Рубин А.Б. Современные методы биофизических исследований (Практикум по биофизике)

Подождите немного. Документ загружается.

где ф — электротонический потенциал, измеряемый по отношению

уровню потенциала

покоя,

х — расстояние по оси клетки. К за-

висит от проводимости мембраны, а также электропроводности

наружной и внутренней среды:

где г

— сопротивление мембраны на единицу длины; r

и г

—

сопротивление внутренней и внешней среды на единицу длины клет-

ки.

При г

< /-; X =

rjr

Решение уравнения

(IV.4.1)

имеет вид

ср =

ехр(

—

х/'к).

Видно, что электротонический потенциал уменьшается с увеличе-

нием

расстояния, ослабляясь до ф

/е при х = X.

При

анализе переходных процессов, вызванных пропусканием

импульсов тока,

следует

учитывать, что электротонический потен-

циал является функцией

двух

переменных: координаты х и вре-

мени

/. Распределение электротонического потенциала во времени

по

длине клетки описывается уравнением

ф ф т дер

а*

где т -•• /\,С

— постоянная времени клеточной мембраны.

На

основе кабельной теории разработан относительно простой

метод измерения сопротивления и емкости цилиндрической клетки

конечных размеров с помощью

двух

микроэлектродов. В середи-

ну клетки, общая длина которой составляет 21, вводят токовый

микроэлектрод; точке инъекции тока

соответствует

координата

-— 0. Если ввести измерительный микроэлектрод на расстоянии

0,38/ от места нахождения токового электрода, то полное сопротив-

ление клеточной мембраны

будет

определяться выражением, по

форме совпадающим с законом Ома: R = rjl — U (x

) I (0), где

U (*кр) — электротонический потенциал, измеряемый на критиче-

ском расстоянии х = 0,38 /; / (0) — сила тока, пропускаемого

через микроэлектрод. Сопротивление мембраны на единицу длины

имеет размерность Ом-см, R выражено в омах. Из кинетической

кривой

нарастания электротонического потенциала в точке х =

— 0,38 / при пропускании прямоугольного импульса тока можно не-

посредственно оценить постоянную времени мембраны (т). За время

т электротонический потенциал достигает 0,63 максимального зна-

чения.

Критическое расстояние 0.38/ рассчитано для клеток харо-

вых водорослей, у которых 1/К —

0,5ч-3,0.

Значение x

несколько

варьирует в зависимости от сопротивления торцов клетки.

Для измерения пассивных электрических свойств волокон мож-

но

использовать и

другие

методы, однако в этом

случае

необходимо

равномерное протекание тока через клеточную поверхность. Для

этой

цели в крупные нервные волокна вводят центральный осевой

электрод, а снаружи помещают

другой

металлический электрод,

161

что обеспечивает эквипотенциальность внутренней

наружной

среды.

Метод

изолирующих мостиков.

Введение осевого электрода

на

всю длину клетки представляет сложную,

иногда

невыполнимую

задачу.

Гораздо проще создать равномерную плотность тока

на не-

большом участке, отделенном

от

остальной поверхности клетки

изо-

лирующими перегородками. Этот прием широко используют

при

работе

клетками

харовых

водорослей. Длинную изолированную

клетку помещают

камеру

тремя отсеками. Промежутки

между

отсеками заполнены вазелином, который обеспечивает электриче-

скую изоляцию

между

растворами

центральном

боковых отсе-

ках

(рис. 57). При

наложении разности потенциалов

между

боко-

выми электродами

электродом, находящимся

центральном отсе-

ке,

путь

тока замыкается через клетку.

Так как

ширина зазора

меж-

ду изолирующими перегородками

(2—3 мм)

существенно меньше

постоянной

длины

плотность мембранного тока

на

центральном

изолированном сегменте клетки

будет

равномерной. Мембранный

потенциал изолированного участка

изменения, вызванные

про-

пусканием тока, регистрируют

помощью единственного внутри-

клеточного микроэлектрода.

опытах

мышечными волокнами

в ка-

честве

изолирующей среды используют раствор сахарозы. Примене-

ние

изолирующих мостиков позволяет осуществлять электрическую

стимуляцию возбудимых клеток, измерять

их

сопротивление

и ем-

кость.

Если центральный участок клетки харовой водоросли предвари-

тельно деполяризовать

0,1 М

раствором

KG. то.

пропуская

на

этом

участке

входящий

ток,

можно наблюдать гиперполяризационный

ответ, заключающихся

скачкообразном увеличении мембранного

сопротивления

переходе

мембранного потенциала

на

более отрицательный уровень.

Изменение

сопротивления

мембраны

при

гиперполяри-

зационном

ответе

(в

общем

случае

при

пропускании

по-

стоянного тока) измеряют

путем

наложения

на

фикси-

рованный

ток

дополнительной

низкоамплитудной перемен-

ной

составляющей. При проте-

кании

через мембрану элек-

трического тока

мембран-

ный

потенциал можно пред-

ставить

виде суммы омиче-

ского падения напряжения

эффективной

ЭДС

мембраны

Е: V = //?„ + Е,

Рис.

57.

Трансклеточное пропускание

то-

ка

помощью изолирующих мостиков:

Мэ

—

измерительный микроэлектрод,

ЭС

электрод сравнения,

V -

измеряемый

мем

бранный

потенциал.

/ -

регистрируемый тран-

смембранный

ток, Ян —

сопротивление

на

грузки

(~1 ГОм), Е-

генератор прямоуголь-

ных импульсов

162

где

—

мембранное сопро-

тивление. Сопротивление

или

обратную величину

—

проводимость

—

рассчиты-

вают

по

закону

Ома: R

-i = AWA/, где AV —

смещения потенциала клетки,

вызываемые слабыми импуль-

сами тока

А/.

Определение

мембранной

емкости.

Эквивалентная

схе-

1ш

Рис.

58.

Эквивалентная

схема

измери-

тельной

токовой цепей

методе

изо-

лирующих

мостиков

ма рассмотренной цепи

по-

казана

на рис. 58.

Здесь

и С

обозначают сопротивление

емкость мембраны,

—

резистор, стабилизирующий

ток в

цепи.

Сопротивление утечки

отражает протекание небольшой

части тока

обход

клетки

по

границе

изолирующим слоем.

Сопротивление наружной среды

электрода сравнения, находя-

щегося

центральном отсеке, объединены

на

схеме

резистор

Включение напряжения

сопровождается заряжением емкости

мембраны.

При

условии,

что R

> R

и R

> R

характерное

время экспоненты

равно /?

При

плохом качестве изоляции

между

отсеками камеры (низкое

)

экспериментальное значение

окажется заниженным

по

сравнению

постоянной времени мембра-

ны

. Фазе плавного нарастания потенциала

до

максимума

может предшествовать небольшой быстрый скачок потенциала, обус-

ловленный падением напряжения

на

суммарном сопротивлении

среды

внешнего электрода сравнения

Падение напряжения

на

внешнем электроде сравнения

накладывается

на

измеряемый

потенциал мембраны,

что

огра-

ничивает точность измерений

со-

противления

емкости

по рас-

смотренным выше схемам. Ошиб-

ку измерений можно дополни-

тельно понизить, разделив

пол-

ностью токовую

измеритель-

ную цепи.

Для

этого вводят

до-

полнительный электрод,

элек-

трод сравнения изолируют

от

общего заземления

(рис. 59). _

сп

Рис. 59.

Измерение электрических

Стандартный прием СОСТОИТ

парам

ров клетки четырехэлектрод-

том,

что

потенциалы измери-

тельного микроэлектрода

электрода сравнения измеряют

двумя

предусилителями,

затем

находят разностный сигнал.

р рр

ным

методом

(с

использованием

двух

микроэлектродов):

2 —

токовые электроды.

3, 4 —

измери-

тельные электроды,

5 -

электрометриче-

ские усилители, 6—дифференциальный

уси-

литель,

7 —

регистратор

тока,

/?н —

рези-

стор, стабилизирующий

ток в

цепи

163

Измерения

на

перемен-

ном

токе.

Для тестирова-

ния

пассивных электриче-

ских характеристик кле-

точных мембран наряду с

постоянным

током исполь-

зуют

переменный ток раз-

личных частот. Оба подхо-

да — анализ изменений по-

тенциала в

ответ

на про-

пускание ступени тока и

построение частотных за-

висимостей импеданса кле-

ток

— достаточно схожи,

хотя

измерения на перемен-

ном

токе в широком диапа-

зоне частот

несут

большую

информацию

об эквивалент-

ной

электрической

схеме

мембранной системы и механизмах ионного транспорта.

Для измерений импеданса с помощью четырехэлектродной схе-

мы (рис. 59) через клетку пропускают переменный ток известного

значения

и регистрируют падение напряжения на мембране, созда-

ваемое этим током.

Импедансом

мембраны!

называют ее комплексное

сопротивление для переменного тока частоты ш:

= д« +

1Л.Ц).

В простейшем

случае

частотная зависимость импеданса клетки

описывается эквивалентной схемой, включающей параллельно сое-

диненные элементы R и С, а также последовательно соединенное со-

противление R

внутренней и внешней среды (рис. 60, А). Импеданс

параллельного участка цепи Z'. определяемый условием 1/Z' --

1/R + коС,

Рис.

60.

Частотная зависимость импеданса

мембраны

харовых

водорослей.

А —

экви-

валентная

схема

мембраны

последователь-

ным

сопротивлением

)

внешней среды;

—

зависимость модуля импеданса

)

от частоты переменного тока, пропускаемо-

го через мембрану

|+(О

— I •

учетом

действительная часть импеданса всей цепи составит

В эксперименте измеряется

модуль

импеданса, численно равный

сумме

векторов R

и Х

: Z

•=

ния

для

, получим

Х'^. Подставляя выраже-

(IV.4.2)

164

Зависимость модуля импеданса от частоты, описываемая этим

уравнением, показана на рис. 60, Б. На высоких

частотах

- R п.

все

напряжение падает на водном растворе, окружаю-

щем клетку. На постоянном токе Z

= R

+ R- Частотно-зави-

симый спад импеданса определяется ростом проводимости кон-

денсатора с повышением частоты. Для линейного участка спада

в логарифмических координатах угловой коэффициент близок

— 1, т. е. при возрастании частоты на один порядок происходит

10-кратное уменьшение импеданса. Соблюдение данного условия

эксперименте

свидетельствует

об адекватности упрощенной

эквивалентной схемы мембраны для рассматриваемого частотного

диапазона.

По

измерениям импеданса на линейном

участке

спада Z

можно

рассчитать емкость мембраны. Формула для расчета получается

из

соотношения

(IV.4.2):

to/?

Простейшая эквивалентная

схема

клетки часто оказывается

недостаточной для объяснения электрических свойств клеток на

переменном токе. В соответствии с этим кривые зарядки мембранной

емкости при пропускании постоянного тока в ряде

случаев

лучше

аппроксимируются суммой

двух

экспонент. Для интерпретации

свойств растительных клеток привлекают сложные эквивалентные

схемы. Это обусловлено существованием

двух

последовательно

расположенных мембран — плазмалеммы и тонопласта, а также

неоднородностью свойств мембраны в пределах одной клетки. Про-

странственная неоднородность емкости и проводимости установлена

для клеток

харовых

водорослей, которые в определенных условиях

формируют у поверхности чередующиеся кольцевые зоны выделе-

ния

и поглощения Н

. Дополнительным фактором, объясняющим

расхождение частотных характеристик целой клетки и простей-

шего электрического аналога,

служит

зависимость емкости клеточ-

ных мембран от частоты пропускаемого тока.

Ионные

токи

возбудимых

мембран

Современные представления о механизмах транспорта ионов через

мембраны возбудимых клеток сложились главным образом на осно-

ве данных, полученных

методом

фиксации

напряжения.

Сущность

метода состоит в измерении токов, протекающих через клеточную

мембрану в условиях, когда мембранный потенциал автоматически

с помощью усилителя обратной связи поддерживается на любом

заданном уровне.

В покоящейся клетке ток через мембрану не

течет,

так как сум-

ма токов, переносимых ионами разных видов, равна нулю. При сме-

165

щении

потенциала от уровня потенциала покоя возникает трансмем-

бранный

ток, который состоит из емкостного и ионного токов:

где /

— суммарный ток;

dV/dt

— ток зарядки мембранной

емкости; / — ионный ток. Типичный эксперимент по фиксации

напряжения

состоит в том, что разность потенциалов

между

внут-

ренней

и наружной средой клетки изменяют скачком до нового зна-

чения

и, поддерживая потенциал на заданном уровне, регистриру-

ют динамику электрического тока, текущего через мембрану. В мо-

мент ступенчатого переключения потенциала происходит быстрая

перезарядка С

; при этом регистрируется волна емкостного тока.

За

доли или сотые доли миллисекунды устанавливается новое зна-

чение мембранного потенциала, емкостный ток прекращается

(так

как

dV/dt

= 0) и измеряется только ток, обусловленный дви-

жением ионов через мембрану.

Компоненты

ионного

тока.

В классических исследованиях

А. Ходжкина и А. Хаксли, выполненных на гигантских аксонах

кальмара, установлено, что суммарный ионный ток, текущий через

мембрану после ступенчатой деполяризации, складывается из

трех

компонентов: быстрого Иа

-тока, задержанного

-тока

постоянного во времени и небольшого по значению

тока

утечки.

Проводимость утечки не зависит от мембранного потенциала.

Ходжкин и Хаксли объясняли появление тока утечки движением

ионов

через поврежденную область мембраны. Для измерения то-

ка

утечки обычно сдвигают мембранный потенциал в сторону гипер-

поляризации.

В этом

случае

после кратковременной волны емкост-

ного тока регистрируется постоянный ток утечки (рис. 61). При сту-

Рпс. 61.

Изменения

мембранного

тока

(7) в

аксоне

при

наложении

гнперпо-

ляризующего

импульса

(А) и

деполяризующей

ступени

напряжения

(й)

11|>и

гиперполиризации

мембраны мосле волны

емкостного

тока

регистрируется

постоян-

ный

входящий ток

утечки;

при деполяризации развивается ионный ток. включающий на

фиевый и калиевый

компоненты,

а также постоянный по величине ток утечки /> / •-

время.

/ \т

пиковое

1Наченне \а

-тока.

/ (

-стационарное

«наченне калиевого

166

Рис.

62.

Эквивалентная

схе-

ма мембраны аксона:

и 1 —

обозначения наружного

раствора

аксоплазмы;

емкость мембраны;

l/#Na

1.7?

к —

проводимости мембра-

ны

для Na+ и К+. ЧНу — "Р"

водимость утечки;

£м

и £^ —

равновесные потенциалы

для

Na+

и К

;

£у--потенциал

ре

версии тока утечки; V—напря

жение

на

мембране

пенчатон деполяризации помимо тока

угечки развиваются токи

Na+ и К

характеризующиеся сложной кинетикой.

Натриевый

калиевый токи разви-

ваются независимо, поэтому

помощью

различных приемов

удается

разделить

суммарную кривую ионного тока

на

компоненты

охарактеризовать

по от-

дельности свойства системы

- и

проводимости.

Так, при

замене

среде

на

непроникающие катионы

холина Ыа

-компонент ионного тока

практически исчезает

регистрируется

только К

-ток, имеющий выходящее

направление

Суммарный ионный

ток в

аксонах

удается

разделить

на

компоненты

и с

помощью

блокаторов

Ыа

-каналов.

Натриевый

ток

подавляется тетродотоксином, К

-ток исчезает

при

введении внутрь аксона тетраэтиламмония, высоких концентраций

Cs~.

также

при

обработке волокон 4-аминопиридином.

помощью

блокаторов

- и

-токов

удалось

вычленить

Са

-токи

мемб-

ране нейронов

подробно охарактеризовать свойства Са

-кана-

лов.

блокированию ионных токов прибегают

и для

вычленения

воротных токов, связанных

открыванием каналов.

Потенциал

реверсии ионного тока. В

опытах

на

аксонах каль-

мара установлено,

что

потенциал,

при

котором начальный ионный

гок

изменяет свое направление, близок

по

величине

равновесному

потенциалу для№

. рассчитываемому

по

формуле Нернста

(IV.1.3).

Этот

результат,

легко объяснимый

на

основании принятой эквива-

лентной схемы мембраны

(рис. 62),

показывает,

что в том

случае,

когда мембранный потенциал равен равновесному потенциалу

Na+(£

движущая сила

для

Na+ равна нулю. Поэтому действую-

щую силу, определяющую направление движения ионов через

мем-

брану, можно выразить

виде разности

между

мембранным

по-

тенциалом

V и

равновесным потенциалом

для

данного иона

£;.

Для Na+ действующая сила равна

V — £

Ионные

проводимости возбудимой мембраны. Так как

после

ступенчатого смещения мембранного потенциала

на

заданный

уро-

вень действующая сила постоянна, очевидно,

что

изменения тока

Na+

обусловлены изменением проводимости мембраны

для Na

fsa

gNa

(

V —

£ыа).

Таким

образом, если суммарная кривая мембранного тока разделе-

на

компоненты,

то

можно проследить изменения проводимости

мембраны

для Na+ и К

во

времени:

gNa

a/(V

—

);

дк =

167

Сумма парциальных ионных проводимостей

равна общей

про-

водимости мембраны.

Проводимость

для

иона

определяемую соотношением

g,- =

1\!{V — £;),

называют

хордовой проводимостью. Ее следует от-

личать

от дифференциальной проводимости G;,

определяемой

по уг-

лу наклона вольт-амперной характеристики:

;

= d/j/dV. Их

различие можно рассмотреть

на

примере вольт-амперной кривой

для пикового

тока.

Пусть максимальный входящий

ток

соответствует

пиковому значению

Na-тока

, а

установившийся выходящий

ток

соответствует

стационарно-

му К

-току

(см. рис. 61).

Разделение Na+-

-токов

во

времени подт-

верждено многочисленными опытами. Откладывая значения

У^

и /^ в

виде

зависимости

от

величины фиксируемого мембранного потенциала, получают

соответствующие вольт-амперные характеристики

(рис.

63). Для

произволь-

но

выбранного потенциала

значение

определяется

как

тангенс

угла

наклона

прямой, проведенной

точку

а от

потенциала нулевого тока

. по

отношению

к оси

напряжений. Проводимость

всегда

положительна,

а направление тока (положительным принято считать выходящий

ток)

опре-

деляется знаком разности:

V —

£[yj

Проводимость

dJ^JdV)

определяется наклоном касатель-

ной

вольт-амперной кривой

по

отношению

к оси

потенциалов

Проводи-

мость

G[y|

может принимать

как

положительные,

так и

отрицательные значе-

ния.

Падающему

участку

вольт-амперной характеристики Ыа+-тока соответ-

ствуют

отрицательные значения проводимости G

связи

этим участок

от-

рицательного наклона вольт-амперной кривой называют

участком

отрица-

тельного

сопротивления.

Рис.

63.

Вольт-амперные характеристики

для

пикового Na

-TOKa

(/^

) и ста-

ционарного

-тока

(/^)

хордовая

проводимость.

С —

дифференциальная проводимость, /--ток.

V —

потен-

циал

на

мембране

168

Кинетика ионных токов.

Значения проводимостей

и g

изменяются

во

времени

зависят

от

потенциала.

При

ступенчатой

деполяризации мембраны

быстро возрастает

до

максимума,

затем снижается

до

низкого постоянного уровня.

отличие

от

этого

£к

возрастает

от

низкого уровня

до

стационарного максималь-

ного уровня. Хотя нарастание

происходит гораздо быстрее,

чем

нарастание g&,

оба

процесса развиваются после некоторого периода

задержки.

В мембране

на

единичной площади поверхности содержится

ог-

раниченное число проводящих элементов. Поэтому, если

все

прово-

дящие каналы открыты, достигается максимальный уровень прово-

димости, обозначаемый

и g

для

ионов

Na и К.

Промежуточ-

ные состояния проводимости,

при

которых открыта лишь часть

про-

водящих элементов, удобно представить

виде произведения макси-

мальной проводимости,

на

безразмерные параметры, варьирующие

пределах

от

нуля

до

единицы. Параметры, определяющие уровень

Na+-

проводимости, получили название

т и h;

уровень К

-проводи-

мости определяется параметром

п. При

ступенчатом смещении

мем-

бранного потенциала каждый

из

этих параметров совершает относи-

тельно медленный

переход

новому равновесному значению.

Изменение

т, п и h

можно формально рассматривать

как

следст-

вие перераспределения некоторых заряженных внутримембранных

частиц

между

внутренней

наружной границами мембраны под дей-

ствием электрического поля. Используя

такую

интерпретацию,

зна-

чения

тип

рассматривают

как

вероятность нахождения положитель-

но

заряженных

т- и

л-частиц

внешней поверхности мембраны.

При

больших отрицательных потенциалах

все

положительно заря-

женные подвижные частицы сосредоточены

внутренней поверхно-

сти мембраны; этому состоянию

соответствуют

значения

тип, рав-

ные нулю,

значение

равное единице.

При

ступенчатой деполя-

ризации

клетки управляющие частицы начинают переходить

внеш-

ней

поверхности, причем m-частицы перемещаются

на

порядок

бы-

стрее,

чем п-и

/г-частицы. Такой

переход

соответствует

увеличе-

нию

параметром

т и п и

уменьшению параметра

Увеличение

после ступенчатой деполяризации описывает фазу

нарастания

, т. е.

активацию Ыа+-проводимости; медленное

уменьшение

описывает фазу спада

, т. е.

инактивацию

Na+-

проводимости. Увеличение

отвечает активации /С

-проводимости.

В модели Ходжкина

Хаксли мембранный

ток

изображают

виде суммы емкостного тока, Ыа+-тока,

тока

тока утечки:

'м

= С

— +

h (V — Es.)

+gKn*

(V — Ек) +"£

(V-£

где

т, п и h

описываются однотипными уравнениями

dm/dt

(l —

т)~$

т.

169

-/о

1 1

-50

-20

60 V.MS

Рис.

64.

Стационарные значения

па-

раметров

m, n и h при

различных

мембранных потенциалах

аксоне

кальмара

Рис.

65.

Зависимость параметров

т»,

и тл для

аксона кальмара

от мембранного потенциала

Значения

Тт отложены в шкале О-

мс. значения Хп и xh - в шкале

О—10 мс

Константы скорости а

, а.

, а

, р

. Р„, P

отражают переходы за-

ряженных т-. п- и дг-частиц в прямом и обратном направлениях че-

рез мембрану под влиянием тепловых флуктуации и электрического

поля.

Изменение напряженности электрического поля

облегчает

переходы в одном из направлений и затормаживает переходы в про-

тивоположную сторону. Решение уравнения имеет вид

rrioo

—

(moo

— т

) ехр (—

t/x

где т^ -

aj(a

+ p

); т

^ \>(а

+ р

Зависимость параметров т^, п

и h^ от потенциала приведена

на

рис. 64, а зависимость постоянных времени т,„, т„, т

от напря-

жения

показана на рис. 65.

Уравнения Ходжкина — Хаксли с небольшими модификация-

ми

оказались пригодными для описания ионных токов целого ряда

возбудимых мембран. Данные метода фиксации напряжения ис-

пользуют для определения динамических и стационарных характе-

ристик

воротных процессов в ионных каналах, а также для построе-

ния

кинетических моделей функционирования ионных каналов. За-

висимость параметров g, т, т^, п

и h

от мембранного потенциала

широко

используют и для характеристики ионных каналов, моди-

фицированных различными химическими агентами.

Если мембрану поддерживать в гиперполяризованном состоянии

(т„ — л

~ 0, h

= 1), а затем резко ее деполяризовать, то

изменение т описывается формулой т — т^{\ — -• е"

/т

При

достаточно большой деполяризации h

- 0 и h --

e~''

i>-

По-

этому кинетику Na

- тока при достаточно большой деполяриза-

ции

можно представить в виде

170