Рубин А.Б. Современные методы биофизических исследований (Практикум по биофизике)

Подождите немного. Документ загружается.

Рис.

86.

Схема микрокалориметра:

— моностат, г —термометр, 3 — самописец,

— измеритель теплового

эффекта,

5 — тер-

морегулятор термостата, 6 — терморегулятор

адиабатизирующей оболочки

с точно заданной скоростью

полной адиабатизации

из-

мерительных ячеек.

Проблема точности микро-

калориметрических измере-

ний

непосредственным обра-

зом связана

проблемой

точ-

ности заполнения кюветы

конструктивными особенно-

стями калориметрического

блока.

приборе ДАСМ-1м

эти

проблемы решены

путем

применения

специального без-

разборного калориметриче-

ского блока

системой адиа-

батизации

на

тепловых экра-

нах

(рис. 86).

Применение

внешнего заполнения

с по-

мощью подводящих капиллярных трубок

проведение измерений

при

повышенном постоянном давлении позволяет повысить надеж-

ность калориметрических измерений, воспроизводимость

результа-

тов

упростить процедуру измерения.

Используемый

приборе принцип адиабатизации заключается

следующем.

При

подаче электрического тока

нагреватели

мик-

рокалориметрических ячеек температура последних повышается.

Одновременно пропорционально-интегральные регуляторы автома-

тически обеспечивают

высокой степенью точности выравнивание

температуры тепловых экранов

температурой ячеек.

результа-

те этого камеры оказываются

условиях, близких

адиабатным,

когда практически

отсутствует

теплообмен камер

окружающей

средой.

Эти

условия обеспечиваются

широком температурном

ди-

апазоне

при

прогревании ячеек

постоянной скоростью.

4. Калориметрические измерения

Основные трудности калориметрических измерений связаны

с ин-

терпретацией экспериментальных кривых

условиях, когда

тер-

моиндуцированный

переход

индивидуальных соединениях

про-

ходит

несколько стадий,

также

при

усложнении состава систе-

мы

формы калориметрической кривой.

Сравнительно проста интерпретация калориметрических

кри-

вых, описывающих одиночный термоиндуцированный

переход

индивидуальном соединении.

Это

относится

микрокалориметри-

ческим кривым термоденатурации большого числа глобулярных

белков, некоторых фибриллярных белков (например, проколлаге-

на),

ДНК и

мембранных

структур

из

индивидуальных (синтети-

ческих) липидов. Резко усложняется интерпретация многокомпо-

211

W SO 90

Температура,

"С

Рис.

87.

Типичная экспериментальная калориметрическая кривая процесса

денатурации лизоцима

(а) и

базовая линия

калибровочной меткой, получен-

ная

при

заполнении

обеих

ячеек растворителем

(б)

(остальные объяснения

см.

тексте)

нентных калориметрических кривых теплопоглощения в прогревае-

мых растворах индивидуальных РНК и ряда больших белков. Био-

логические мембраны и их фрагменты—несравненно более сложный

объект для калориметрических исследований. Трудности заключа-

ются главным образом в невозможности однозначно интерпрети-

ровать структурные переходы, выделить их и определить энталь-

пию отдельного

перехода.

Рассмотрим

результаты

микрокалориметрических измерений на

примере простого и подробно изученного процесса — денатурации

глобулярного белка лизоцима. Типичная экспериментальная кри-

вая приведена на рис. 87. Наряду с микрокалориметрической за-

писью прогреваемого раствора лизоцима (1,6 мг/мл, рН 4,5) при-

ведена базовая линия с калибровочной меткой, полученная при

заполнении

обеих камер растворителем. Из рисунка видно, что теп-

лоемкость раствора белка значительно ниже теплоемкости раство-

рителя. По снижению линии записи от базовой линии Д/

рассчи-

тывают парциальную теплоемкость белка при любой температуре

учетом

того, что

-М

= С

—С

аст

ArnP"",

где С

и С

СТ

— парциальная теплоемкость белка и растворителя;

— масса белка в ячейке; АтР

аст

— масса вытесненного им рас-

творителя. Так как

где V

1/Р

аст

— парциальный объем белка и растворителя,

212

то

Таким

образом, метод позволяет получить температурную за-

висимость теплоемкости нативного белка (С") ниже области пере-

хода;

температурную зависимость теплоемкости денатурирован-

ного белка C

и разницу теплоемкостей нативного и денатури-

рованного

состояний в точке перехода:

ДСр

= Ср —Ср.

Как

видно из термограммы (рис. 87) в области 70° С развива-

ется интенсивное теплопоглощение, связанное с денатурацией белка.

По

площади денатурационного пика, ограниченного снизу экстрапо-

лированными

значениями теплоемкости нативного С

и денатури-

рованного

Cf, белка, можно определить теплоту денатурации имею-

щегося в калориметре белка, а отсюда

удельную

и молярную

АН

энтальпии денатурации: AH

= MAh

, где М — молеку-

лярная

масса белка.

Полная

тепловая денатурация глобулярных белков относится

одному из наиболее глубоких типов конформационных переходов,

связанных

с перестройкой всех нековалентных внутримолекуляр-

ных контактов, сопровождающихся резкими изменениями всех фи-

зико-химических свойств белков. Этот переход происходит в срав-

нительно

узком интервале температур, определяемом совокупно-

стью внутренних свойств белка и внешних условий. Термодинами-

ческий

анализ процесса обычно основывается на допущениях, что:

1) денатурация протекает как переход

между

двумя состояниями,

т. е. подобно мономолекулярной химической реакции; 2) все пере-

ходы

в системе протекают независимо и 3) энтальпия перехода не

зависит от температуры. Используя параметр, отражающий степень

перехода, в =

где С" и С

— парциальное количество бел-

ка

в нативном и денатурированном состояниях, константу равно-

весия

нативной и денатурированной формы представляют в виде

К = 8/(1 — в). Тогда эффективную энтальпию перехода находят

по

уравнению Вант-Гоффа:

=RT

d\nK/dT.

Так

как в средней точке перехода 9 = 0,5 (при Т — Т„), то

Зависимость

в от температуры находят экспериментальным пу-

тем с помощью разнообразных методов: оптической спектроскопии,

ЯМР

и т. д. Эффективную энтальпию перехода определяют и кало-

риметрическим путем, исходя из уравнения

f = 4RT*

(dAH/dT)

213

где

ЛС»«.

Отсюда

Таким

образом, сканирующая калориметрия позволяет опреде-

лить калориметрическую энтальпию денатурации АН, не прибегая

ни

к каким допущениям, по площади пика на калориметрической

кривой.

Из той же экспериментальной кривой, исходя из остроты

перехода

dAH/dT,

определяют энтальпию Вант-Гоффа.

Значения

калориметрической энтальпии денатурации и энталь-

пии

Вант-Гоффа (определяемой по остроте

перехода)

обычно совпа-

дают

у различных глобулярных белков.

Для вычисления температурной зависимости свободной энергии,

стабилизирующей нативные белки, используют выражение

Тп

— f AC

dT+ Г

Плавление ДНК и ее синтетических моделей также проявляется

на

калориметрической кривой в виде одиночного пика. Этот про-

цесс,

протекающий с высокой степенью кооперативности, представ-

ляет собой распад двуспиральной

структуры

на две полинуклео-

тидные цепи, сворачивающиеся в отдельные хаотические клубки.

Отличительная черта процесса — равенство теплоемкостей натив-

ного С

и денатурированного C

состояний ДНК. Это сильно упро-

щает нахождение тепловых эффектов плавления. При условии

ДСр = 0 упрощается также определение свободной энергии AG

стабилизации нативной

структуры

ДНК по приведенной выше

формуле.

Совершенно иной тип

структурных

переходов, формирующих

также одиночный пик на калориметрической кривой, —

переход

гель

—

жидкокристаллическое

состояние

(основной фазовый пере-

ход) в мембранных

структурах

из индивидуальных липидов. В от-

личие от рассмотренных выше биополимеров степень кооперативно-

сти основного фазового

перехода

липидов в мембранах фактически

целиком определяется не внутримолекулярными, а межмолеку-

лярными

взаимодействиями. Для этих систем эффективная энталь-

пия

Вант-Гоффа обычно больше калориметрически определяемой

энтальпии.

В общем виде степень кооперативности процесса зада-

ется соотношением

где JV — число молекул в так называемой кооперативной единице.

214

2,10,

20 30 40 50 60

Температура,

"С

Рис.

88. Экспериментальная термограмма плавления

тРНК

(/) и результат ма-

тематического «разложения» термограммы на отдельные кооперативные пере-

ходы

(2—6),

каждый из которых описывается уравнением Вант-Гоффа

Часто степень кооперативности процесса характеризуют пара-

метром кооперативности

а,

который находят

из

выражения

(ДЯ/ДЯ«")

Связь

параметра кооперативности

размером кооперативной

единицы находят

из

Сопоставление энтальпии Вант-Гоффа

калориметрически

оп-

ределяемой энтальпии позволило определить размеры кооператив-

ной

единицы

при

фазовом

переходе

большого числа индивидуаль-

ных (синтетических) липидов.

зависимости

от

типа липида

и экс-

периментальных условий размер кооперативной единицы варьиру-

ет

от

десятков

до

нескольких сотен молекул.

В липидных

структурах

сложного состава характер термотроп-

ных переходов

и их

интерпретация усложняются. Основные наблю-

даемые эффекты: изменение температуры фазового перехода

Т„,

возрастание полуширины перехода (снижение кооперативности),

изменение энтальпии перехода.

ряде

случаев

на

калориметриче-

ской

кривой

могут

проявляться эффекты разделения

фаз, т. е. два

(или

более) максимума

на

термограмме, каждый

из

которых

обу-

словлен фазовым переходом одного

из

компонентов, формирующих

при

низких

температурах

самостоятельную микрофазу

мембранах.

Этот эффект наблюдается, например,

системах, содержащих

два

липида, резко отличающихся длиной углеводородных цепей.

Сложные многокомпонентные калориметрические кривые наблю-

даются обычно

при

плавнении РНК, больших белков

субъединиц.

Трудности интерпретации этих кривых определяются

как

сложным

многокомпонентным характером самого процесса плавления (дена-

турации),

так и

методическими проблемами разделения

опреде-

ления

отдельных тепловых составляющих процесса. Один

из

пред-

215

ложенных методов математической обработки таких кривых основан

на

«разложении» сложных термограмм

на

отдельные кооператив-

ные переходы, каждый

из

которых описывается уравнением

Ван-

Гоффа. Например, термограмму плавления

тРНК

удалось

разло-

жить таким образом

на

пять составляющих пиков, первый

из ко-

торых относится

плавлению третичной

структуры

(20 %

общего

теплового эффекта, равного

Дж/г), остальные

— к

плавлению

четырех

спиральных участков

структуре

тРНК

(рис. 88).

Сложности

при

работе

биологическими мембранами (фрагмен-

тами) заключаются главным образом

невозможности однозначно

интерпретировать регистрируемые структурные переходы

в тер-

минах термодинамики, определить энтальпию отдельных

структур-

ных переходов. Вопрос математической обработки термограмм

био-

логических мембран остается пока открытым.

большинстве

ис-

следований, посвященных изучению тепловых эффектов

мембран-

ных системах

при

температурном сканировании, сделаны попытки

качественно связать

тот или

иной максимум

на

термограммах

участием

тех или

иных молекулярных компонентов мембран.

При

этом обычно полагают,

что

термообратимые переходы затрагивают

липидные компоненты мембран. Важный метод идентификации

тер-

мотропных переходов

—

выяснение характера влияния разнооб-

разных внешних факторов

на

результаты

экспериментов.

Эти

рабо-

ты лишь начинаются, однако

уже

сейчас имеющаяся интерпретация

ряде

случаев

(мембраны

Acholeoplasma laidlawii. Escherichia coli,

макрофаги крыс, тени эритроцитов, вирусы

и т.д.)

представляется

достаточно убедительной

интересной. Метод сканирующей микро-

калориметрии несомненно перспективен

для

выяснения механиз-

мов термостабилизации

принципов повышения устойчивости

био-

логических систем

экстремальным температурам.

Примерное построение учебной задачи

1. Ознакомление

принципом работы микрокалориметра ДАСМ-1м

(ДАСМ-4),

его

конструкцией

основными характеристиками.

2. Освоение экспериментальной техники

методик подготовки образцов,

заполнения

мытья кювет (ячеек).

3. Запись термограмм глобулярных белков,

ДНК или

индивидуальных

липидов

диапазоне температур

5—95°

С.

4. Определение калориметрической энтальпии перехода

вычисление

эффективной

энтальпии процесса

использованием калибровочных меток.

Определение степени кооперативности термоиндуцированного перехода

в ис-

пользованном препарате.

5. Исследование зависимости

от

ионной силы

и рН

раствора.

216

Глава

Монослои

липидов

на

границе раздела

воздух

— вода

Исследование мономолекулярных слоев

(монослоев)

дает

информа-

цию

о таких физических параметрах индивидуальных веществ, как

поверхностное давление монослоя, молекулярная площадь вещества

монослое, зависимость поверхностного давления от молекулярной

площади.

Для смеси веществ можно получить информацию о сме-

шиваемости компонентов, о стехиометрии и энергетике взаимодей-

ствий,

о сродстве водорастворимых веществ к липидам.

Метод

моно-

слоев

служит основой для получения мультислоев ориентированной

липиднои

системы и создания модельных мембран заданного состава

их архитектоники. Монослойную методику используют также на

практике,

например в микроэлектронной технологии для ориента-

ции

и сборки компонентов, в контроле чистоты сред при высоком

уровне требования, в экологических работах и др.

Поверхностное натяжение на границе раздела газ — жидкость,

или

положительная

свободная

энергия

образования границы

раздела, является условием существования границы раздела. По-

верхностное напряжение границы раздела у определяют как у

•--

•

- AF/AS, где А/

— изменение свободной энергии, AS— изме-

нение

площади поверхности.

Свободную энергию образования границы раздела можно рас-

сматривать также как работу, необходимую для переноса молекул

жидкости из объема (субфазы) на поверхность раздела фаз. Необхо-

димость такого переноса обусловлена тем, что силы, действующие в

субфазе на определенную молекулу со стороны

других

молекул,

скомпенсированы,

тогда

как на расположенную на поверхности раз-

дела молекулу

действуют

силы притяжения только со стороны

217

субфазы. Глубина слоя нескомпенсированных

сил на

границе

раз-

дела определяется характером взаимодействия

между

молекулами

воды.

отсутствие ионов

это

ван-дер-ваальсовы взаимодействия,

интенсивность

которых снижается пропорционально седьмой степе-

ни

расстояния

между

молекулами. Таким образом, зона нескомпен-

сированных

взаимодействий

не

превышает нескольких диаметров

молекул.

Согласно уравнению Гиббса, поверхностная плотность вещества

для адсорбции

на

поверхности раздела

фаз

имеет следующее выра-

жение:

r=—[a/(RT)}(dvtda),

где

—

поверхностная плотность вещества,

а —

активность

ве-

щества

субфазе.

Если

вещество накапливается

на

границе раздела,

то

dyida.

должно иметь отрицательный знак, поскольку адсорбция

на гра-

нице

раздела, например

для

липида, должна приводить

сниже-

нию

измеряемого поверхностного натяжения. Тогда разность

у„ —

—

Y (

Vo —

поверхностное натяжение

на

границе

«чистой»

во-

ды,

у —

поверхностное натяжение после адсорбции

на

границе

раздела, например, липида) определяют

как

поверхностное давле-

ние

адсорбированной пленки.

Монослой

на

границе раздела можно рассматривать

как

пленку,

которой развивается давление, равное поверхностному давлению

(ПД):

=Т

—Траст.

где YB

Траст

—

поверхностное натяжение воды

раствора.

1. Методика измерения поверхностного натяжения

использованием пластинки Вильгельми

При

измерениях поверхностного натяжения

на

поверхность воды

или

водного раствора опускают пластинку прямоугольной формы.

Ма-

териалом пластинки обычно служит платина, которую прокалива

нием

легко освободить

от

следов органических веществ. Использу-

ют также стекло

другие

материалы.

На

границе раздела

фаз на

пластинку действует сила поверхностного натяжения

(рис. 89).

Эта сила затягивает пластинку

воду,

ее

значение измеряют

уст-

ройством, преобразующим механическую силу

электрический

Рис.

89. Взаимодействие пластинки

Вильгельми и воды на границе раздела

фаз:

—

высота подъема жидкости

при

контакте

пластинкой

Вильгельии, в краевой

угол

218

сигнал,

например

механотроном.

Измеряемая

масса

пластинки

рав-

на:

где 7 —

поверхностное

натяжение

раствора;

р —

периметр

плас-

тинки;

ы>

пл

—

истинная

масса

пластинки.

Когда

на

поверхность

раздела

нанесено

очень

малое

количество

вещества,

равно

поверхностному

натяжению

субфазы

воды

или

раствора.

При

уменьшении

площади

раздела

происходит

снижение

Нанесение

образца на поверхность раздела фаз. Используют

чистую

дис-

тиллированную

воду

или растворы, компоненты которых предварительно

прокаливают при

500—600°

С для удаления органических загрязнений.

Нанесение

образца

из

раствора

органического

растворителя.

Вещество,

например

липид, растворяют в определенном растворителе; обычно исполь-

зуют

универсальную смесь гексан: этанол (9:1 по объему). На поверхность

воды наносят 1—20 мкл раствора микрошприцем так, чтобы его конец касал-

ся

поверхности воды. Чтобы наслаивание проходило равномерно, пользуют-

ся

стеклянными пластинками или палочками, по поверхности которых раст-

вор стекает медленнее. Концентрацию вещества в образце рассчитывают по

величине молекулярной площади в конденсированном монослое (для липидов

0,2—0,8

нм

) и с

учетом

площади поверхности раздела (удобно наносить такое

количество вещества, чтобы его регистрация начиналась при промежуточных

значениях поверхности раздела).

Пример.

При нанесении фосфолипида димиристолфосфатидилхолина

желательно иметь площадь конденсированного слоя 100 см

; его молекуляр-

ная

масса — 697. Количество молекул, которое

следует

нанести на поверх-

ность раздела, составит: 100 см

/0,5 нм

2-10".

Так как 1 моль содержит

6,02-10

молекул, то надо нанести около 30 нмоль фосфолипида. Такое ко-

личество вещества по массе равно 697-3-Ю-

, т. е. 21 мкг. После нанесения

раствора на поверхность выжидают 10—15 мин до полного испарения орга-

нического растворителя.

Нанесение

вещества

виде

кристалла.

Кристаллы липида аккуратно на-

слаивают на поверхность раздела фаз так, чтобы они оставались на поверхно-

сти, не погружаясь в субфазу.

Осмотическое

распластывание

вещества.

Этот метод используют для по-

лучения фосфолипидных монослоев, содержащих мембранные белки, а так-

же для монослоев чистых липидов, моноламеллярных липосом или мембран-

ных пузырьков. Субфаза должна иметь достаточно высокую ионную силу, на-

пример содержать

0,1—0,15

М раствор

NaCl.

Стабильность и скорость сжатия монослоев. Полученные одним из изло-

женных методов монослои оказываются нестабильными в том смысле, что в

них липид не находится в равновесии с липидом в субфазе. Липид из монослоя

при

низком ПД постепенно растворяется в субфазе. При увеличении ПД ско-

рость растворения липида замедляется, видимо, за счет усиления ван-дер-

ваальсовых и гидрофобных взаимодействий

между

гидрофобными частями мо-

лекул вещества. Отсюда

следует,

что стабильными

могут

быть такие монослои

липидов, которые формируются из молекул, выходящих из субфазы на по-

верхность раздела. При этом достигается «равновесие» ПД — ПД

. Од-

нако

такой метод образования монослоя имеет свои трудности. При ПД >

> ПД

монослой коллапсирует и в виде конденсированной фазы отрывается

от границы раздела. При ПД < ПД

происходит его растворение в субфазе.

Монослой

можно считать практически стабильным, если в течение 30 с ПД

условиях

«поджатого»

монослоя уменьшится не более чем на 5 %. Скорость

«поджатия»

монослоя рассчитывают не на единицу площади измерения моно-

219

слоя,

а на

одну молекулу

монослое. Обычно используют скорость «поджа-

тия», равную

0,01—0,1

нм

-моль~

-мин-

При

более высоких скоростях

молекулы

монослое

не

успевают релаксировать,

при

более низких

—

воз-

растает время измерений.

2. Исследование свойств липидных монослоев

методом изотерм

Определение поперечного сечения липидов и их взаимодействия

веществами в

субфазе.

Наиболее четкий параметр монослоя

—

молекулярная

площадь

липида

(Л), т. е.

площадь, занимаемая одной

молекулой.

конденсированном слое

определяется

при

экстрапо-

ляции

наиболее крутой части изотермы

на ось х

графика зависимо-

сти

ПД от

площади монослоя, получаемого

при

измерениях

с по-

мощью двухкоординатного потенциометра. Таким образом, метод

монослоев позволяет получать данные

площади поперечного сече-

ния

липида

монослое.

Для

фосфолипидов поперечное сечение зави-

сит

от

типа головки липида

степени ненасыщенности жирнокислот-

ных цепей. Специфика взаимодействий

между

компонентами

мо-

нослоя,

также гидрофильной части молекул

субфазы может

из-

менять величину

А.

Ионы

молекулы субфазы влияют

на

структу-

ру воды

пограничном слое

укладку

головок липида

на

границе

раздела.

Исследование

взаимодействия веществ в монослоях.

Снимают

се-

рию изотерм монослоев

при

различном молярном соотношении

ис-

следуемого

вещества

липида

монослое.

По

полученным данным

строят диаграмму зависимости

А от

молярной доли исследуемого

ве-

щества

смеси. Такая диаграмма

(рис. 90)

содержит информацию

комплексах

монослое

из

холестерина

дигексадецилфосфати-

дилхолина. Комплексы

со

стехиометрией

1:1 и 4:1

образуются

присутствии указанных веществ,

но

добавка

субфазу поликремни-

евой кислоты обусловливает образование комплексов только

со сте-

хиометрией

1:1.

Определение смешиваемости веществ в монослоях. Для

опреде-

ления

смешиваемости

двух

компонентов

монослое применяют

пра-

вило

фаз. При

постоянстве температуры

давления число степе-

ней

свободы

для

бинарного монослоя имеет выражение

/ = с —

—

р + 1, где с —

число компонентов,

р —

число

фаз. Для би-

нарной

системы

с = 2 и / = 3 — р.

Если

на

диаграмме

FIX

—

состав монослоя,

F —

какой-либо параметр монослоя,

например коллапс одного

из

компонентов

или

фазовый

переход

од-

ного

из

компонентов)

F не

зависит

от X, то / - 0.

Отсюда

р -- 3,

т.

е. в

системе

сосуществуют

три

компонента:

два

индивидуальных

вещества

и их

смесь. Если

зависит

от X, то для

бинарной системы

существуют

две

степени свободы

и 2 = 3 — р, т. е. р = 1. Эти ком-

поненты смешиваются.

Определение структурных перестроек в монослоях. На

изотер-

мах липидных монослоев

могут

быть видны

переходы, обусловлен-

220