Рубин А.Б. Современные методы биофизических исследований (Практикум по биофизике)

Подождите немного. Документ загружается.

Так

как обычно / > ft, то Р

"р Р

- Следовательно, при исследо-

вании

слабоокрашенных или прозрачных образцов оптимальной

является схема освещения под

углом

90°.

другом

предельном

случае

интенсивно окрашенных образ-

цов для мощности рассеянного излучения получаются выражения

Я,

АР

Цг

)e (v) cb];

~APj[z

)

+e(v)],

из

которых

следует,

что Р

< Р

Таким

образом, из проведенного анализа видно, что

схему

с уг-

лом 90°

между

возбуждением и регистрацией целесообразно исполь-

зовать для снятия нерезонансного КР. Для схемы с

углом

180°

сигнал КР растет с увеличением концентрации резонансно рассе-

ивающих молекул при малых концентрациях и почти не зависит от

нее для значений [е (v

) + e (v)] cb > 3. Эта схема наиболее оп-

тимальна для снятия спектров резонансного КР. Плотность мощ-

ности возбуждающего света, используемая для снятия КР-спектров

схеме

углом

180°, меньше, чем в

схеме

углом

90°. Основные па-

раметры лазерного спектрометра КР: 1. Я, возбуждающего излуче-

ния

—

441,6;

488; 514,5; 633 нм. 2. Полуширина аппаратной функ-

ции

монохроматора на длине волны 500 нм ^ 1 см

-1

. 3. Обратная

линейная

дисперсия монохроматора — 0,45 нм/мм. 4. Коэффициент

подавления остаточного рассеянного излучения при возбуждении

излучением К = 441,6 нм и отстройке 40 см"

от возбуждаю-

щей линии и ширине щелей, соответствующих разрешению 4,4;

6, 6 и 8, 8 см"

, составляет соответственно 10

; 10

и 10*

>в

. 5. Ско-

рости сканирования спектра —

0,012;

0,04; 0,35 и 1,1 нм/мм.

6. Спектры хлорофилла и его производных (коэффициент экстинк-

ции

л-моль"

см"

) записываются при концентрации пигментов

10~

и выше. 7. Регистрация сигналов КР осуществляется в диапа-

зоне изменения скорости счета фотонов от 60 до 5-10* имп/мин.

Использование автоматизированной системы регистрации спект-

ров КР позволяет существенно упростить их обработку и получить

значительно больше информации по сравнению с регистрацией в сис-

теме ФЭУ — усилитель — самописец. В качестве демонстрации воз-

можностей разработанной системы регистрации на рис. 48, А приве-

дены спектры одного и того же образца с разным числом накопле-

ний.

При числе накоплений N в 16 существенно улучшается от-

ношение

сигнал/шум (в Y~N — 4 раза), что позволяет увеличить

интенсивность регистрируемого спектра.

Биологические объекты представляют собой многокомпонентные

системы, содержащие большое число люминесцирующих пигмен-

тов. Поэтому при многократной записи спектров происходит накоп-

ление люминесцентного фона, полностью маскирующего спектр

КР.

Разработанная система регистрации позволяет осуществить

вычитание фона люминесценции и, таким образом, реализовать

запись спектров КР люминесцирующих объектов. Из сопоставления

141

Д-).

см'

Д1.СН

-1

Рис.

48. Спектры комбинационного рассеяния (КР), полученные при различ-

ных условиях записи. А — спектр КР одного и того же образца при разном

числе накоплений; Б — однократный спектр КР образца без

вычитания

фона

люминесценции (/) и 12-кратный спектр КР без фона люминесценции (2)

142

спектров (рис. 4.8. Б) видно, что описанная система регистрации дей-

ствительно позволяет исследовать спектры КР окрашенных и лю-

минесцирующих образцов.

Использование многоканального анализатора в системе регист-

рации

спектрометра позволяет осуществлять целый ряд операций,

облегчающих снятие и интерпретацию спектров. Особенно важно

отметить возможность нормирования различных спектров и их срав-

нения

(вычитания) и сочетания анализатора с ЭВМ, что позволяет

автоматизировать процедуру обсчета спектров.

В свою очередь, ЭВМ снабжена необходимым набором программ

для анализа как спектра в целом, так и его отдельных линий. В част-

ности,

отдельная широкая полоса может быть разложена на ком-

поненты,

что важно для извлечения отдельных линий из уширен-

ной

полосы, являющейся суперпозицией вклада элементарных ко-

лебаний атомов или групп атомов молекул — компонентов иссле-

дуемого

соединения.

Глава

Методы

изучения

ионной

проницаемости

биологических

мембран

Микроэлектродные

методы

Микроэлектроды широко используют при изучении таких мембран-

ных процессов, как возбуждение нервных и мышечных клеток, хемо-

фоторецепция, преобразование световой энергии в хлоропластах,

движения в растениях и простейших. Изучение электрических свойств

мембран отдельных клеток

дает

важную информацию о механиз-

мах действия фармакологических агентов и природных физиологи-

чески активных веществ, позволяет проследить за изменениями

электрических свойств клеток в процессе эмбриогенеза, при росте

растений, запуске фотосинтеза.

Одна из

основных

функций

клеточный

мембраны

состой! в под-

держании трансмембранных ионных градиентов и селективного

транспорта веществ

между

цитоплазмой и средой.

Ионный

баланс

поддерживается благодаря наличию в мембране пассивных прово-

дящих путей — селективных ионных каналов, а также систем ак-

тивного транспорта и обменного транспорта ионов. В специализи-

рованных клетках различных видов выявлены системы активного

транспорта Н

, Са

, Na

, Cl~ и

других

ионов. Для идентификации

активных и пассивных ионных потоков в различных типах клеток не-

обходимо иметь сведения о стационарной величине мембранного по-

тенциала и внутриклеточных концентрациях ионов. Основой для

гакого анализа

служит

электродиффузионная теория, согласно ко-

торой поток J независимо движущихся ионов в однородной

среде

144

пропорционален действующей силе — градиенту электрохимиче-

ского потенциала (d

—

cud\i,'dx

— — uRTdc'dx

—zFcudy/dx,

(IV. 1.1)

где ^Г = |л

—(— RTlnc 4-

zFq>;

— стандартный химический

потенциал; с, и, г — концентрация, подвижность и валентность

иона

соответственно; ф — электрический потенциал.

Суммарный поток J

представляет собой разность встречно на-

правленных односторонних потоков (У,- = / — /). Можно показать

что односторонние пассивные потоки связаны

между

собой соотно-

шением Уссинга:

///"в

cJCi

ехрр>

= ехр[р(ф

—ф)],

(IV. 1.2)

где $ =

zF/RT;

— равновесный потенциал для данного иона, оп-

ределяемый по формуле Нернста:

= [/?Г/(г^)]1п(с

/с

). (IV. 1.3)

Выполнение соотношения (IV. 1.2) при подстановке

всех

входя-

щих в него величин — односторонних потоков, внутриклеточных

концентраций

и мембранного потенциала —

служит

критерием

того, что перемещение ионов в обоих направлениях через мембрану

происходит пассивно и независимо, без участия специфических пере-

носчиков

и активных транспортных систем.

Предварительное заключение о механизмах поддержания нерав-

номерного распределения ионов

между

клеткой и средой может

быть сделано без измерения ионных потоков, на основании сравне-

ния

измеряемого мембранного потенциала ф с равновесными потен-

циалами ф

для различных ионов. Близость значений ф и ф

ука-

зывает на преимущественно пассивное распределение данного иона

между

водными фазами мембранной системы, а значительное рас-

хождение значений — на существование в мембране специфиче-

ских транспортных систем, препятствующих выравниванию элект-

рохимического градиента данного иона.

Можно получить выражение для мембранного потенциала, созда-

ваемого пассивной диффузией:

1п

[Ко]

Р,

[Ма

]

с1

[С1

]

F ^lKl^

[№]

Р[С1]

Принято

считать, что мембранный потенциал нервных и мышечных

волокон,

а также некоторых

других

животных клеток обусловлен

основном диффузией ионов К, Na и С1 по концентрационным

градиентам.

Однако в некоторых объектах (харовые водоросли, клетки выс-

ших растений) мембранный потенциал намного превышает по аб-

солютной величине значения равновесных потенциалов для любого

145

из

перечисленных ионов, что указывает на существование в мемб-

ране дополнительных генераторов потенциала —

электрогенных

ионных

насосов.

Эти мембранные ферменты транслоцируют заряд

через мембрану и способны преобразовывать энергию АТФ или оки-

слительно-восстановительных реакций в электрическую форму.

Нативную клеточную мембрану можно уподобить насосу с

утеч-

кой

и представить ее в виде эквивалентной электрической схе-

мы,

содержащей два параллельных участка с собственными ЭДС

проводимостями.

Микроэлектроды позволяют регистрировать не только стационар-

ные параметры клеточных мембран, но и переходные электрические

процессы, вызываемые различными воздействиями. Наиболее под-

робно изучены явления электрической возбудимости нервных и мы-

шечных волокон.

Мембранные электрические процессы играют

ключевую

роль

механизме синаптической передачи возбуждения, а также в хе-

мо-,

фото- и механорецепции.

Одна из основных проблем биофизики мембран

—проблема

био-

энергетики.

Центральная роль в преобразовании энергии света и

редокс-процессов в энергию АТФ и

другие

виды работы в мембран-

ных системах хлоропластов и митохондрий принадлежит трансмем-

бранному электрохимическому градиенту протонов, который вклю-

чает

два компонента: мембранный электрический потенциал и транс-

мембранный градиент рН.

Прямые

измерения

электрического

потенциала

на энергосопря-

гающих мембранах крупных хлоропластов в ряде отношений ока-

зываются предпочтительными по сравнению с оптическими метода-

ми

регистрации. Эти преимущества связаны с проведением экспери-

ментов на отдельных пластидах, высоким отношением сигнала к шу-

му и возможностью использовать световые импульсы произвольной

длительности.

Индукционные

изменения

мембранного

потенциала

регулируют

перемещение ионов

между

тилакоидами и стромой хлоропласта,

влияя

косвенно на активность катионзависимых ферментов цикла

Кальвина.

Микроэлектроды используют не только для регистрации мембран-

ных потенциалов, но и в

других

целях: для электрической стиму-

ляции

возбудимых клеток, измерения проводимости мембран, элект-

рофоретической инъекции заряженных веществ.

Методом

инъек-

ции под давлением в клетки вводят не проникающие через мембра-

ну красители, по распространению которых в примыкающие клетки

можно

судить

о наличии межклеточных контактов. Таким же спо-

собом в клетки вводят фотобелок

экворин,

используемый в качестве

флуоресцентного зонда для регистрации внутриклеточной концент-

рации

Са

при различных воздействиях. Пропускание тока через

микроэлектрод

дает

возможность смещать мембранный потенциал

наблюдать за изменениями функциональной активности клетки

146

или

субклеточных

структур.

Например, приложение внешнего

электрического поля изменяет

выход

флуоресценции хлоропластов,

что

свидетельствует

о модификации переноса электронов в реакци-

онных центрах фотосистемы II. Контролируемое пропускание тока

через внутриклеточный электрод в целях смещения мембранного по-

тенциала составляет основу

метода

фиксации

напряжения

—одного

из

важнейших методов исследования возбудимых мембран.

Усовершенствование микроэлектродных методов привело в пос-

ледние годы к созданию

ион-селективных

электродов,

позволяю-

щих измерять активность К.'

", Н

, Са

, С1~ и

других

ионов

живой клетке. Ион-селективные электроды готовят из обычных

микропипеток,

заполняя гидрофобизированный кончик пипетки

жидким ионообменником или раствором нейтрального переносчика.

При

измерениях внутриклеточной активности ионов помимо ион-

селективного датчика в клетку вводят второй микроэлектрод, кото-

рый

служит

электродом сравнения.

Широкое

распространение получили микропипетки, сочетаю-

щие в себе

микроэлектрод

микроприсоской.

Такие электроды не

вводят внутрь клетки, а подводят вплотную к клеточной мембране

слегка втягивают мембрану в присоску. С помощью таких электро-

дов регистрируют токи одиночных ионных каналов в нативнои мем-

бране. Микроэлектроды, совмещенные с микроприсоской, обеспечи-

вают

высококачественную электрическую изоляцию в области кон-

такта мембраны со стеклом, благодаря

чему

они оказались

удоб-

ным

инструментом и при регистрации мембранных потенциалов

клетках малых размеров (диаметром до 10 мкм). Для проведения

таких измерений после подсасывания клетки к микропипетке мемб-

рану прорывают импульсом давления или электрическим током,

результате

чего

устанавливается контакт с внутриклеточным со-

держимым. При этом клетка не

получает

значительных поврежде-

ний.

В последующем изложении перечисленные методы начиная

с микроэлектродной регистрации биопотенциалов рассмотрены бо-

лее подробно.

Микроэлектродные методы

дают

возможность регистрировать из-

менения

мембранного потенциала с временным разрешением 10—

100 мкс в функционирующей клетке, не нанося ей существенного

повреждения. В отличие от прямых электрических измерений ре-

гистрация мембранных потенциалов с использованием потенциал-

чувствительных красителей

зачастую

оказывается более инерцион-

ной

и сопряжена с побочным токсическим действием красителей.

Попытки

измерять мембранный потенциал растительных клеток по

распределению проникающих ионов (типа тетрафенилфосфония)

осложнены связыванием этих ионов с мембраной, что приводит

ошибочным значениям (расхождение с реально измеряемыми зна-

чениями

достигает нескольких десятков милливольт).

Для микроэлектродных измерений пригодны клетки диаметром

не

менее 10 мкм. Хотя таким способом

удавалось

измерять мембран-

147

ный

потенциал эритроцитов человека,

ходе

измерений наблюда-

лось быстрое разрушение клеток.

При

работе

мелкими клетками

сказывается

утечка

электролита

из

кончика микроэлектрода,

приводящая

изменению ионного состава цитоплазмы.

При

измерении мембранного потенциала

клетку вводят микро-

электрод, который устанавливает контакт

между

внутриклеточной

средой

неполяризующимся хлорсеребряным

или

каломельным

электродом сравнения. Второй идентичный электрод сравнения

по-

мещают

наружный раствор. Разность потенциалов

между

элек-

тродами измеряют электрометрическим усилителем.

рассматри-

ваемой электрической цепи скачки потенциала

на

двух

электродах

сравнения

взаимно компенсируются; диффузионный потенциал

на

кончике

микропипетки сравнительно

мал, так как

подвижность

диффундирующих

из

кончика

С1~

водных растворах одина-

кова. Поэтому измеряемая разность потенциалов обусловлена прак-

тически полностью скачком потенциала

на

клеточной мембране.

Внутреннее сопротивление вольтметра должно намного (более

чем

100 раз)

превышать сопротивление внешней цепи. Несмотря

на

заполнение микроэлектродов концентрированным раствором

КС1,

их сопротивление остается достаточно высоким

составляет

10—

100

МОм. Для

измерения потенциала

такой цепи необходим

электрометр

входным сопротивлением

не

ниже

10 ГОм.

2. Свойства микроэлектродов

Микроэлектродами

принято называть капилляры

из

химически

стойкого стекла

оттянутым тонким кончиком, заполненные раст-

вором электролита,

хотя

действительности настоящий электрод

образуется

при

контакте металла

электролитом. Микроэлектрод

—

это только солевой микромостик, позволяющий установить элек-

рический контакт

внутриклеточной средой. Диаметр кончика

стандартных микроэлектродов лежит

за

пределами разрешающей

способности светового микроскопа,

т. е.

составляет менее

0,5 мкм.

Минимальные размеры кончика,

судя

по

электронным микрофото-

графиям,

не

превышают

0,05 мкм.

Потенциал

кончика. Для

заполнения микроэлектродов обычно

используют концентрированный раствор

КС1.

Благодаря одинако-

вой подвижности

и С1~ в

воде

(и

= ы_)

диффузионный

потенциал, определяемый формулой

примерно равен нулю. Однако полностью избежать появления скач-

ка

потенциала

между

микроэлектродом

средой

не

удается. Вели-

чина потенциала кончика зависит

от

физических свойств стекла

возрастает

уменьшением толщины кончика.

При

обламывании

мик-

ропипетки

потенциал кончика исчезает. Возникновение потенциала

148

Рис.

49. Схема кончика микроэлек-

трода. А — упрощенная эквивалент-

ная

электрическая

схема;

Б — геоме-

трия кончика микропипетки:

— сопротивление отверстия микропипет-

ки.

Re — сопротивление стенок капилля-

ра, Як — сопротивление электролита в

канале микропипетки, Е — разность скач-

ков

потенциала на наружной и внутрен-

ней

поверхностях стекла, С — емкость кон-

чика;

остальные объяснения см. в тексте

кончика

связано с ионообменными свойствами стекла и низким со-

противлением стенок капилляра в оттянутом носике микропипетки.

На

рис. 49, А показано, что электрическая цепь

между

средой

пипеткой замыкается не только через отверстие микропипетки,

но

частично и в

обход

его через тонкие стенки в области кончика.

Показанная

на

схеме

ЭДС отражает разность скачков потенциала

на

границах стекла с раствором. При погружении микроэлектрода

разбавленные солевые растворы потенциал кончика имеет отрица-

тельную

величину, точно так же как приобретает отрицательный

потенциал стеклянный калиевый электрод в

среде

с низкой кон-

центрацией К

•

Влияние ЭДС, включенной параллельно основному

пути тока, становится тем заметнее, чем меньше сопротивление

стенок капилляра.

Появлению

потенциала кончика также способствуют электро-

отрицательные атомы кислорода, входящие в

структуру

стекла.

Внутри капилляра вблизи отрицательно заряженной поверхности

создается избыток подвижных катионов, но понижена концентра-

ция

анионов. Основными носителями заряда в области двойного

слоя становятся катионы, в

результате

чего

на кончике микро-

электрода возникает диффузионная разность потенциалов со зна-

ком

«—» внутри кончика.

Потенциалу кончика свойственна зависимость от ионного состава

среды. Для того чтобы избежать ошибок в определении потенциала

покоя,

микроэлектроды сортируют и отбирают только те, у которых

потенциал кончика не превышает 5 мВ.

Диффузия

электролита.

При работе с мелкими клетками

следует

учитывать возможную диффузию электролита из кончика микро-

электрода в цитоплазму. Если

радиус

отверстия микропипетки ра-

вен а, а

угол

схождения кончика в радианах — 26 (рис. 49, Б),

то скорость диффузии КС1 из микроэлектрода в изотонический

раствор электролита рассчитывают по формуле

а = —

DnaQc,

149

где

D —

коэффициент диффузии,

с —

концентрация заполняюще-

го электролита. Расчетная скорость диффузии

КС1 из

микроэлект-

родов

диаметром кончика

0,2 мкм

составляет

5-10~

моль/с.

Такая

утечка

КС1

не

должна влиять

на

ионный состав сравнительно

крупных клеток,

но

может приводить

набуханию таких мелких

клеток,

как

эритроциты. Экспериментально измеряемая скорость

диффузии

КС1 из

кончика микроэлектродов варьирует

от 10~

до

10~

моль/с. Диффузия

КС1 из

микроэлектрода

не

всегда

приво-

дит

набуханию

даже

мелких клеток, объемом порядка

1 пл.

Клетки

некоторых эпителиальных тканей

обладают

высокой

проницаемостью,

результате

чего

устанавливается стационар-

ный

поток

клетку

и из нее в

окружающий объем.

Сопротивление микроэлектродов.

Микроэлектроды

диаметром

кончика

0,2 мкм,

заполненные

3 М

раствором КС1,

обладают

сопро-

тивлением

от 25 до 50

МОм. Микроэлектроды

со

слишком высоким

сопротивлением имеют большой

нестабильный собственный потен-

циал,

плохо пропускают токи,

ухудшают

временное резрешение

системы.

Сопротивление микроэлектрода

зависит

от

геометрии кончика:

где

а —

проводимость заполняющего электролита

(26

См/м

для 3 М

раствора

КС1).

Проводимость идеальных растворов определяют

из

уравнения Нернста

—

Эйнштейна:

В уравнении

(IV.2.1)

не

учитывают,

что

проводимость раствора

кончике микропипетки неоднородна

по

длине вследствие диффузии.

Градиент концентрации электролита проявляется

в том, что

сопро-

тивление микроэлектрода зависит

не

только

от

проводимости запол-

няющего раствора,

но и от

концентрации солей

во

внешней среде.

Например,

10-кратное снижение наружной концентрации электро-

лита приводит

увеличению сопротивления примерно

пять

раз.

Вольт-амперные

характеристики.

Пропускание через микро-

электрод тока более

3 — 5 нА

часто приводит

изменению

его со-

противления.

Это

проявляется

нелинейной зависимости тока через

микроэлектрод

от

приложенной разности потенциалов. Форма

вольт-амперной характеристики зависит

от

диаметра кончика.

Микроэлектроды

низким сопротивлением

относительно широким

кончиком

сохраняют квазилинейные электрические характеристики

при

пропускании тока

до

десятков наноампер,

тогда

как для вы-

сокоомных электродов нелинейность проявляется

при

гораздо мень-

ших токах.

При

подаче

на

микроэлектрод напряжений

несколько

десятков вольт часто можно наблюдать хаотичные колебания тока,

объясняемые закипанием электролита

кончике вследствие очень

высокой плотности тока. Предельные значения тока, пропускаемо-

го через микроэлектрод, составляют около

1 мкА.

150