Рубин А.Б. Современные методы биофизических исследований (Практикум по биофизике)

Подождите немного. Документ загружается.

ся

через пару полупрозрачных зеркал, отстоящих

друг

от

друга

на

расстоянии d. В результате получается последовательность калиб-

ровочных импульсов, идущих

друг

за

другом

с временньш интерва-

лом

At=*2d/c,

где с—скорость света. Интенсивность последующего

импульса 1

= Г

(1 — Т)

*, где Т — коэффициент пропускания

зеркал, k — номер импульса. Отношение I

+i^h =" О — Л

является постоянной величиной, а огибающая импульсов

будет

описываться уравнением

Калибровочный цуг импульсов подается на

входную

щель ЭОК

разворачивается во времени. Обработка результатов калибровоч-

ных измерений показывает, что временное разрешение флуоромет-

ра достигает 3—4 пс, динамический диапазон системы ЭОК —

видикон

— анализатор на линейном участке характеристики свет —

сигнал составляет (для разных камер)

20—100,

чувствитель-

ность позволяет регистрировать световые потоки на уровне

— 10

квант/см

5. Пикосекундный абсорбционный спектрометр

Наиболее важными параметрами, определяющими достоинства аб-

сорбционного спектрометра, являются следующие.

1. Спектральный диапазон. Как правило, в абсорбционных спек-

трометрах источником пикосекундных импульсов света являются

твердотельные лазеры, генерирующие дискретный набор длин волн

света. В описываемом спектрометре, в частности, в качестве гене-

ратора света используют лазер на алюмоиттриевом гранате, дли-

на

волны излучения которого составляет 1064 нм и может быть пре-

образована в излучение гармоник с X — 532, 355 и 266 нм. При ис-

следовании широкого класса соединений необходимы источники

возбуждающего и зондирующего излучений существенно большего

спектрального диапазона. С этой целью в канале возбуждения ис-

пользуют параметрическое преобразование частоты излучения,

позволяющее получить перестройку в диапазоне

400—1600

нм.

Так

как энергия зондирующих импульсов значительно ниже

энер-

гии возбуждающих, перестройку длины волны лазерных импульсов

канале зондирования можно осуществить либо с помощью парамет-

рических генераторов света

(ПГС),

либо использовать явление гене-

рации

пикосекундного континуума, возникающего при фокусиров-

ке мощного лазерного импульса в нелинейную

среду.

Например,

при

использовании в качестве нелинейной среды D

O получают

пикосекундные импульсы в диапазоне

500—950

нм.

Чувствительность. Под чувствительностью абсорбционного

спектрометра понимают те минимальные фотоиндуцированные из-

менения

оптической плотности образца, которые можно уверенно

131

регистрировать с вероятностью 68%. Чувствительность зависит от

многих факторов: свойств лазерных импульсов, фотоприемников, си-

стемы считывания и обработки информации.

Временное

разрешение.

Максимальное временное разрешение

спектрометра определяется следующими параметрами: длительно-

стью

лазерных импульсов, стабильностью их генерации (по энергии

длительности), чувствительностью установки, которая определя-

ет точность построения кинетических кривых, линейностью фото-

приемников.

Точность совмещения модельных и эксперименталь-

ных кривых определяет матобеспечение установки — функциональ-

ные возможности ЭВМ и периферийных устройств.

При

использовании в качестве источника света лазера на алю-

моиттриевом гранате с длительностью импульса ~ 30 пс, с селек-

цией

лазерных импульсов по длительности и энергии при чувстви-

тельности ~

3-10~

единиц оптической плотности, а также исполь-

зовании

ЭВМ «Электроника НЦ-80» с широким набором периферий-

ных модулей реализовано временное разрешение 3 пс в том случае,

когда величина максимального изменения оптической плотности

превышает 3-Ю"

единиц оптической плотности.

Линия

задержки.

При проведении пикосекундных абсорбционных

измерений необходим аккуратный отсчет разности относитель-

ных времен

между

возбуждающим и зондирующим импульсами.

Дж. В. Шелтон и Дж. А. Армстронг осуществили задержку зон-

дирующего импульса относительно возбуждающего с помощью

прямоугольной стеклянной призмы, закрепленной на подвижном

столике. Расчеты показывают, что перемещение столика на 1 мм

обеспечивает изменение относительной временной задержки на

6,6 пс. Такая линия задержки получила наибольшее распростра-

нение.

других

способах получения задержанных

друг

относи-

тельно

друга

импульсов можно прочесть в рекомендуемой литера-

туре.

В описываемом спектрометре используются две линии задержки,

которых перемещаемым элементом является прямоугольная стек-

лянная

призма. Одна на временной диапазон 0—2 не перемещается

шаговым двигателем, управляемым ЭВМ, и обеспечивает точность

относительного отсчета времен ±2 пс.

Другая

линия задержки —

на

временной диапазон 2—12 не с погрешностью отсчета переме-

щения

2 мм.

Спектральная

селекция.

Для спектральной селекции диапазонов

зондирования обычно употребляют монохроматоры, снабженные ша-

говыми двигателями. В описываемом спектрометре в качестве зон-

дирующего света используется пикосекундный континуум, ге-

нерируемый с D

O. Двойная спектральная селекция импульсов

зондирования осуществляется интерференционным клином (регули-

руемый спектральный диапазон

300—1100

нм), который выделяет

спектральный участок полушириной ДА = 30 нм. Окончатель-

ная

селекция проводится с помощью монохроматора МДР-4.

132

Схема пикосекундного абсорбционного спектрометра приведена

на

рис. 44.

Источником световых импульсов пикосекундной

дли-

тельности является лазер

на

алюмоиттриевом гранате,

резонатор

которого введены необходимые селектирующие элементы

реали-

зована

непрерывная прокачка красителя (пассивного модулятора

добротности) через

клювету,

одна

из

стенок которой представляет

собой

100%-ное

зеркало. Используемая конфигурация резонатора,

а также системы охлаждения

питания позволяют лазеру работать

ЭВМ

Электроника

60"

Рис.

44. Схема пикосекундного абсорбционного спектрометра:

СВОИ

—система выделения одиночного импульса. ФД

—

фотодиод.

ГВГ

—

генератор

второй

гармоники.

ГК

— генератор континуума, ИК

—

интерференционный клин,

ЛЗ —

линия задержки, М

—

мокохроматор

133

частотой следования импульсов до 3 Гц при длительности на полу-

высоте ~ 25 пс. Выходное излучение генератора представляет со-

бой

последовательность из 7—9 импульсов света с суммарной

энер-

гией ~ 10 мДж. Интервал

между

импульсами ~ 9 не.

Выделение одиночного импульса из

цуга

осуществляется с по-

мощью промышленного электрооптического затвора типа МЛ-102,

управляемого относительно низким полуволновым напряжением

(380 В для А. = 1064 нм). Одиночный лазерный импульс с

энер-

гией ~ 1 мДж усиливается в

двух

усилителях света до энергии

~ 20 мДж. Для улучшения структуры импульса на выходе усили-

тельной системы применяют пространственные фильтры — пары

софокусных

линз,

в фокусе которых помещены диафрагмы.

Перестройка

по частоте импульсов возбуждающего и зондирую-

щего света осуществляется с помощью параметрического генерато-

ра света и генератора пикосекундного континуума соответственно.

Для получения континуума необходимо излучение с X — 1064 нм

энергией > 5 мДж, для накачки ПГС — импульсы света второй

гармоники

с К -- 532 нм. В установке удвоение частоты излучения

производилось в кристалле KDP (/ — 1 см) с энергетическим ко-

эффициентом

преобразования ~ 50 %.

Пространственное

разделение импульсов основной частоты

второй

гар-

моники

осуществляется

помощью призмы Глана

—

Тейлора, излучение

ос-

новной

чатоты фокусируется затем

кювету

с DjO

длиной

10 см.

Эгергия

ко-

нтинуума

области

500—950

нм

составляет

~40

мкДж.

канале зондирова-

ния

(рис. 44)

помещены также интерференционный

клин,

линия задержки

монохроматор, управляемые шаговыми двигателями

(ШД).

В канале возбуждения используется сверхлюминесцентная

схема

ПГС,

обеспечивающая высокую энергетическую эффективность

простоту испол-

нения.

Здесь используются

два

кристалла

KDP (/

=--

40 мм) с

угловой пере-

стройкой

длины волны излучения. Такая

схема

позволяет осуществить изме-

нение

длины волны возбуждающего света

диапазоне

800—1600

нм с

энерге-

тической эффективностью

5—10 %. С

помощью генератора второй гармоники

для

ПГС

нижняя граница спектрального диапазона возбуждающего импульса

может быть смещена

до 400 нм.

Принцип

метода абсорбционной спектроскопии состоит в сравне-

нии

интенсивностей импульса, прошедшего через невозмущен-

ную область образца, и пробного импульса, прошедшего через об-

разец в месте облучения возбуждающим светом. Пробный импульс

импульс сравнения имеют диаметр 0,7 мм и возникают из зонди-

рующего с помощью светоделительного зеркала. Возбуждающий им-

пульс имеет диаметр 2 мм. Прошедшие через образец импульсы света

подаются затем на

входную

щель монохроматора МДР-4 и регист-

рируются двумя фотодиодами, нагруженными на операционный

усилитель.

Система регистрации и управления спектрометром собрана на

базе ЭВМ «Электроника НЦ-80», сопряженной с набором модулей,

выполненных

в стандарте КАМАК.

134

Энергия

Рис.

45. Статистическое распределение лазерных импульсов по энергии задаю-

щего генератора (а), после усиления возбуждающего импульса (б), в

отсут-

ствие пространственных фильтров (в)

Система включает в себя набор фотодиодов для контроля работы лазера и

сбора информации, штатный комплект ЭВМ с расширенной до 56 Кбайт

оперативной памятью, снабженный накопителем на магнитных дисках типа

НГМД-6022. Через канал ЭВМ подключены также алфавитно-цифровой дисп-

лей

VDT-52100

и графический дисплей на базе телевизионного (ТВ) приемни-

ка

«Электроника

402».

Кроме того, к системе подключен двухкоординатный

графопостроитель Н-306. Прием и преобразование информации с фотодатчи-

ков

осуществляется модулями

«Коммутатор»

и АЦП-712, шаговые двигатели

управляются модулями МУШД, для обработки большого массива данных

обеспечена связь с ЭВМ СМ-4.

Программное

обеспечение спектрометром сформировано на мо-

дульном принципе.

Программные модули вызываются к действию нажатием определенной

кнопки

на алфавитно-цифровом дисплее. Используют операционную сис-

тему

РАФОС, язык программирования ФОРТРАН, программные модули,

обслуживающие КАМАК, написаны на Макроассемблере и имеют разви-

тую систему приоритетов, связанную со спецификой конкретного экспери-

мента.

Математическое обеспечение включает базовый набор программ: цифро-

вой фильтрации экспериментальных данных, предварительной оценки полу-

чаемой информации, восстановления сигнала, интегрирования, дифференциро-

вания,

анализа кинетики переходных процессов для случая, когда исследуе-

мый

процесс представлен суммой экспонент, разложения спектра на

сумму

га-

уссовых

компонентов.

Как

уже отмечалось, из-за нестабильности работы лазерных генерато-

ров света импульсы от вспышки к вспышке отличаются по энергии, временной

пространственной структуре. Для определения области допустимости от-

клонений

длительности и энергии опыта возбуждающего и зондирующе-

го излучений в начале каждого опыта снимаются гистограммы их распреде-

ления.

Такой отбор уменьшает также вариации в спектре континуума. Кро_

135

ме того, селекция

возбуждающего

импульса позволяет избежать нелинейных

эффектов

в исследуемом образце. Однако и селекция импульсов по энергии не

исключает статистической ошибки в определении оптической плотности ДИ.

Для исследования статистических характеристик различных па-

раметров пикосекундных импульсов разработана соответствующая

программа, обеспечивающая получение гистограмм одновременно

от нескольких фотоприемников. При этом на экран графического

дисплея выводится гистограмма

требуемого

фотоприемника с одно-

временной

экспозицией числовых значений средней энергии Е,

дисперсии

а и коэффициента вариации А = |/ а/Е. В качестве при-

мера на рис. 45 приведены графики статистического распределения

500 импульсов основной частоты лазера после задающего генера-

тора, после усилителей, а также гистограмма импульсов с плохой

поперечной

структурой пучка, когда флуктуации энергии значи-

тельно возросли.

Разработанная

методика накопления и обработки статистиче-

ских данных методом амплитудного анализа позволяет в процессе

эксперимента

контролировать значения флуктуационных парамет-

ров световых импульсов.

6. Абсорбционный спектрометр наномиллисекундного

временного диапазона

Принцип

работы абсорбционных спектрометров пиконаносекунд-

ного и наномиллисекундного диапазонов одинаков, различие заклю-

чается в

деталях

выполнения оптической части и системы регистра-

ции.

Поэтому в этом параграфе

будет

дано лишь описание

прин-

ципиальной

схемы спектрометра для исследования абсорбционных

изменений

и эмиссионных характеристик образцов в наномилли-

секундном диапазоне.

Схема спектрометра приведена на рис. 46. Его оптическая часть

включает генератор возбуждающих импульсов (лазер на алюмо-

иттриевом гранате типа ЛТИ

ПЧ-7),

генерирующий импульсы света

X = 1064, 532, 355 нм длительностью на уровне 0,9 А* == 15 не;

два монохроматора МДР-23 и МДР-3, источник зондирующего из-

лучения (лампа КГМ-300 или инжекционные лазеры) и кюветное от-

деление. Регистрация оптических сигналов осуществляется либо

фотоумножителем, либо фотодиодами. Управление оптической ча-

стью

спектрометра производится с помощью блоков крейта КАМАК

(модули МУШД для перемещения решеток монохроматоров и

«Релейный драйвер», управляющий реле синхронизации).

Общее управление спектрометром — процессом проведения из-

мерений

и обработки полученных

результатов

— осуществляется

микроЭВМ

«Электроника

МС-1201.01»,

связанной с крейтом КАМАК

через контроллер крейта (КК). Программное обеспечение спект-

рометром условно разделено на две части. Первая управляет изме-

136

Генератор I г Г —з

CmpoSocKonu

ческий осцилло-

граф

Процессор

Электроника

НЦ-80"

НГМД

Терминал

15-

ИЕ

ЦВетной

ТВ-дис-

Рис. 46. Схема абсорбционного наномиллисекундного спектрометра:

ГГ — генератор гармоник, ТВ — телевизор; остальные объяснения см. в тексте

рительной и оптической частями установки, аналого-цифровыми

преобразователями, блоками «Релейный

драйвер»

и МУШД.

Вторая

разработана для обработки экспериментальных

результатов.

В нее

входят

подпрограммы задания начальных

условий,отбора

лазер-

ных

импульсов

по энергии, организации режима накопления и вы-

ведения

результатов

измерений на

ТВ-дисплей

двухкоординатный

графопостроитель. Кроме

того,

с помощью этой программы

осуще-

ствляются

цифровая фильтрация

данных,

предварительная оценка

и восстановление сигнала, операции суммирования, вычитания,

дифференцирования и интегрирования, разложение

переходных

кинетик на экспоненты, а спектров — на

гауссовы

компоненты.

Функционирование спектрометра осуществляется следующим образом.

Возбуждающие импульсы от лазера на алюмоиттриевом гранате направля-

ются на образец, индуцируя в нем фотореакции, сопровождающиеся измене-

ниями оптической плотности в различных участках спектра поглощения.

Незначительная часть энергии возбуждающего излучения (~10%) отво-

дится на диод синхронизации для контроля и отбора импульсов по

энергии,

'л также синхронизации работы блоков управления и съема информации.

Спектральная область зондирования (в случае использования лампы

КГМ-300) выделяется монохроматором МДР-23; постоянный свет необходи-

мого

спектрального диапазона слабой интенсивности проходит через образец

в месте облучения возбуждающим светом. После образца измеряющий луч по-

падает на фотоприемник, которым регистрируется изменение поглощения.

137

В диапазоне

830—860

нм в

качестве измеряющего источника света

могут

ис-

пользоваться инжекционные лазеры, например

случае

измерения наведен-

ного поглощения

пигмент-белковых комплексных зеленых растениях

(Т —

— Г-поглощение, контроль состояний

Хл+

или

Хл~).

Очевидно, описанная

система возбуждения образца

регистрации измеряющего света позволяет

проводить кинетические измерения

снятие спектров наведенного поглоще-

ния.

Сигнал

от

фотоприемника после усиления подается

на

вход

быстрого

АЦП

буферной памятью

разрядов,

МГц), запускаемого синхроимпуль-

сом

от

фотодиода

ФД-1. АЦП

преобразует

запоминает измеренный

сиг-

нал.

Одновременно фотодиод вырабатывает стартовый синхроимпульс

на

АЦП-14 блока КАМАК,

помощью которого измеряется энергия возбуждаю-

щего лазерного импульса. Этим

же

стартовым импульсом запускается

про-

грамма выборки лазерных импульсов

по

энергии,

при

попадании величины

энергии

импульса

наперед заданные пределы изменения микроЭВМ вклю-

чает

подпрограмму считывания

запоминания измеренной информации.

При

накоплении сигналов цикл повторяется

до

достижения требуемого

от-

ношения

сигнал/шум,

т. е.

обеспечения необходимой точности измерения

на-

веденного поглощения

В установке предусмотрен также непрерывный контроль интенсивности

измеряющего света,

для

чего используются фотодиод

ФД-3

АЦП-712

(10 разрядов,

кГц)

крейте КАМАК. Такой контроль необходим

при

изу-

чении

медленных процессов, когда флуктуации энергии измеряющего света

могут

исказить характер излучаемого явления.

Визуальный контроль осуществляется

помощью осциллографа С1-70,

обеспечивающего временное разрешение

25 не

при

нагрузке

Ом.

Описан-

ный

спектрограф имеет следующие параметры: длины волн возбуждающе-

го света

532 и 355

нм,

спектральная область зондирования

400—900

нм, вре-

менной

диапазон измерения кинетических процессов

25 не — 1 с;

чувстви-

тельность позволяет регистрировать изменение оптяческой плотности

точ-

ностью

0,05 % при 100

накоплениях. Частота генерации импульсов возбуж-

дающего света

— от

одиночных

до 25 Гц,

чувствительность

при

регистрации

свечения образцов достигает

от 50 до 10'

квант/с

режиме счета фотонов.

Это

позволяет регистрировать кинетику свечения

временным разрешением

0,3

мке

(таким образом реализуется возможность получения полной кинетики

свечения

диапазоне

0,3

мке

— 1 с).

7. Спектрометр комбинационного рассеяния

Комбинационное

рассеяние

(КР)

света

—

хорошо известное

физи-

ческое явление, широко используемое

исследовании структуры

молекулы,

ее

динамического поведения, внутримолекулярных коле-

баний

взаимодействия

окружением. Наибольшее применение

этот метод нашел

физике

химии,

тогда

как его

использование

биологии сдерживалось главным образом сложностью исследуемых

соединений.

Лишь

последнее время удалось преодолеть методи-

ческие трудности,

и в

настоящее время спектроскопию

КР

успеш-

но

используют

изучении структурно-функциональных свойств

фотосинтетического пигментного аппарата, возбудимости нервных

волокон,

зрительных пигментов, гемоглобина

и др.

КР-спектрометр

должен удовлетворять следующим требова-

ниям.

Возбуждать

спектры

КР

биообъектов несколькими монохро-

матическими

линиями, попадающими

полосы поглощения

пиг-

138

ДФС-24

(рэу

|_|

Анализатор

I—I

Перфоратор

Рис.

47.

Схема спектрометра комбинационного рассеяния:

— диафрагма, ИФ — интерференционный светофильтр,

МДР-23

— монохроматор, О

•

образец.

ПЗ — полупрозрачное зеркало, Ф — светофильтр; остальные объяснения см.

в тексте

ментов фотосинтетического аппарата, что позволяет снимать их

спектры резонансного КР.

2. Иметь оптимальную оптическую

схему

возбуждения био-

объекта, приготовленного по специальной методике для снятия

спектров КР.

3. При снятии спектров КР сильно рассеивающих биологических

образцов обеспечить высокий уровень дискриминации рэлеевского

рассеяния

при малых

сдвигах

от частоты возбуждения.

4. Автоматически регистрировать, накапливать, запоминать,

обрабатывать и воспроизводить спектры КР.

В качестве базового спектрального прибора был выбран оте-

чественный спектрограф ДФС-24, источником

возбуждающего

све-

та служили серийные отечественные непрерывные газоразрядные

лазеры, система регистрации была создана на основе многоканаль-

ного анализатора импульсов

NTA-1024

производства ВНР.

Схема спектрометра приведена на рис. 47.

Источником

возбуждающего света

служат

промышленные непрерыв-

ные лазеры, генерирующие излучение

с к =

441,6;

488; 514,5 и 633 им.

В большинстве

случаев

интенсивность света, генерируемая лазером, велика,

поэтому излучение лазеров ослабляли светофильтрами

(Ф) и

ирисовыми диаф-

рагмами

(ИД).

Кроме того, диафрагмы вместе

монохроматором

служат

для

подавления непрерывного фонового излучения газового разряда трубки

ла-

зера

постоянного фонового освещения.

Описываемая здесь установка используется

для

снятия

как

спектров

КР,

так и

поляризационных спектров люминесценции.

такого рода измере-

ниях

необходимо менять поляризацию возбуждающего света.

Для

этого

слу-

жат пластинки

(П):

пластинка

А/2 для

поворота плоскости поляризации

на

90° или

пластинка

А/4 для

правращения линейно поляризованного света

в по-

ляризованный

по

кругу.

Отводная пластинка

(ОП) и

фотодиод

(ФД)

служат

для измерения

контроля стабильности мощности возбуждающего излуче-

ния,

объектив

(Л)

образует осветитель образца

(О).

139

Рассеянное

образцом излучение собирается системой линз

(Л) на

вход-

ную щель спектрографа ДФС-24. Поляризационную призму

(П)

(призму

Глана) используют

как

анализатор

при

поляризационных измерениях.

Мо-

нохроматор обладает различным пропусканием

для

света

разной поляриза-

цией,

поэтому

при

снятии спектров

КР для

исключения влияния этого

эф-

фекта

перед входной щелью монохроматора устанавливают деполяризующий

клин

(ДК).

Светофильтр

служит

для

устранения света, который может нало-

житься

на

исследуемый спектр

во

втором порядке дифракции.

Регистрация

спектров

КР в

описываемом спектрометре осуществляется

фотоэлектронным

умножителем ФЭУ-79, работающим

режиме счета фотонов.

Отношение регистрируемого сигнала

шуму

тем

больше,

чем

больше время измерения,

пропорционально

J/7.

Время измерения

можно увеличить, уменьшая скорость сканирования

увеличивая

постоянную времени усилителя. Однако такой подход связан

с воз-

растанием экспозиции образца,

что

может привести

к его

фотодест-

рукции. Другим подходом

увеличению времени измерения

яв-

ляется суммирование спектров

КР от

нескольких образцов одного

того

же

вещества. Такую возможность

дает

многоканальный

анализатор импульсов NTA-1024.

При

возбуждении окрашенных образцов интенсивность линий

резонансного

КР

зависит

от

концентрации вещества

геометрии

ос-

вещения,

определяющей потери

на

перепоглощение. Очевидно,

схе-

му освещения необходимо создавать таким образом, чтобы поглоще-

ние

возбуждающего

рассеянного света было минимальным

при

оптимальной величине сигнала

КР.

Следует учитывать также,

что

при

работе

фотоактивными соединениями надо использовать

как

можно более низкие интенсивности возбуждения, исключающие

теп-

ловое

фотохимическое разрушение препарата.

этих условиях

выбору оптимальной оптической схемы возбуждения придается

большое значение.

Расчеты показывают,

что для

мощностей рассеянного излуче-

ния

схемах

углом

между

направлениями возбуждения

регистрации

90 и 180°

получаются следующие выражения:

р. 1_

—e(v.)c/

•

—e(v)cb

РА^

;

fs(v

)

e(v)c

(IH.7.2)

(ie

e(v

)4-e(v)

где

—

мощность возбуждающего света;

Ь, с, I —

геометрические

размеры рассеивающего объема;

е (v

) и е

(v)—экстинкции

образ-

це

на

частоте возбуждающего света

регистрации

v; A —

коэф-

фициент

пропорциональности, характеризующий тензор

КР.

Для слабоокрашенных

или

прозрачных образцов

ecb < 1,

поэтому формулы (II

1.7.1) и

(II

1.7.2)

существенно упрощаются

для мощностей рассеянного излучения можно получить

АР

с1\

АР

сЬ.

140