Рубин А.Б. Современные методы биофизических исследований (Практикум по биофизике)

Подождите немного. Документ загружается.

'500

МОм

Рис.

81. Сравнение стан-

дартного микроэлектрод-

ного метода регистрации

мембранного потенциала

(А) и методов регистра-

ции

потенциала и фикса-

ции

напряжения с по-

мощью диализирующей

микропипетки

(5)

лением изоляции в области контакта плазматической мембраны с

внутриклеточным электродом, которое обычно не превышает

500 МОм.

3. Собственное сопротивление микропипеток, используемых для

внутриклеточного диализа, намного ниже сопротивления стандарт-

ных микроэлектродов; типичные значения для микроприсосок и

микроэлектродов составляют 4 и 100 МОм.

Утечка

электролита из кончика микроэлектрода — нежела-

тельный фактор, который приходится учитывать при микроэлект-

родном отведении. Использование диализирующих микропипеток

обеспечивает быстрый обмен ионов

между

цитоплазмой и микропи-

петкой и

дает

возможность контролировать ионный состав цито-

плазмы.

Важное преимущество метода микроотведения с использованием

микроприсосок

состоит в том, что данный метод обеспечивает

прин-

ципиальную возможность регистрировать на мембране одних и тех

же клеток как интегральный ионный ток, так и ионные токи оди-

ночных ионных каналов. Совмещение

двух

независимых подходов

дает

большую информацию о ион-транспортных системах, чем каж-

дый из методов в отдельности. Основные трудности анализа интег-

ральных (макроскопических) токов возбудимых мембран состоят

следующем.

1. При регистрации интегральных токов невозможно добиться

идеального разделения тока на отдельные компоненты, свойствен-

ные каналам одного вида.

Даже

подбор блокаторов и ионного состава

сред не обеспечивает полного разделения суммарного тока на не-

зависимые компоненты.

2. Последовательное сопротивление существенно сказывается

экспериментах по фиксации потенциала целых клеток, но его

влияние

практически полностью устранено при регистрации тока

одиночных каналов на микроучастках клеточной мембраны. Это

связано с тем, что сопротивление системы «мембрана с

утечкой»

намного больше сопротивления микропипетки.

201

3. При прохождении макроскопических токов может происхо-

дить накопление ионов в примембранных областях или уменьшение

их концентрации, что сказывается на кинетике ионных токов.

Токи

через одиночный канал крайне малы и не

могут

вызвать сколь-

ко-нибудь значительных изменений примембранных концентраций.

4. В классическом методе фиксации напряжения

трудно

отли-

чить потенциалзависимость проводимости одиночных каналов от

потенциалзависимости воротного процесса, поскольку изменения

проводимости

могут

быть вызваны как изменением числа открытых

каналов,

так и изменением проводимости отдельных каналов. При

регистрации токов одиночных каналов изменения этих

двух

типов

легко различимы, поскольку измеряемые параметры

несут

непосред-

ственную информацию о проводимости каналов.

Глава

Калориметрические

методы

исследования

биополимеров

мембранных

систем

Поглощение

или выделение теплоты — одно из наиболее универ-

сальных проявлений огромного числа физических, химических и би-

ологических процессов. Тепловой эффект процесса представляет со-

бой

фундаментальную термодинамическую характеристику, количе-

ственное измерение которой открывает широкие возможности для

выяснения

механизма процесса и решения ряда физико-химических

проблем. Совокупность методов оценки тепловых эффектов, со-

провождающих различные процессы, формирует самостоятельный

раздел науки, получивший название

калориметрия.

Обычно тепловые измерения проводят при постоянном давле-

нии

р. В этих условиях изменение внутренней энергии системы AU в

результате

химических реакций или

структурных

превращений

определяется некоторым количеством выделившейся теплоты, назы-

ваемой теплотой реакции AQ, и работой расширения pAU:

AU = U

— U

AQ—pAU,

откуда

AQ = AU + pAU = АН, где АН — изменение эн-

тальпии системы. Следовательно, тепловой эффект реакции при по-

стоянном

давлении целиком определяется изменением энтальпии

системы.

Существующие в настоящее время калориметрические методы

условно разделяют на три основных группы: 1) методы измерения

теплоты сгорания и теплотворной способности (сравнительно мало

применяются

в биологии и здесь подробно рассматриваться не бу-

дут); 2) методы реакционной (изометрической) калориметрии и 3)

методы измерения теплоемкости, энтальпии и энтропии в виде функ-

203

ции

наиболее фундаментальной физической переменной — темпе-

ратуры

(сканирующая

калориметрия).

Калориметры,

в которых практически вся выделяющаяся тепло-

та вызывает изменение их температуры А7\ позволяют измерить об-

щий

тепловой эффект процесса AQ = С AT, где С — теплоем-

кость калориметра, или тепловое значение калориметра, т. е. коли-

чество теплоты, необходимое для нагревания калориметрической

системы на 1 град. Такие калориметры называют

интеграторами.

Калориметры,

позволяющие измерять тепловую мощность Ф и ее

изменение

во времени, т. е. «термокинетику» данного процесса

(Ф

(/) = d

Q/dt),

называют измерителями мощности или

калори-

метрами-осциллографами.

Собственно

калориметр представляет собой сосуд, в котором про-

текают имеряемые тепловые процессы. Вызываемые ими изменения

температуры приводят к возникновению теплообмена с внешней

средой. Тепловой поток, который устанавливается

между

калори-

метрической системой и средой, тем больше, чем больше разность

температур и теплопроводность разделяющей среды.

Существует два

принципиальных

типа

калориметров,

различаю-

щихся теплопроводностью оболочки, отделяющей калориметриче-

скую систему от внешней среды. Если калориметрическая система

окружена совершенным термическим изолятором, т. е. теплопро-

водность равна нулю, то калориметр называется

адиабатным

(непроницаемым

для теплоты). Напротив, в

изотермических

калориметрах теплопроводность очень велика, теплота не аккуму-

лируется в калориметре, а быстро переходит во внешнюю

среду.

Разность

температур

между

калориметром и средой здесь всегда

мала, и для измерения тепловых эффектов в этом

случае

требуется

не

термометр, а прибор, измеряющий поток выделяющейся тепло-

ты.

В последнее время широкое распространение получили калори-

метры-осциллографы комбинированного типа, в которых осуществля-

ется значительный теплообмен

между

калориметрическим сосудом

вспомогательными частями прибора, но в то же время вся система

целом максимально изолируется от внешней среды. При этом

каждый момент времени центральная часть калориметра должна

находиться в состоянии, которое зависит только от производимой

данный момент тепловой мощности. В общем

случае

для выполне-

ния

этого условия необходимо обеспечить предельно малую тепло-

вую интертность системы, что достигается при большом отношении

поверхности к объему образца, т. е. при минимальном количестве

(объеме) образца. Выполнение этого условия в сочетании с чрезвы-

чайно

высокой чувствительностью системы регистрации тепловых

эффектов

реализуется во всех основных типах

микрокалориметров.

204

I. Метод реакционной или изотермической

микрокалориметрии

Метод

реакционной

микрокалориметрии

используют главным об-

разом для определения тепловых эффектов взаимодействия различ-

ных соединений при постоянной температуре и для изучения кине-

тики

реакций или процессов. В связи с этим техника реакционной

микрокалориметрии отличается целым рядом специфических осо-

бенностей. Кроме необходимости обеспечения высокой чувствитель-

ности большие сложности обусловлены проблемой старта — на-

чалом химической реакции или процесса. Как правило, старт осу-

ществляют

путем

смешивания компонентов реакциий. Схематич-

но

процесс представляют следующим образом: 1) термостатирова-

ние

реагентов; 2) приведение реагентов в прямой контакт и 3) пере-

мешивание системы. Обычно смесители работают по трем основным

принципам:

1) механическое разрушение перегородки (обычно стек-

лянной);

2) пространственное перемещение перегородки и 3) из-

менение положения компонентов в системе (переворачивание).

Основные сложности при смешивании в калориметрах состоят

том, что любая работа по смешиванию переходит в

теплоту.

Кроме

того, значительные тепловые эффекты

могут

возникать за

счет

ис-

парения

растворителя, обусловленного небольшими изменениями

суммарного объема жидкой фазы и давления в калориметрической

кювете. В последнее время в биологических исследованиях находят

все большее применение смесители (кюветы) проточного типа.

Прин-

цип

действия проточных калориметров состоит в непрерывном пере-

мешивании

двух

потоков, содержащих реагенты, и измерении раз-

ницы

температур растворов до и после перемешивания. Растворы

подаются в микрокалориметр прецизионными насосами, чрезвы-

чайно высокая стабильность работы которых обеспечивает высокую

чувствительность приборов, работающих обычно в дифференциальном

режиме.

Для нахождения термодинамических параметров исследуемой

реакции

предложено множество способов разной степени сложности.

Один из наиболее простых и широко применяемых способов исполь-

зуют

для расчета реакции образования комплекса с участием водо-

родных связей

между

белком Е и произвольным агентом А, обра-

зующим с белком комплекс в соотношении 1:1:

Измерение

тепловых эффектов процесса при постоянной концентра-

ции

белка и изменяющейся концентрации агента позволяет полу-

чить концентрационную зависимость теплового эффекта реакции

(рис.

82).

Пренебрегая изменением концентрации А за

счет

образования

комплекса ([А] значительно превышает IE]), концентрацию белка

системе представляют как [£] =

[ЕА]/(К

[А] +

[ЕА]),

205

[А],моль/л

Рис.

82.

Зависимость теплового

эф-

фекта реакции

(AQ) от

концентрации

произвольного агента

(Л),

образую-

щего

белком комплекс

соотноше-

нии

1 : 1

1/Ш,л/моль

Рис.

83.

Способ нахождения

кон-

станты равновесия

(К) и

стандарт-

ной

энтальпии

(АН°)

реакции комп-

лексообразования

по

эксперименталь-

ным данным, представленным

коор-

динатах

([£]/AQ)-Ml/HD

где К — константа равновесия. Полагают, что тепловой эффект

AQ взаимодействия прямо связан с концентрацией образующегося

комплекса: AQ = АЯ° [ЕА],

где А//

— стандартная энтальпия реакции.

Разделив первое уравнение на второе, получают уравнение

К[А]АН»

АН»

(V.1.1)

Из

(V. 1.1) определяют К и Д#° графическим путем, если экс-

периментальную зависимость AQ от [А] представить в координатах

(IE]!AQ)

ч- (1/MJ) (рис. 83).

Изменение

свободной энергии AG

и энтропии AS

реакции рас-

считывают из уравнений

—

TAS°.

=—

RT\nK; AG° =

Даже в самом простом

случае

строгая интерпретация получен-

ных данных

требует

осторожности. Как правило, неизвестно, про-

исходит ли самая простая реакция комплексообразования в одну

стадию. Суммирование тепловых эффектов разных стадий может

привести к явлению частичной тепловой компенсации. Более того,

образовании теплового эффекта кроме непосредственно реакций

образования комплекса, т. е. суммы тепловых эффектов образова-

ния

всех связей в комплексе,

могут

участвовать тепловые эффекты

конформационных

перестроек белка и сопутствующих гидратаци-

онных изменений в системе. В ряде случаев перечисленные эффек-

ты удается

учесть

с помощью независимых данных и расчетов; ра-

боты в этом направлении развиваются, так как реакционная кало-

риметрия представляет собой фактически единственный экспери-

ментальный метод исследования термодинамики при постоянной

температуре.

206

Дифференциальная

сканирующая

микрокалориметрия

Невозможность получения максимальной чувствительности в при-

борах, имеющих один микрокалориметрический элемент, обуслов-

лена рядом причин. ЭДС системы детекторных термопар Е пропор-

циональна разности температур

между

температурой образца —

внутренней оболочкой микрокалориметрического элемента (Т

) и

внешним

эталоном температуры — внешней оболочкой (Т

E =

f(T

-T

Следовательно, на Е оказывают влияние случайные изменения

температуры внешней оболочки АТ

, которые в лучшем

случае

ограничиваются величиной ~ 10~

град. Электрическая же схема

прибора позволяет измерять изменения температуры A (T

— Т

)

~ 10~

град и менее. Такая чувствительность не может быть реали-

зована в одиночном калориметре.

Гораздо более высокая чувствительность достигается при ис-

пользовании двойных калориметров, работающих по дифференци-

альной схеме: две одинаковые калориметрические ячейки распола-

гаются в аналогичных условиях внутри общего блока с общей внеш-

ней

оболочкой. В таких калориметрах добиваются практически

полного равенства констант времени микрокалориметрических эле-

ментов: т = С/Р, где С — теплоемкость ячейки, Р —

коэффи-

циент тепловых потерь. Высокая чувствительность относительных

(дифференциальных) измерений в этих приборах обеспечивается

за счет того, что ячейки имеют общую температурную точку Т

В условиях температурного сканирования дифференциальные теп-

ловые измерения в таких приборах

могут

осуществляться двумя

методами.

Метод

дифференциального

термического

анализа

(ДТА) сводится

регистрации разности температур

между

двумя тождественными

ячейками

с образцом и контрольным препаратом (эталоном), про-

греваемыми с одинаковой мощностью. Другой метод —

дифферен-

циальной

сканирующей

микрокалориметрии

— основан на изме-

рении

разности мощностей, подводимых к ячейкам, прогреваемым

со строго одинаковой скоростью. Этот метод позволяет количест-

венно

оценить тепловые эффекты (изменения теплоемкости, тепло-

ты фазовых переходов) исследуемых систем.

Для определения теплоемкости измеряют количество теплоты,

необходимое для увеличения температуры образца на единицу (гра-

дус) при постоянном давлении:

Поскольку теплоемкость зависит от температуры, при нахожде-

нии

теплоты фазовых (структурных) переходов из эксперименталь-

но

определяемого суммарного количества теплоты, необходимо-

го для увеличения температуры системы в области фазового пере-

207

АН

изотерми-

ческий

режим

АН

изотерми-

ческий

режим

Рис.

84.

Экспериментальные кривые, отражающие отклонение

от

базовой

ли-

нии

при

нагреве эталона

от

температуры

Г, до Т

(Л) и

нагреве образца

от

7"i до Г

(5)

(остальные объяснения

см. в

тексте)

хода,

вычитают вклад в энтальпию, обусловленный теплоемкостью

системы:

т,

I" C

dT.

Иными

словами, калориметрическую энтальпию перехода нахо-

дят из площади пика под экспериментальной кривой, обусловлен-

ного тепловыми эффектами перехода. Поскольку при температуре,

соответствующей середине перехода Г„,

энтропию перехода рассчитывают по уравнению

Д#„/Г

Это отношение справедливо и для неизотермического перехода,

так как работа системы сводится только к расширению при постоян-

ном

давлении.

Одним из широко распространенных дифференциальных скани-

рующих микрокалориметров является прибор ДСМ-2м. Он позво-

ляет проводить следующие стандартные измерения: определение

теплового потока Ф

в интересующей точке Т

заданного темпера-

турного интервала; энтальпии

А//-перехода;

теплоемкости.

Основные параметры прибора следующие: чувствительность

(при

соот-

ношении

сигнал/шум, равном

1) во

всем диапазоне температур сканирова-

ния

— не

более

10~* Вт;

дрейф нуля

изотермическом режиме

— не

более

Ю-

Вт/ч;

скорость сканирования

— от 0,5 до 64

К/мин

погрешностью

2%;

рабочий диапазон температур

— от 123 до 773 К.

Определение

теплового

потока

проводят путем сравнения соответствую-

щих параметров эталона (обычно корунд, прилагаемый

комплекте

прибо-

ру)

образца:

,л Ч Л

О6

208

Т,

7, Т

НагреГ

Рис.

85.

Экспериментальные кривые отклонения

от

базовой линии

при

поме-

щении

эталона

рабочую

(А) и

эталонную

(5)

ячейки калориметра

образ-

ца

рабочую

ячейку калориметра

(В)

где

v —

скорость сканирования, град-с"

;

С*

—

удельная теплоемкость

эта-

лона

при

температуре, взятая

из

аттестационных таблиц

тепловом комплек-

те;

эг

—

масса эталона, взятая

из

паспорта;

Л" —

амплитуда отклоне-

ния

от

базовой линии

при

нагреве эталона

при

температуре

(рис.

84);

А°

6р

—

амплитуда отклонения

от

базовой линии

при

нагреве образца

при

температуре

(рис. 84).

Для

определения

энтальпии

ДЯ-перехода используют метод сравнения

с эталоном-корундом,

основе которого лежит расчет:

ДЯ

ЭТ

где

t П

)/2; #

эт

и N

—

площади

под

кривой, измерен-

ные

при

помещении эталона поочередно

рабочую

эталонную ячейки кало-

риметра; Л'

обр

—

площадь

под

кривой, измеренная

при

помещении образца

рабочую

ячейку (рис.

85);

ДЯ

ЭТ

(Г }

— Н{Т,у ^(Т,)

"(Г,) —

удельные

энтальпии

эталона

при

температурах

и Т

(из

аттестационной таблицы);

/п

эт

—

масса эталона

(из

паспорта);

обр

—

масса образца.

Удельную

тепло-

емкость

при

заданной температуре определяют

по

уравнению

обр

добр

эт

Р),

где

С" —

удельная теплоемкость эталона

при

заданной температуре

(из ат-

тестационной таблицы). Остальные обозначения даны ранее.

помощью микрокалориметра ДСМ-2м

исследуют

тепловые па-

раметры

структурных

(фазовых) превращений липидов в природных

искусственных мембранах. Важное достоинство данного микрока-

лориметра — возможность проведения измерений в отрицательном

диапазоне температур. Необходимость этого обусловлена тем, что

большинство природных мембран содержит ненасыщенные липиды,

точка фазовых переходов которых лежит ниже 0° С. Определе-

ние

термодинамических параметров этих переходов, выяснение ро-

ли липидного состава, влияния эффектов гидратации, ионной силы

рН на эти параметры — наиболее типичные задачи, решаемые с

помощью микрокалориметров типа ДСМ-2 м.

209

Примерное

построение

учебной

задачи

1. Ознакомление

принципом работы микрокалориметра ДСМ-2м,

его

конструкцией, основными характеристиками

методами приготовления

об-

разцов.

2. Изучение зависимости амплитуды теплового эффекта

от

количества

липида

образце. Результаты представляют

виде графика.

3. Определение точек основного фазового перехода различных индиви-

дуальных

природных липидов. Результаты представляют

виде таблицы.

4. Исследование зависимости положения максимума фазового перехода

от степени гидратации липида (количество воды

системе изменять

от 0 до

15%).

5. Исследование зависимости

Т„ от

ионной силы

и рН

раствора.

При

выполнении задачи

могут

быть использованы

как

суммарные липи-

ды

из

природных источников,

так и

любые индивидуальные липиды.

Дифференциальные

адиабатные

сканирующие

микрокалориметры

В настоящее время метод дифференциальной сканирующей микро-

калориметрии применяется для исследования

всех

основных клас-

сов биполимеров: глобулярных и фибриллярных белков, нуклеино-

вых кислот, а также фосфолипидов и биологических мембран —

микросом печени, эритроцитов, хлоропластов и др. Эксперименты

проводят, как правило, в разбавленных растворах, в которых можно

пренебречь эффектами межмолекулярных взаимодействий. Однако

таких растворах тепловые эффекты, обусловленные макромолеку-

лами, чрезвычайно малы. Например, теплоемкость биополимеров в

0,3%-ном растворе составляет лишь тысячную

долю

от общей теп-

лоемкости растворителя. Поэтому определение с достаточной сте-

пенью точности тепловых эффектов в этих условиях на фоне посто-

янно

вводимой в систему теплоты

требует

сверхпрецизионных ме-

тодов.

Детальное исследование внутримолекулярных процессов стало

возможным лишь после создания принципиально нового прибора —

дифференциального

адиабатного

сканирующего

калориметра.

Чувствительность этого прибора на три порядка превосходит

чувст-

вительность обычных приборов неадиабатного типа. Широкое рас-

пространение и мировую известность получил прибор ДАСМ-1м и

затем разработанный на его основе усовершенствованный вариант

микрокалориметра — ДАСМ-4.

Основные эксплуатационные параметры прибора ДАСМ-!м: рабочий

диа-

пазон

температур

— 0—100 °С,

скорость прогрева

— 0,1—2,0

град/мин,

ра-

бочий объем кюветы

— 1,0 мл,

чувствительность

по

теплоемкости

— 1,6Х

10—

Дж-град-

•

мл—

точность определения относительной теплоем-

кости

— 8 -10~

Дж

•

град-

•

мл-

точность регистрации температуры

—

— 0,1

град.

Уникальная чувствительность этих приборов определяется со-

вокупностью

трех

методических принципов, заложенных в их ос-

нову: дифференциальной схемы измерения, непрерывного прогрева

210