факторов белки выпадают в

осадок вследствие денатурации. При этом их ковалентная структура не

претерпевает изменений, но биологическая функция у большинства белков

утрачивается. Реакции осаждения белков используют в биохимической

практике для удаления белковых веществ и для определения их содержания в

биологическом материале .

1. Осаждение белков кипячением . В пробирку наливают 1 мл раствора

белка и нагревают до кипения. Происходит денатурация белка. Более полное

осаждение белка достигается слабым подкислением его уксусной кислотой

или добавлением других электролитов : в 1 мл раствора белка добавляют 1-2

капли 1 %-го раствора уксусной кислоты и нагревают. Выпадает осадок

белка. Явление денатурации (потеря нативных свойств ) вызывается

глубокими нарушениями структуры белка.

2. Осаждение белков солями тяжелых металлов . Белки при

взаимодействии с солями тяжелых металлов адсорбируют их , образуя

нерастворимые солеобразные и комплексные соединения.

К 1 мл раствора белка приливают по каплям 5%-й раствор CuSO

Появляется осадок , растворяющийся в избытке реактива.

К 1 мл белка приливают по каплям 5%-й раствор ацетата свинца.

Появляется осадок , растворяющийся в избытке реактива.

3. Осаждение белков реактивами на алкалоиды . К группе реактивов на

алкалоиды принадлежит таннин, пикриновая кислота, железисто-

синеродистая кислота, растворы йодной ртути в йодистом калии и др.

Способность белков осаждаться теми же реактивами, что и алкалоиды ,

объясняется образованием нерастворимых солеобразных соединений с

основными азотистыми группами: пиррольными, индольными,

имидазольными. В этом соединении белок является катионом , поэтому

реакция протекает в кислой среде.

К 1 мл слегка подкисленного уксусной кислотой раствора белка

приливают 3-5 капель насыщенного раствора пикриновой кислоты . Выпадает

осадок белка.

К 1 мл раствора белка, подкисленного 1-2 каплями раствора уксусной

кислоты , приливают 3-5 капель раствора таннина. Выпадает осадок белка.

4. Осаждение белка кислотами. Проба Геллера. Реакция основана на

дегидратации и денатурации белка при действии крепкой азотной кислоты . К

1-2 мл концентрированной HNO

осторожно, по стенкам (в наклонном

положении пробирки) приливают пипеткой 0,5-1 мл раствора белка. На

границе двух соприкасающихся жидкостей образуется белое кольцо

свернувшегося белка.

К 1 мл раствора белка добавляют несколько капель 20%-го раствора

сульфосалициловой кислоты , перемешивают. Выпадает осадок белка.

К 1 мл раствора белка приливают 1 мл 10%-го раствора

трихлоруксусной кислоты . Выпадает осадок белка.

5. Осаждение белков сульфатом аммония. К 2 мл раствора белка

приливают 2 мл насыщенного раствора сульфата аммония и перемешивают.

Выпадает осадок глобулинов вследствие дегидратации и нейтрализации

заряда белков . Через 5 мин осадок отделяют центрифугированием и к

надосадочной жидкости добавляют растертый в порошок сульфат аммония

до полного насыщения. Выпадает осадок альбумина. Полноту осаждения

белков проверяют биуретовой реакцией . Для того, чтобы проверить

обратимость реакции осаждения, к осадку белка приливают равный

содержимому пробирки объем дистиллированной воды и перемешивают.

Растворение осадка свидетельствует об обратимости этого процесса и

сохранении нативной структуры белка.

6. Осаждение белков вольфраматом натрия. К 1-2 мл раствора белка

прибавляют 3-5 капель 5%-го раствора вольфрамата натрия и 3-5 капель

0,4 н. раствора серной кислоты . Выпадает осадок белков . Полноту осаждения

белков проверяют биуретовой реакцией .

Работа 3. Определение изоэлектрической точки белков

Вследствие наличия способных к ионизации групп (концевых групп -

СООН и -NH

, а также боковых групп дикарбоновых и диаминокислот)

молекулы белков обладают электрическим зарядом . В кислой среде белки

имеют суммарный положительный заряд , в щелочной среде –

отрицательный. При определенном значении рН среды величина

положительных и отрицательных зарядов становится одинаковой . Значение

рН , при котором белок имеет минимальный электрический заряд , называют

изоэлектрической точкой (ИЭТ ). В этом состоянии белки наименее

устойчивы в растворе и выпадают в осадок , имеют наименьшее значение

вязкости , растворимости , степени гидратации и электропроводности , не

передвигаются к электрическим полюсам . Каждый белок имеет свое

значение ИЭТ . Существует ряд способов определения ИЭТ белков .

Реактивы : 0,2%-й раствор казеина или 0,5%-й раствор желатина

(растворяют 0,2 г казеина или 0,5 г желатина при подогревании в 10 мл 1 н.

раствора ацетата натрия и доводят водой до 100 мл).

Ход работы . В каждую из 8 пронумерованных пробирок по

нижеприведенной схеме (табл.1) вносят соответствующие растворы . В

каждую пробирку добавляют 0,5 мл 96% этанола . В той пробирке, где

обнаружится максимальное помутнение среды (визуально или

нефелометрически), рН раствора будет соответствовать ИЭТ белка. Отметьте

степень помутнения знаками «», « +», « ++» или « ++» в таблице.

Таблица 1.

Приготовление растворов с заданным рН

Реагенты , мл Номера пробирок

1 2 3 4 5 6 7 8

О 8,4 7,75 8,75 8,5 8,0 7,0 5,0 1,0

0,01 н. СН

СООН 0,6 1,25 - - - - - -

0,1 н. СН

СООН - - 0,25 0,5 1,0 2,0 4,0 8,0

Раствор белка 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

pH 5,8 5,6 5,3 5,0 4,7 4,4 4,1 3,8

Степень

помутнения

Задачи по теме «Аминокислоты и белки»

Вариант № 1

а) Изобразите полную структуру следующих пептидов

(ионизированные группы изобразите в протонированном состоянии): 1) Met-

Glu-Gly-His; 2) Phe-Asp-Phe-Thr.

б) Биологическая оценка белков как компонентов пищи. Основным

критерием оценки белков в питании является наличие в них незаменимых

аминокислот. Дайте биологическую оценку следующим гексапептидам :

1) Glu-Asp-Pro-Ala-Cys-Gly;

2) Glu-Asp-Pro-Ala-Val-Cys;

3) Glu-Val-Pro-Thr-Ala-Gly;

в) Растворимость полипептидов зависит от степени полярности

группы , особенно от числа ионизируемых групп: чем больше ионизируемых

групп, тем выше растворимость полипептида. Какой полипептид из каждой

пары приведенных ниже более растворим в данных условиях ?

1) (Gly)

или (Glu)

при рН 7;

2) (Lys-Ala)

или (Ile-Met)

при рН 3,0

г) Почему подкисшее молоко свертывается при кипячении? Что нужно

сделать, чтобы избежать этого? Почему не свертывается свежее молоко?

Вариант № 2

а) Изобразите полную структуру следующих пептидов

(ионизированные группы изобразите в протонированном состоянии): 1) Met-

Leu-Val-Pro; 2) Phe-Ala-Trp-Tyr.

б) Биологическая оценка белков как компонентов пищи. Основным

критерием оценки белков в питании является наличие в них незаменимых

аминокислот. Дайте биологическую оценку следующим гексапептидам :

1) Glu-Asp-Pro-Ala-Cys-Gly;

2) Glu-Asp-Pro-Ala-Val-Cys;

3) Glu-Val-Pro-Thr-Ala-Gly;

в) Электрофорез аминокислот на бумаге. Каплю раствора, содержащего

смесь лейцина, аспарагиновой кислоты , аргинина, нанесли на полоску

бумаги, предварительно смоченную буфером с рН 6, и к концам полоски

приложили электрическое напряжение. Какая аминокислота будет двигаться

к аноду? Какая к катоду? Какая останется на стартовой точке или вблизи нее?

г) Функции белков . При уменьшении концентрации общего белка в

крови у человека повышается восприимчивость к инфекциям , появляются

отеки в тканях , нарушается кислотно-основное состояние организма и обмен

веществ . Объясните причину этих явлений.

Вариант № 3

а) Изобразите полную структуру следующих пептидов

(ионизированные группы изобразите в протонированном состоянии): 1) Tyr-

Cys-Val-Lis; 2) Thr-Asn-Met-Arg.

б) Биологическая оценка белков как компонентов пищи. Основным

критерием оценки белков в питании является наличие в них незаменимых

аминокислот. Дайте биологическую оценку следующим гексапептидам :

1) Gln-Cys-Pro-Thr-Ala-Ile;

2) Val-Pro-Lys-Thr-His-Phe;

в) Пепсин желудочного сока (рН 1,5) имеет изоэлектрическую точку

ИЭТ =1, т.е. намного ниже, чем другие белки. Какие функциональные группы

должны быть в пепсине в относительно большом числе , чтобы этот фермент

мог иметь такую низкую ИЭТ ? Какие аминокислоты имеют эту группу в

своем составе? Напишите структурные формулы этих аминокислот.

г) При химическом способе завивки в начале восстанавливают, а затем

окисляют тиоловые (-SH) группы белков , входящих в состав волос. Исходя

из особенностей пространственного строения белков волос, объясните, какие

могут происходить изменения в структуре белка при этом ?

Вариант № 4

а) Полипептиды называют путем перечисления аминокислот (от N-

конца к C-концу ), заменяя в случае большинства аминокислот –ин (-ат )

суффиксом –ил. Название последней аминокислоты не изменяется.

Нарисуйте структуру глициларгинилтреонилцистеина при рН 7.

б) Биологическая оценка белков как компонентов пищи. Основным

критерием оценки белков в питании является наличие в них незаменимых

аминокислот. Дайте биологическую оценку следующим гексапептидам :

1) Glu-Val-Pro-Thr-Ala-Gly;

2) Val-Pro-Lys-Thr-Ala-Phe;

3) Val-Leu-Met-Thr-Trp-Lys.

в) Растворимость полипептидов зависит от степени полярности

группы , особенно от числа ионизируемых групп: чем больше ионизируемых

групп, тем выше растворимость полипептида. Какой полипептид более

растворим в приведенных условиях ?

1) (Ala-Asp-Gly)

или (Asn-Ser-Arg)

при рН 10,0;

2) (Ala-Asp-Gly)

или (Asn-Ser-Arg)

при рН 3,0.

г) Из смеси белков необходимо выделить белок с изоэлектрической

точкой 9,0. Остальные белки имеют изоэлектрическую точку около 6,0.

Опишите способ получения этого белка.

Работа 4. Влияние температуры , активаторов и ингибиторов на

скорость ферментативной биохимической реакции. Определение

специфичности амилазы слюны.

Влияние температуры на скорость ферментативной реакции

В термолабильности ферментов можно убедиться на примере действия

амилазы слюны . Фермент амилаза осуществляет гидролиз крахмала через

промежуточные продукты распада (декстрины ) до мальтозы .

Нерасщепленный крахмал с йодом дает синее окрашивание, а декстрины в

зависимости от величины своих частиц дают с йодом фиолетовую, красно-

бурую, оранжевую окраску или вообще не окрашиваются. Мальтоза,

конечный продукт распада крахмала , не окрашивается раствором йода.

Таким образом , по окраске раствора йода можно судить о степени гидролиза

крахмала .

Ход работы . В центрифужную пробирку собирают 1 мл слюны и

доводят дистиллированной водой до 10 мл. Затем берут 4 пробирки: в

каждую помещают по 1 мл 1 %-го раствора крахмала и по 1 мл разведенной

слюны . Пробирки помещают на 15 минут: первую - в термостат (при 37

С);

вторую – в ледяную баню (при 4° С); третью – на кипящую водяную баню

(при 100° С); четвертую оставляют при комнатной температуре (+20° С).

Через 15 минут пробирки охлаждают и в каждую пробирку добавляют по 2

капли йода. По интенсивности и цвету возникающего окрашивания судят о

скорости и глубине протекания ферментативной реакции гидролиза крахмала

амилазной слюны . Делают вывод о влиянии температуры на скорость

ферментативной биохимической реакции.

Специфичность действия ферментов

По специфичности действия ферменты делят на две группы :

обладающие абсолютной специфичностью и с относительной

специфичностью . Относительная специфичность наблюдается, когда

фермент катализирует реакции одного типа с более чем одним

структуроподобным субстратом . Абсолютная специфичность проявляется

тогда, когда фермент действует лишь на единственное вещество и

катализирует лишь определенное превращение данного вещества. Например ,

фермент уреаза катализирует гидролиз мочевины ; сахараза катализирует

превращение только сахарозы . Стереоспецифичность – фермент

катализирует превращение только одного из возможных стереоизомеров

субстрата.

Ход работы . В две пробирки наливают по 1 мл раствора амилазы

(разведенной слюны ) и в первую добавляют 1 мл раствора крахмала , а во

вторую – 1 мл раствора сахарозы . Пробы выдерживают в термостате 15 мин.

при 37º С. Затем с первой пробой (субстрат + крахмал) проделывают две

реакции: пробу Троммера и реакцию с раствором йода (к 5 каплям

инкубационной смеси добавляют 1-2 капли раствора йода). Со второй пробой

проделывают реакцию Троммера.

Реакция Троммера: в пробирку добавляют 0,5 мл р-ра сульфата меди и

прибавляют по каплям (до появления осадка) раствор гидроксида натрия.

Далее пробирку с содержимым нагревают и наблюдают за появлением

окраски. Наличие кирпично-красного окрашивания указывает на присутствие

глюкозы . Сахароза не имеет свободной альдегидной группы , поэтому не дает

реакции Троммера. Реакция Троммера может быть положительной только в

том случае, если сахароза расщепиться на свои составные части – глюкозу и

фруктозу.

Делают вывод о специфичности амилазы – гидролизует ли амилаза

сахарозу, или только крахмал?

Влияние активаторов и ингибиторов на активность амилазы слюны

Ход работы

. В одну пробирку вносят 1 мл H

O, во вторую – 0,8 мл

воды и 0,2 мл 1 %-го раствора NaCl, в третью – 0,8 мл воды и 0,2 мл раствора

сульфата меди (II). 2. В каждую пробирку добавляют по 2 мл разведенной

(1:10) слюны , содержимое пробирки перемешивают, добавляют по 0,5 мл р-

ра крахмала и оставляют стоять при комнатной температуре. 3. В это время

готовят три пробирки с водой (по 1 мл в каждой ), подкрашенной каплей

раствора йода, и добавляют в них по 2-3 капли содержимого опытных проб.

Наблюдают окрашивание в зависимости от степени расщепления крахмала

амилазой . В первой пробирке появляется фиолетовая или красно-бурая

окраска, во второй пробирке, где ионы хлора играют роль активатора,

появляется желтая окраска, в третьей пробирке, где ионы меди тормозят

действие амилазы , окраска остаe тся синей . Если описанной картины не

наблюдается, то опыт повторяют через 10 мин.

Записывают в тетрадь полученные наблюдения. Делают выводы о

характере влияния хлорида натрия и сульфата меди на активность амилазы .

Работа 5. Определение константы Михаэлиса и максимальной

скорости ферментативной реакции

При постоянной концентрации фермента кривая зависимости скорости

катализируемой им реакции от концентрации субстрата имеет