Рубин А.Б. Современные методы биофизических исследований (Практикум по биофизике)

Подождите немного. Документ загружается.

50 VMB

I,MA/CM

Рис.

70.

Вольт-амперная характеристика, построенная

по

пиковым значениям

Ыа

-тока

(1), и

мгновенная вольт-амперная характеристика

(2):

'Na

'Na~ пиковое

мгновенное значения

Na+-TOKa

для

одного

из

значений

мембран-

ного потенциала;

для

измерения мгновенных значений тока аксон предварительно

де-

поляризовали

до

+50 мВ.

затем смещали потенциал

на

заданный уровень

щих восходящей ветви пиковой вольт-амперной характеристики

(рис.

71). Проводимость

gSj

определяется

углом

наклона прямой,

проведенной из потенциала реверсии до пересечения с вольт-ам-

перной

кривой при данном потенциале. После введения нормиро-

вочного множителя зависимость g

каналов при различных значениях

мембранного потенциала.

Существует

второй способ опре-

деления зависимости числа откры-

тых каналов от напряжения. По-

казателем числа открываемых ка-

налов

служит

отношение пикового

-TOKa (см. рис. 70, /) к макси-

мально возможному при данном

потенциале значению Ыа+-тока,

протекающего при активации

всех

Ыа+-каналов

исследуемого участка

мембраны (см. рис. 70, 2). Как видно

из

рисунка, соотношение пикового

мгновенного значений Ыа+-тока

очень мало при больших отрица-

тельных потенциалах и стремится

единице с увеличением напряже-

ния

в области положительных зна-

чений.

Зависимости доли открытых

каналов от напряжения, получен-

ные

двумя

рассмотренными мето-

дами, обычно мало отличаются,

, (V) отражает

долю

открытых

1,мА/см

Рис.

71.

Вольт-амперная характе-

ристика

пиковых значений тока

(Л)

зависимость пиковой прово-

димости

{gH

/g) от

потенциала

(В)

За

единицу принято максимальное

значение проводимости

(я)

181

однако второй метод более точен,

так как

применим

и в

области

за-

гиба мгновенной вольт-амперной характеристики.

При

оценке числа открытых каналов

по

пиковым значениям

|\1а+-тока

исходят

из

предположения,

что в

пике Ыа+-тока инакти-

вация

пренебрежимо мала. Однако пренебрежение инактивацией

вносит ошибку

расчеты

приводит

некоторому искажению

за-

висимостей доли открытых каналов

от

напряжения.

опытах

с ак-

сонами кальмара точность построений

удавалось

существенно

по-

высить, подавив инактивацию проназой

воспользовавшись вместо

пиковых значений стационарными значениями Ыа

-тока.

Стационарный

уровень

активации.

Построив зависимость доли

открытых каналов

F от

напряжения, легко отыскать зависимость

стационарного уровня активации

т^ от

напряжения. Действитель-

но,

доля открытых Ыа+-каналов определяется отношением пиковой

-npoBOAHMOCTH

при

данном потенциале

максимальной

1Ма

-проводимости

которое

рамках модели Ходжкина

Хаксли равно произведению

m*h:

Предполагая,

что в

пике Ыа

-тока

т — т^,, a h « 1,

получают

ГПао

=(gNa.

#Na)

^VNa/^Na)

где

/NU

7к

—

отношение пикового

мгновенного значений

тока

(см. рис. 70).

Зависимость

mi от

мембранного потенциала

сов-

падает

нормированной зависимостью пиковой проводимости

от

потенциала лишь

в тех

случаях,

когда инактивация развивается

намного медленнее

по

сравнению

активацией

» т

) или от-

сутствует

вовсе.

В тех

случаях,

когда значения

т„,

сравнимы

по

величине

с т

/для определения

экстраполируют задний фронт Na+-TOKa

моменту подачи тестирующего импульса. Вычисления проводят

так

же, как

описано выше, подставляя вместо

экстраполирован-

ные значения. Зависимость стационарного уровня активации

от

мембранного потенциала приведена

на рис. 64.

Постоянная

времени

активации.

Постоянную времени активации

Ка

-проводимости определяют

по

переднему фронту Ыа+-тока.

Кинетика

\'а+-тока

модели Ходжкина

—

Хаксли описывается

уравнением

/Na

= gNa m

h (V —

a)-

При

большой деполяризации мембраны после предварительной ги-

перполяризации переменная т возрастает экспоненциально от ну-

ля до единицы с постоянной времени т

, а переменная h экспонен-

циально

убывает

с постоянной времени т

. Следовательно,

/N.

«N.(l-e-'

"')

e-'

MV-£N.). (IV.7.3)

182

Для того чтобы определить

учетом

влияния инактивации

на

кинетику развития Ыа

-тока, используют следующий прием.

Выбирают произвольные моменты времени

/ и Т,

соответствующие

нарастанию

инактивации Ыа+-тока. Отношение Ыа

-токов

для

этих моментов времени равно

/ - Г/т i3 -

77тi

(l —е

) e

Для

Т > т„,

получается

При

построении графика зависимости правой части уравнения

от

времени

получается прямая линия

угловым коэффициентом

—

1/т

Таким способом находят

для

данного фиксированного

потенциала. Аналогичные измерения

при

других

значениях потен-

циалов позволяют построить зависимость

т„, от

напряжения.

При-

мер такой зависимости приведен

на рис. 65.

Другой

способ оценки

основан

на

измерении времени

от мо-

мента подачи деполяризующего импульса

до

максимума

тока. Этот метод применяют

в тех

случаях,

когда Ыа+-ток имеет

вы-

ходящее направление

фронт нарастания тока маскируется пере-

ходным процессом зарядки мембранной емкости. Натриевый

ток

описывается уравнением

[см.

(IV.7.3)1

/„(1-е-'

/т

«)

е-'

Пиковому значению Ыа+-тока

)

соответствует

условие

/d/

0, и так как r

> т

, то

Инактивация натриевой проводимости.

Постоянную времени

инактивации

-TOKa определяют

по

заднему фронту кинетиче-

ской

кривой.

аксоне кальмара спад Ыа+-тока описывается одной

экспонентой

постоянной времени

. При

изображении

полуло-

гарифмическом масштабе кривая спада Ыа+-тока спрямляется

по

углу

наклона полученной прямой определяют

. При

действии

некоторых токсинов,

также

на

ряде объектов

обычных условиях

кинетика

инактивации описывается суммой

двух

экспонент.

Для измерения кинетики

h (/) и

определения

используют

так-

же двухимпульсный метод, предложенный

А.

Ходжкиным

и А. Хак-

сли.

Мембрану подвергают сначала воздействию кондиционирующе-

го импульса, длительность которого может меняться,

амплитуда

постоянна.

Этот импульс вызывает развитие инактивации. Поэто-

му, если

вслед

за

первым импульсом подать через короткое время

(~1

мс)

второй, тестирующий, импульс, пиковое значение тока

в от-

183

вет на второй импульс окажется пониженным по сравнению с от-

ветом на такой же импульс без предварительной деполяризации.

Ослабление

Na+тока

отражает уменьшение доли Ыа+-каналов,

способных к активации в

ответ

на тестирующий импульс. Таким

образом, кинетику развития инактивации прослеживают по спаду

амплитуды

Na+-TOKa,

развивающегося в

ответ

на второй импульс

при

увеличении длительности предварительной деполяризации мем-

браны.

Двухимпульсный метод используют также для определения ста-

ционарного уровня инактивации h^ и построения зависимости

от напряжения. Величину h^ для различных значений мембран-

ного потенциала определяют как

долю

Ыа

-каналов, способных к

активации в

ответ

на

тестовую

деполяризацию до +

(50—80)

мВ пос-

ле длительного (порядка 100 мс) предварительного смещения по-

тенциала на заданный уровень. Большая длительность кондицио-

нирующего смещения мембранного потенциала необходима для

того, чтобы успевало установиться стационарное значение h. За

единицу принимают уровень А», создаваемый предварительной ги-

перполяризацией мембраны до потенциалов —

(80—140)

мВ. Это

связано с тем, что гиперполяризующие смещения потенциала не при-

водят к развитию инактивации. Типичные зависимости h

и т,,

от потенциала приведены на рис. 64, 65.

Выход

из

инактивации. Динамику

выхода

ионных каналов

из

инактива-

ции,

(реактивация)

исследуют

двухимпульсным методом. Первый импульс

по-

стоянной

величины

длительности подобра

н так,

чтобы вызвать полную инак-

тивацию Ыа+-проводимости. Если второй импульс приходит мгновенно

за

первым,

Ыа+-ток

»t

развивается. Однако

при

увеличении промежутка

вре-

мени

между

импульсами происходит ослабление инактивации

амплитуда

Ма+-тока

ответ

на

второй (тестирующий импульс) возрастает. Скорость

выхода

из

инактивации существенно зависит

от

уровня потенциала

период

между

импульсами:

при

высоких отрицательных потенциалах

выход

из

инак-

тивации

происходит быстрее,

чем при

более положительных значениях мемб-

ранного

потенциала.

Определение заряда воротных частиц. По зависимости пиковой

хордовой проводимости g*

от потенциала (рис. 72) можно оценить

эффективную валентность воротных частиц. В модели, рассматри-

вающей перескоки заряженных m-частиц через гидрофобную зону

мембраны под действием тепловых флуктуации и электрического по-

ля,

стационарное распределение m-частиц

между

наружной и

внут-

ренней

границами мембраны определяется уравнением Больцмана

—

m^/m,»

=exp[—

zFVl(RT)].

Отсюда

Шаг, = •

184

Уравнение предсказывает в соот-

ветствии с экспериментом

S-образ-

ное

возрастание т^ от нуля до

единицы

при повышении V. Реаль-

ная

зависимость т„, (V) сдвинута в

сторону отрицательных напряже-

ний.

Сдвиг кривой т^ (V) по шкале

потенциалов

учитывается уравне-

нием

—(V-V.ll-l

где К* — потенциал половинного

изменения

. Участок кривой,

где т^ <g; 1 аппроксимируется экс-

понентой

V.mB

Рис.

72.

Зависимость нормирован-

ной

пиковой

Ыа

-проводимости

(доля открытых каналов) аксона

кальмара

от

мембранного потен-

циала

полулогарифмических

ко-

ординатах

Считая,

что нормированная пиковая проводимость gH/

пропорцио-

нальна

mi,

получают

ЗависимостьgJJ,

от

потенциала, представленная

полулогарифмических

координатах, имеет линейный участок, наклон которого пропорционален

эффективной

валентности

воротных m-частиц

(рис. 72). По

изменению

угла

наклона линейного участка этой зависимости выявляют изменения свой-

ств воротной системы Ыа+-каналов

при их

модификации химическими аген-

тами. Например, обработка нервных волокон водорастворимыми карбодиими-

дами

при

низких значениях

рН

приводит

уменьшению эффективного заряда

воротных частиц

Na+-каналов

на 40%.

Используя полученную формулу,

можно оценить суммарный заряд

(Зг),

переносимый воротными частицами

расчете

на

один канал. Например, изменение

!п g^

на

единицу

при

сдвиге

мембранного потенциала

V на 7 мВ

свидетельствует

о том, что для

открыва-

ния

№+-канала

необходим перенос четырех элементарных зарядов.

Ионные

каналы

плоском липидном

вислое

Техника фиксации мембранного потенциала на целых клетках и

электрически

изолированных

участках

клеток

долгое

время слу-

жила основным источником сведений об ионной проницаемости воз-

будимых

мембран. Позднее появились новые методы, позволяющие

регистрировать токи через одиночные ионные каналы и изучать

механизмы управления ионными каналами и особенности прохожде-

ния

ионов через открытый канал. Измерения крайне слабых токов

(порядка

1 пА), протекающих через одиночные каналы, стали воз-

можны

благодаря разработке усовершенствованной регистрирую-

щей

аппаратуры с низким уровнем шумов и достаточным времен-

ным

разрешением.

185

Первые исследования одиночных ионных каналов были выполне-

ны

на фосфолипидных бимолекулярных мембранах, модифициро-

ванных крайне низкими концентрациями грамицидина, амфотери-

цина

и некоторых

других

ионофоров. Обнаружение каналообразу-

ющих свойств у ионофоров,

структура

которых хорошо известна и

допускает химическую модификацию, позволило начать изучение

механизмов проницаемости на молекулярном уровне с целью вы-

яснения

общих принципов функционирования ионных каналов био-

логических мембран.

Определение проводимости и емкости бимолекулярных липид-

ных мембран. Для определения электрических характеристик

бимолекулярных липидных мембран (БЛМ) используют

метод

фиксации

напряжения.

Принципиальная

схема

измерений показа-

на

на рис. 73.

Мембрану формируют

на

отверстии

тефлоновой перегородке, разделяю-

щей

два

водных раствора

KCI или

других

солей.

В оба

отсека измерительной

ячейки

погружают идентичные неполяризующиеся электроды сравнения

низким

сопротивлением. Один

из

электродов подключен

выходу

генератора

электрических сигналов; второй электрод замкнут

на

землю через преобразо-

натель

ток —

напряжение. Напряжение, задаваемое

на

выходе

генератора,

полностью падает

на

мембране, сопротивление которой намного выше

со-

противления электродов, электролита

эффективного сопротивления изме-

рителя тока. Сигнал

выхода

преобразователя

ток —

напряжение регистри-

руют

на

осциллографе

самопишущем потенциометре. Установка позволяет

измерять

ток

через мембрану

при

фиксированных значениях трансмем-

бранной

разности потенциалов,

также

при

наложении импульсов напря-

жения

произвольной формы.

Для формирования БЛМ используют растворы общих липидов

мозга животных в тетрадекане или

других

жидких

углеводородах

с длиной углеродной цепи от 6 до 16 атомов (октан, декан, додекан).

Широко

используют также растворы азолектина (фосфолипиды сое-

вых бобов), индивидуальные фосфолипиды, экстракты липидов из

различных тканей, клеток и органелл. В мембранный раствор до-

бавляют иногда токоферол, повышающий стабильность мембран.

т.

\-~

1 —

Рис.

73.

Измерение электрических параметров бимолекулярной фосфолипид-

ной

мембраны:

/ генератор ичпульсов н источник постоянных напряжений. 2 •- неиоляризующнеся

электроды,

3 --преобразователь ток -напряжение

186

или

холестерин, необходимый

для формирования ионных ка-

налов в присутствии амфотери-

цина.

При

нанесении раствора

фосфолипидов на отверстие в

тефлоновой перегородке проис-

ходит

спонтанное вытеснение

растворителя к краям отверстия

утоньшение БЛМ. По мере

растекания фосфолипидногослоя

поле зрения микроскопа появ-

ляются и ширятся черные ост-

ровки,

свидетельствующие о

том, что толщина мембраны ста-

ла намного меньше длины волны

света, при котором происходит

наблюдение. БЛМ ограничена по периферии тором растворителя,

вмещающим избыточное количество липидов.

Увеличение площади липидного бислоя сопровождается увели-

чением электрической емкости мембраны. Поэтому образование

БЛМ

удобно наблюдать по увеличению емкостного тока, протекаю-

щего через мембрану при наложении на нее

треугольных

импуль-

сов напряжения. Ток в цепи слагается из омической и емкоснюй

составляющих:

Рис.

74. Измерение емкостного тока

при

наложении на мембрану треуголь-

ных импульсов напряжения:

\\, -амплитудное напряжение. Т период

колебаний,

t время

При

высокой скорости нарастания потенциала ток через сопротив-

ление немодифицированной мембраны /?

пренебрежимо мал по

сравнению с емкостным током, т. е. / =

dV.

d/. Форма подавае-

мых на мембрану импульсов напряжения и протекающего через

мембрану тока для случая, когда 1с. 5> /«. представлена на рис.

74. Значение емкости рассчитывают по формуле С

//(dV/dft.

где / — емкостный ток, a

dV/dt

— скорость изменения потенциа-

ла на мембране. Как видно из рис. 74,

dV7d/

= 4Л/, где А —

амплитуда изменений напряжения на

выходе

генератора, / — ча-

стота колебаний, Гц.

Периодические прямоугольные колебания емкостного тока можно

подать на выпрямитель и получить на

выходе

постоянный или мед-

ленно

меняющийся сигнал, пропорциональный емкости мембраны.

Увеличение емкости в процессе формирования БЛМ в таком

случае

непосредственно регистрируют на самопишущем приборе. Скорость

формирования

липидного бислоя зависит от температуры, рН сре-

ды, состава мембранного раствора и

других

факторов.

Немодифнцированные

БЛМ

обладают

проводимостью 1-

10 нСм/см

и емкостью

0,3—0,9

мкФ/см

. Наибольшая емкость прису-

ща мембранам, в составе которых

отсутствует

растворитель. Такие

187

мембраны можно получить, используя в качестве растворителя сква-

лен,

а также формируя БЛМ из

двух

монослоев по

методу

Монтала.

Описанный

простой метод определения емкости применим лишь в

тех

случаях,

когда ток проводимости намного меньше емкостного

тока, т. е. в опытах с немодифицированными мембранами.

При

добавлении ионофоров в сравнительно больших концентра-

циях проводимость БЛМ возрастает на несколько порядков. При

измерениях в режиме фиксации напряжения это проявляется в рез-

ком

увеличении трансмембранного тока. Аналогичным образом

можно регистрировать изменения проводимости мембран при дру-

гих воздействиях, например при освещении БЛМ, содержащих бак-

териородопсин или экстракты фотосинтетических пигментов.

Ионные

каналы,

образуемые

антибиотиками.

Ионофоры, по-

вышающие проводимость БЛМ, по механизму действия делятся на

две группы. К первой относятся

валиномицин

другие

нейтраль-

ные

макроциклические

антибиотики,

способные связывать ионы

щелочных металлов с образованием липофильных положительно за-

ряженных комплексов. Благодаря высокой липофильности свобод-

ных комплексонов и заряженных комплексов валиномицин и его

аналоги

служат

эффективными переносчиками ионов через БЛМ.

Ко

второй группе относятся

грамицидины,

аламетииин

поли-

еновые

антибиотики,

образующие в БЛМ ионные каналы. При вне-

сении

этих антибиотиков в водные растворы с обеих сторон БЛМ в

крайне

низких концентрациях (порядка 1 пМ для грамицидина А)

выявляются дискретные флуктуации тока, амплитуда которых зна-

чительно превышает значение фонового тока через немодифициро-

ванные мембраны. Фоновая проводимость БЛМ малого диаметра

(50—200

мкм) не превышает нескольких пикосименс, а скачки тока,

индуцирумые грамицидином А,

соответствуют

проводимости около

30 пСм. Дискретные флуктуации тока примерно равны по величине

составляют несколько пикоампер при напряжении на мембране

50—100мВ.

Возникновение дискретных скачков проводимости в присутствии

ионофоров

принято объяснять образованием сквозного трансмем-

бранного канала из

двух

или нескольких субъединиц. Например,

молекулы грамицидина А, попадая в мембрану, свертываются в

полу-

пору

— спиральную

структуру

размером около 3 нм. Полупоры ори-

ентируются перпендикулярно плоскости мембраны, удерживаясь

полярным

концом на границе с водным раствором. Спиральная кон-

фигурация молекулы имеет внутреннюю полость, в которую обра-

щены

полярные группы. Проводящее состояние возникает при слу-

чайном образовании сквозной димерной структуры, стабилизиро-

ванной

межмолекулярными водородными связями. Обратный

скачок

проводимости объясняют распадом димера вследствие дес-

табилизирующего влияния тепловых колебаний. Дискретные скач-

ки

проводимости

могут

быть также вызваны локальными измене-

188

ниями

толщины БЛМ, поворотом димера

мембране

другими

при-

чинами.

По

гистрограмме амплитудных значений дискретных

флуктуа-

ции

тока рассчитывают среднюю проводимость одиночного ионного

канала,

распределение времен проводящего

непроводящего

со-

стояний

дает

информацию

среднем времени жизни канала

и кон-

стантах скоростей образования

разрушения проводящих струк-

тур. Проводимость ионного канала рассчитывают

по

формуле

g =

I>'V, где / —

среднее значение дискретных скачков тока,

V —

разность потенциалов

на

мембране. Проводимость канала зависит

от концентрации солей

среде, поэтому, приводя значения проводи-

мости, указывают состав окружающих растворов.

Скачки

тока через одиночный канал

проводимостью

30 пСм

при

напряжении

на

мембране

50 мВ

составляют

1,5 пА.

Поскольку

элементарный заряд равен

1,6-10~

Кл,

пропускная способность

ионного

канала составляет около

ионов/с.

Для оценки среднего времени жизни канала строят гистограм-

мы распределения времен открытого состояния.

При

этом

по оси

абсцисс откладывают время,

а по оси

ординат

—

число открытых

со-

стояний,

время жизни которых превышает заданное значение.

про-

стейших

случаях,

когда ионный канал может находиться лишь

двух

состояниях: открытом

закрытом, причем вероятность образо-

вания

канала мала

и не

зависит

от

существования

мембране

дру-

гих каналов, гистограмма распределения представляет собой

экс-

поненту, характерное время которой равно среднему времени откры-

того состояния.

Успешное изучение ионных каналов, образуемых пептидными

антибиотиками, определило многочисленные попытки реконструк-

ции

ионных каналов биологических мембран

липидном бислое.

Наблюдение одиночных каналов

дает

значительно большую инфор-

мацию,

чем

исследование мембран

большим числом каналов.

При

наблюдении индивидуальных каналов устраняется основная

труд-

ность обычных измерений, состоящая

в том, что

ионные токи

в це-

лых клетках обусловлены совместным функционированием

не-

скольких типов проводящих

структур.

Кроме того, измерения

то-

ков

одиночных каналов

дают

прямую информацию

проводимости

времени открытого состояния канала,

также

влиянии потен-

циала

химических агентов

на эти

параметры.

Реконструкция ионных каналов в БЛМ.

Реконструкция ионных

каналов

в БЛМ

должна включать

три

основных этапа: экстракцию

каналов

из

нативных мембран

помощью детергентов

или

раствори-

телей,

последующую

очистку выделенных белков

встраивание

их

липидный бислой. Реконструированные системы открывают

воз-

можность исследовать

работу

одиночных ионных каналов

при раз-

личных модификациях липидного состава мембран.

В плоские

БЛМ

удалось

встроить Са

-каналы, присутствующие

гомогенате клеток

харовых

водоростей. Показано,

что

дискрет

18»

ные скачки проводимости модифицированных

БЛМ,

омываемых

0,1

раствором КС1, составляют

200

пСм. Основные характеристи-

ки

Са

-каналов, встроенных

в БЛМ

(селективность, управление

полем),

обнаруживали хорошее соответствие

результатам

измере-

ний

Са

-токов

мембране целых водорослей. Однако реконструк-

ция

ионных каналов

плоских

БЛМ

оказалась

целом трудной

задачей

и не

получила широкого применения.

Альтернативный

подход

состоит

в том,

чтобы вначале встроить

липосомы мембранные белки,

затем осуществить слияние липо-

сом

плоской

БЛМ. Из

мелких липосом

помощью особых приемов

можно получить крупные, диаметром

до 50 мкм,

пригодные

для

электрических измерений методом микроотведения. Например,

бы-

ли получены крупные протеолипосомы, содержащие каналы

аце-

тилхолинового рецептора

С1

"-каналы мембран электрического

органа угря.

Для

получения протеолипосом сначала солюбилизи-

ровали нативные мембранные белки

растворе детергента

присут-

ствии липидов,

затем удаляли

детергент

диализом.

При

этом полу-

чали мелкие липосомы, диаметром

0,5—2

мкм, содержащие встроен-

ные белки. После многократного замораживания липосом

жидком

азоте

размораживания

на

льду

при

комнатной температуре полу-

чали крупные липосомы

диаметром

30—50

мкм, оказавшиеся

удоб-

ным

объектом

для

регистрации токов одиночных ионных каналов

с помощью микроприсосок.

Еще один

подход

изучению ионных каналов

реконструиро-

ванной

системе состоит

формировании модифицированного липид-

ного бислоя

на

торце стеклянной микропипетки.

этом

случае

микропипетку заполняют раствором, содержащим каналообразую-

щие белки

или

очищенные мембранные фракции,

затем перемеща-

ют микропипетку через границу раздела

воздух

—

липид.

При

этом

на

торце пипетки иногда образуется БЛМ, содержащая отдель-

ные ионные каналы.

9. Измерение токов ионных каналов методом микроотведения

В последние годы разработан метод изучения ионных каналов

био-

логических мембран, который состоит

измерении токов через

мик-

роскопически малые участки клеточной поверхности. Такие

из-

мерения стали возможны благодаря обнаруженной способности

клеточных мембран плотно прилипать

кончику стеклянной

мик-

ропипетки.

Электрическое сопротивление контакта, образованного

между

поверхностью стекла

торце микропипетки

клеточной

мем-

браной,

превышает

10 ГОм.

Благодаря гигаомному контакту обес-

печивается хорошая электрическая изоляция участка мембраны,

ограниченного торцом микропипетки.

На

площади порядка

мкм

, ограниченной периметром микроприсоски, располагается

от единиц

до

нескольких десятков ионных каналов.

определен-

ных условиях, когда вероятность нахождения каналов

открытом

190