Рубин А.Б. Современные методы биофизических исследований (Практикум по биофизике)

Подождите немного. Документ загружается.

ния

при

постоянстве напряженности

магнитного поля

Н или

напряженность

при

постоянстве

Из

практических соображений приме-

няют второй способ регистрации резо-

нансного

поглощения.

простейшем

виде резонансное поглощение представ-

ляет собой

узкую

одиночную линию

ре}

(рис.

96),

хотя

действительности

ре-

зонансное

поглощение представляет

бо- р

ис

. 96.

Одиночная линия

лее сложную кривую зависимости погло- поглощения ЭПР

щения

радиочастотного излучения

от

напряженности

поля.

Это

связано

с тем, что

магнитный момент

не-

спаренного электрона взаимодействует

не

только

внешним

маг-

нитным

полем,

но и с

внутренними полями, источниками которых

являются соседние неспаренные электроны,

ряд

ядер, обладающих

магнитными моментами.

Принцип построения спектрометров ЭПР.

Спектрометр

ЭПР со-

стоит

из

магнита, создающего стабильное магнитное поле, которое

можно плавно изменять

требуемом

диапазоне напряженностей;

источника

радиочастотного излучения; системы, позволяющей

под-

вести радиочастотное излучение

образцу

зарегистрировать

ре-

зонансное

поглощение; системы усиления

обработки сигнала

(рис.

97).

В качестве источников постоянного магнитного поля применяют

электромагниты.

Для

того

чтобы сигналы

ЭПР

регистрировались

бел искажений, необходимо, чтобы магнитное поле было однород-

ным

стабильным. Этого

достигают

применением стабилизирован-

ных источников питания

точной установкой полюсных наконеч-

ников

магнита. Помимо этого,

спектрометрах

ЭПР

содержатся

схемы, позволяющие проводить линейное

плавное изменение

на-

пряженности

поля

заданной скоростью

и в

заданном диапазоне.

Напряженность

поля измеряют

помощью специальных магнито-

метров. Источниками радиочастотного излучения

служат

специаль-

ные

генераторные лампы

—

клистроны.

Широкое

распространение получили спектрометры, работающие

на

длине волны

3 см (v « 10

Гц), —

спектрометры Х-диапазона.

Применяют

также спектрометры Q-диапазона

(Х, « 8 мм, v «

»2,4-10

Гц). Реже применяют спектрометры, использующие излу-

чения

и с

другими длинами волн, например

2 мм, 4 мм, 1,25 см.

Частота генерации клистрона поддерживается постоянной

с по-

мощью системы автоподстройки частоты (АПЧ). Питание клистро-

нов

осуществляется

от

стабилизированных источников,

с тем

чтобы

избежать изменений частоты

мощности генерируемого излучения.

Для передачи СВЧ-излучения

образцу используют волноводы—

металлические трубки определенного сечения, являющиеся анало-

231

гами высокочастотных кабелей. Совокупность волноводов называет-

ся

волноводным или СВЧ-трактом спектрометра.

Помимо

волноводов как таковых в волноводный тракт спектро-

метра

входит

ряд элементов. Один из них

—резонатор.

Он рас-

положен

между

полюсными наконечниками электромагнита, и имен-

но

в нем помещен образец. Резонаторы являются аналогами колеба-

тельных

контуров, которые накапливают энергию подводимых к ним

* 9

н=

• 10

—

-•

Рис.

97.

Схема радиоспектрометра

ЭПР с

проходным

(А) и

отражательным

(Б)

резонаторами:

А:

I — магнит. 2 — модулятор. 3 — аттенюатор. 4 - согласователь, 5 - рабочий резона-

тор, в — СВЧ-детектор, 7 — резонансный усилитель, в — синхронный детектор, 9

усили-

тель

постоянного тока. 10 — самописец. 11 — ферритовый вентиль, 12 — система АПЧ.

— осциллограф. ;•*--клистрон, /5 - блок питания; Б: / — магнит, 2 — модулятор, 3 —

детекторная секция. 4 — предусилитель, 5 — резонансный усилитель, 6 -- синхронный

детектор, 7 — усилитель постоянного тока. 8 — резонатор, 9 — согласователь, 10 — цир-

кулятор. // фазовращатель, 12 — система АПЧ, 13 — осциллограф, 14 — самописец, 75 —

аттенюатор. 16 -- ферритовый вентиль, П — клистрон. 18 — ферритовый вентиль, 19 —

блок питания

232

колебаний,

если частота колебаний

соответствует

резонансной час-

тоте

контура. Назначение резонатора состоит в концентрирова-

нии

на образце энергии СВЧ-излучения, приходящего от клистрона

по

волноводам. Объемные резонаторы, используемые в ЭПР-спект-

рометрах, различаются по конструкции. Чаще всего применяют ци-

линдрические или прямоугольные резонаторы. В цилиндрических

резонаторах напряженность магнитной составляющей СВЧ-волны

максимальна в центре резонатора; в прямоугольных — область

максимальной напряженности магнитной составляющей представ-

ляет собой плоскость, проходящую через центр резонатора. Иссле-

дуемый образец помещают в резонатор радиоспектрометра таким

образом, чтобы он находился в области максимальной напряженно-

сти магнитной составляющей. По этой причине в цилиндрические

резонаторы образцы момещают обычно в тонких капиллярах, а в

прямоугольных — используют плоские кюветы.

Биологические образцы, как правило, содержат много воды,

молекулы которой

обладают

большой величиной электрического

дипольного момента. Электрический дипольный момент воды взаи-

модействует

с электрической составляющей СВЧ-волны. Это при-

водит к сильному нерезонансному поглощению СВЧ-излучения и

снижению чувствительности спектрометра. Чтобы избежать этого

явления,

в резонатор помещают образец так. чтобы последний на-

ходился точно в области максимума магнитной составляющей, по-

скольку напряженность электрической составляющей СВЧ-волны

этом месте равна нулю. По этой причине при работе с водными об-

разцами предпочтительнее использовать прямоугольные резонато-

ры и плоские тонкие кюветы (внутренний зазор кюветы приблизи-

тельно 0,2 мм).

Помимо

резонатора в волноводный тракт спектрометра включа-

ют и

другие

элементы, служащие для настройки СВЧ-тракта, под-

бора оптимальных условий для регистрации сигнала.

Аттенюатор

— устройство, позволяющее изменять мощность

СВЧ-излучения, падающего на образец.

Вентили

-— элементы, про-

пускающие СВЧ-излучение только в одном направлении. Сущест-

вуют

элементы, позволяющие изменять фазу колебаний СВЧ-излу-

чения,

—

фазовращатели.

Согласователи, являющиеся аналогом

переменной емкости и индуктивности,

служат

для подбора опти-

мальной связи резонатора с СВЧ-трактом.

Существует

и ряд дру-

гих элементов, принципы устройства и работы которых изложены

специальной литературе.

Регистрацию резонансного поглощения радиочастотного излу-

чения

в образце производят с помощью кристаллического детектора,

помещенного в специальной детекторной секции, которая также яв-

ляется одним из элементов волноводного тракта. В качестве детек-

торов используют специальные полупроводниковые диоды. Сигнал с

детектора поступает в систему усиления и обработки сигнала. Обыч-

но

сигнал ЭПР можно наблюдать на осциллографе или регистриро-

233

вать на ленте самописца. В современных спектрометрах широко при-

меняют компьютеры, позволяющие хранить информацию в памяти

ЭВМ и обрабатывать сигналы ЭПР по определенным программам.

Использование компьютеров существенно расширяет возможности

ЭПР-спектрометров. Например, с помощью компьютера можно по-

высить чувствительность спектрометра, применяя так называемое

накопление

сигналов.

Использование компьютеров значительно

улучшает

временное разрешение при регистрации кинетики сигна-

лов ЭПР; кроме того, компьютеры по заданным программам управ-

ляют работой спектрометра.

Для получения сигнала ЭПР, нужно в некоторых пределах про-

извести изменение величины магнитного поля Я, т. е. осуществить

развертку поля. Обычно развертка поля осуществляется в течение

десятков секунд или нескольких минут. Это означает, что ток, про-

текающий через кристаллический детектор,

будет

изменяться из-за

резонансного поглощения СВЧ-излучения в образце в течение этого

же времени, т. е. регистрация сигнала ЭПР

будет

идти на низкой

частоте. Однако на низкой частоте СВЧ-детекторы

обладают

боль-

шим

собственным шумом и, следовательно, выгоднее проводить ре-

гистрацию сигнала на более высоких

частотах.

Для этой цели слу-

жит высокочастотная модуляция магнитного поля (рис. 98).

Пусть магнитное поле Н медленно меняется в пределах от Н

т1а

Д° #тах

величина поля Н в данный момент

соответствует

некото-

рому значению Н

. Наложим на медленно изменяющееся поле Н

дополнительное

модулирующее

поле Я

мод

. Тогда по отношению к

точке Н

ток на детекторе

будет

изменяться от значения i

до i

(в

отсутствие

модулирующего

поля значение тока соответствовало

бы некоторой величине /„). Следовательно, на

вход

усилителя с де-

тектора

будет

поступать переменный сигнал с частотой, равной час-

к*

«»

г\

Сигнал,

поступающий

//о

усилитель

\ V V

т9

Рис.

98.

Принцип

высокочастотной модуляции магнитного поля

(объяснение

см. в тексте)

234

готе

модулирующего

поля, и ам-

плитудой, определяемой значения-

ми

тока i

и i

Амплитуда

переменного сигнала

определяется крутизной сигнала

ЭПР

в точке //„, т. е. пропорцио-

нальна

производной сигнала ЭПР

при

данном значении постоянного

магнитного поля Н

. Подобные

рассуждения приложимы к любому

значению

магнитного поля Н, ле-

жащего в пределах

min

тах

ЭТО

означает, что при изменении

величины

поля Н

получают

на вы-

ходе

не интегральный сигнал ЭПР,

а его первую производную (рис. 99).

Как

видно из рис. 99, значение

производной

равно нулю в точке

максимума резонансного сигнала

АН.

iP/dH

Рис.

99. Линия поглощения (А) и

ее первая производная (Б)

достигает экстремальных

значении

в точках максимального наклона интегральной кри-

вой.

Применение

высокочастотной модуляции магнитного поля

дает

возможность регистрировать сигнал ЭПР на более высоких часто-

тах, соответствующих частоте модуляции. Это позволяет применять

для усиления сигналов узкополосные резонансные усилители и

уменьшать тем самым полосу шумов.

Технически высокочастотную модуляцию поля осуществляют с

помощью специальных генераторов. Наиболее распространены в

настоящее время спектрометры, где применяется высокочастот-

ная

модуляция поля с частотой 100 кГц. Использование высокочас-

тотной модуляции поля позволяет включить в

схему

регистрации сиг-

нала ЭПР так называемый фазочувствительный, или синхронный,

детектор.

Таким

образом, в спектрометрах ЭПР сигнал регистрируется в

виде первой производной.

Спектрометры ЭПР различают по типу построения их волновод-

ных трактов. В спектрометрах с проходным резонатором волновод-

ный

тракт построен таким образом, что СВЧ-излучение проходит от

клистрона

чрез резонатор и

на детектор. В момент резонанса

образец поглощает СВЧ-излучение, что и регистриуется как умень-

шение

мощности СВЧ, приходящего на детектор.

В спектрометрах с отражательным резонатором волноводный

тракт построен по типу мостовой схемы и сигнал ЭПР регистрирует-

ся

как сигнал рассогласования моста в момент резонанса. В этот

момент часть мощности отражается от резонатора и поступает на

детектор. В настоящее время отражательные спектрометры применя-

ют чаще, поскольку отражательный волноводный тракт позво-

235

ляет эффективно уменьшать шумы клистрона и подбирать наиболее

оптимальный режим работы детектора СВЧ.

Характеристика

спектров

ЭПР. Основными параметрами, харак-

теризующими спектры ЭПР,

служат

интенсивность линии поглоще-

ния,

ширина и форма линии, величина g-фактора, наличие сверхтон-

кой

структуры

(СТС) спектра ЭПР.

Интенсивность

линии поглощения прямо связана с концентра-

цией

парамагнитных частиц в образце: площадь под кривой погло-

щения

S пропорциональна концентрации неспаренных электронов

N: S = kN. Обычно для определения концентрации используют

сравнение сигналов ЭПР исследуемого образца и эталона с извест-

ным

количеством парамагнитных частиц. Сопоставляя площади под

интегральными кривыми исследуемого S

и эталонного S

образ-

цов,

определяют количество парамагнитных частиц в исследуемом

образце:

(SjS

Так

как в реальных спектрометрах сигнал регистрируется в ви-

де первой производной, то для нахождения 5 проводят двойное ин-

тегрирование сигнала.

Ширина

форма

линии.

Ширина сигнала ЭПР определяется

взаимодействием магнитных моментов электронов с окружением

(спин-решеточное

взаимодействие).

Воздействие высокочастотного

электромагнитного поля индуцирует переходы в системе спинов.

Пусть в состоянии с более низкой энергией находится N

элект-

ронов,

а в состоянии с более высокой — N

. При поглощении

электромагнитного излучения заселенности верхнего и нижнего

уровней

будут

изменяться. Изменения заселенности этих состояний

со времением можно описать уравнениями

где W

и W

— вероятности переходов снизу

вверх

сверху

вниз

соответственно.

Аналогично можно записать, что dN

/dt = N

— N

Вероятности переходов W

и W

равны: W

= W

" = W. Если

ввести переменную п = N

— N

— разность заселенности

двух

уровней,

тогда

dn/dt

(dNJdQ—idNydt)

= — W (2N

— 2N

) = ~2Wn.

Решение

этого уравнения имеет вид п —

е~

, где п

—

разность заселенностей при t = 0. Из этого выражения видно,

что со временем (при t

-*•

сю ) разность заселенностей стремится

нулю. Это означает, что сигнал ЭПР в конце концов перестанет

наблюдаться, что, однако, противоречит опыту. Следовательно,

нужно предположить, что

существует

механизм, постоянно поддер-

живающий разность заселенностей. Таким механизмом и является

процесс

обмена

энергией

между

системой

спинов

решеткой—сре-

дой, в которой находятся парамагнитные частицы.

236

результате

такого спин-решеточного взаимодействия энергия

системы спинов переходит в энергию тепловых колебаний решетки

или

в энергию связей парамагнитной частицы, система спинов теря-

ет энергию, т. е.

«остывает»,

в то время как окружающая решетка

«нагревается».

Таким образом, спин-решеточное взаимодействие

приводит к уравниванию температур системы спинов и решетки.

Если обозначить вероятности индуцируемых решеткой перехо-

дов в системе спинов Р

и Р

, то в

случае

спин-решеточного взаи-

модействия эти вероятности не

будут

равны: Р

>Р

. Только

при

соблюдении этого условия

будет

сохраняться разность заселен-

ностей.

Для изменения заселенности каждого уровня только за

счет

спин-решеточного взаимодействия и при отсутствии высокочастот-

ного поля можно записать, что

/df

— N^P

\ dNJdt = N^, — N

;

dn/dt

= —2(N

—

(VI

1.1.1)

Общее количество неспаренных электронов N = N

••}-

Поскольку п = Nj — N

, можно записать: N

= (1/2) (N -f n)

= (1/2) (N — n). При подстановке в уравнение

(VI1.1.1)

получается

dn/dt

= N (Р

- Р

) - п (Р„ + Р

В стационарном состоянии

dn/dt

= 0,

отсюда

учетом

этого

dn/dt

= (п

—п) (Р

+ Р

) или

где

=ЩР

)

Величина T

обозначенная таким образом, характеризует ско-

рость установления равновесного значения п и называется

време-

нем

спин-решеточной

релаксации.

Если система облучается высокочастотным излучением, то с

учетом

переходов, индуцированных излучением, полная скорость

изменения

разностей населенностей

будет

dn/d/=

—2Wn + (n

—n)/T

В стационарном состоянии п = hj\ +

21F7Y

Из этого выраже-

ния

видно, что при 2 WTj < 1 п — п

. Известно, что W пропор-

циональна квадрату амплитуды высокочастотного поля. Из этого

следует,

что при малой мощности излучения равновесная населен-

ность уровней практически не нарушается. 7\ как величина, об-

ратная

сумме

вероятностей, характеризует среднее время жизни

данного спинового состояния. Тем самым величина 7\ определяет

естественную ширину линии ЭПР.

237

Как

следует

из соотношения неопределенностей Гейзенберга

для энергии и времени.

Если в качестве Д/ принять Т

, то б£ ^

h/(2nT

б£ харак-

теризует

«размазанность» значений энергии уровней £, и £

(см.

рис. 95). При уменьшении Т

значение 6£ увеличивается

уровни энергии размазываются. В этом

случае

наблюдаются и бо-

лее широкие линии ЭПР. Поскольку энергия взаимодействия маг-

нитного момента неспаренного электрона с внешним полем равна

£ = ± (1/2) gP H, то неопределенность в разности энергии б£ =

#РД#.

Выразив б£ таким образом, получим, что Д Н > Л/

/ (2лТ,£$). Легко заметить, что при уменьшении Т

Д# возрастает.

Как

показано на рис. 96, сигнал поглощения регистрируют, из-

меняя

в некоторых пределах напряженность магнитного поля вбли-

зи

точки #

= Я

рез

. В этом

случае

сигнал ЭПР представляется

некоторой функцией от напряженности внешнего поля / (Н); эта

функция

называется

функцией

формы

линии.

В разбавленных растворах парамагнитных частиц, когда можно

пренебречь взаимодействием

между

отдельными частицами, сигналы

ЭПР

для

всех

частиц наблюдаются при одних и тех же значениях

внешнего магнитного поля. В этом

случае

кривая поглощения опи-

сывается функцией Лоренца:

— /

1 I -f-4 ~ I для интегральной кривой

,, ,, 16(Я — Я

) Г, 4 (Н —

]

или

1л

^—/о—-

— 1 4 - . для

первой

произ-

9AWmax L 3

ДЯ^ах

ВОДНОЙ,

где /

и /о — амплитуды интегральной кривой и сигнала, зареги-

стрированного в виде первой производной; ДЯ)/

— ширина на

половине высоты для интегрального сигнала; ДЯ

тах

— ширина

между

точками максимального наклона для первой производной

(см.

рис. 99).

Чаще,

однако, сигналы ЭПР описываются гауссовой формой ли-

нии.

В этом

случае

сигнал ЭПР представляет собой огибающую сдви-

нутых

друг

относительно

друга

сигналов от отдельных групп пара-

магнитных частиц (спин-пакетов).

Гауссова

форма линии описывает-

ся

следующим образом:

0,36ДН?

/г = /(, е ' для интегрального сигнала;

- 2

(Н-Н,)

1т— —/о V е —~~ ° е

тах

для первой производной.

238

Учет

формы линии важен при

расчетах

концентрации парамаг-

нитных частиц. Лоренцевская линия по сравнению с гауссовой име-

ет более длинные крылья, что необходимо учитывать при вычисле-

нии

площади под кривой поглощения.

Спин-решеточное взаимодействие является одним из факторов,

определяющих ширину линии. Естественная ширина линии обрат-

но

пропорциональна времени Tj, и при малых Т, именно спин-ре-

шеточная релаксация определяет ширину линии, что характерно,

например,

для сигналов ЭПР парамагнитных ионов. Так, Т

1У

рав-

ному 10~

с,

соответствует

ширина линии порядка 6 мТл. При бо-

лее коротких временах Т

сигналы ЭПР парамагнитных ионов иног-

да уширяются настолько, что становятся не наблюдаемыми при ком-

натной

температуре. Для свободных радикалов характерны боль-

шие времена спин-решеточной релаксации порядка 10~

— Ю-

с,

поэтому следовало ожидать, что соответствующий сигнал ЭПР дол-

жен быть достаточно узким (~ 10~*мТл). Однако в экспериментах

наблюдаются более широкие сигналы.

В этом

случае

вводят еще одно время релаксации Т

—

время

спин-спиновой

релаксации.

Время Т

, так же как Tj, определяет

ширину сигнала ЭПР и связано с временем 7, следующим образом:

'^набл =

(2Т,) + 1/Т

, где Т

наСл

— суммарное время релак-

сации.

Ширина

линии связана с Т

набл

: АН =

\h/(2ng$)}

(1/Г

набл

Спин-спиновая

релаксация — процесс обмена энергией внутри

системы спинов. Обмен энергией

между

отдельными неспаренными

электронами не изменяет энергии системы спинов в целом. Однако

спин-спиновые

взаимодействия приводят к изменению времени

жизни

данного спинового состояния. Время 7\

, таким образом,

также

будет

определять ширину линии.

Для свободных радикалов в растворах Tj > Г

, поэтому ши-

рина

линии определяется именно временем Т

. Время Т

зависит от

целого ряда процессов, которые приводят к уширению сигналов

ЭПР.

Ряд механизмов уширения линий рассматривается ниже.

Диполь-дипольнос

взаимодействие.

Диполь-дипольное взаимодей-

ствие — основной механизм уширения линий в

твердых

телах.

Суть

этого эффекта заключается в том, что каждый неспаренный элект-

рон

является источником локального магнитного поля, напряжен-

ность которого на расстоянии R равна

лок

= ± ц//?

, где \i —

магнитный момент электрона. Соседние парамагнитные частицы ис-

пытывают влияние этого поля. В

результате

происходит изменение

напряженности эффективного магнитного поля для разных частиц

уширение сигналов ЭПР на величину Av

= g P H

n0K

lh.

Локальное магнитное поле зависит и от ориентации пары взаимо-

действующих парамагнитных частиц относительно внешнего маг-

нитного поля: Я

лок

= (inlR

) (3 cos

9—1) (рис. 100). При изме-

нении

R и в для различных пар частиц наблюдаемый сигнал явля-

ется огибающей более узких индивидуальных линий.

239

Диполь-дипольное уширение линий зависит от концентрации па-

рамагнитных частиц в образце: А#

диП

= Кс, где К — константа,

с — концентрация частиц.

В растворах низкой вязкости диполь-дипольное взаимодействие

усредняется до нуля за

счет

быстрой переориентации парамагнит-

ных частиц.

Анизотропия

g-фактора.

Еще одним источником уширения

линий

является анизотропия

g-фактора.

Значение g-фактора, как

отмечалось вначале, очень часто близко к спиновому значению, рав-

ному для свободного электрона

2,0023.

Это происходит потому, что

орбитальный магнитный момент практически не вносит вклада в об-

щий

магнитный момент электрона. Однако, в особенности для ионов

металлов, наблюдаются отклонения величины g-фактора от чисто

спинового значения. Это

свидетельствует

о том, что орбитальное

движение электрона создает добавочный орбитальный магнитный

момент, складывающийся со спиновым магнитным моментом. Орби-

тальное движение электрона создает переменное магнитное поле, с

которым взаимодействует спиновый магнитный момент. Такое взаимо-

действие называется

спин-орбитальным

взаимодействием

и характе-

ризуется константой

спин-орбитального

взаимодействия

К, кото-

рая возрастает с увеличением атомного номера элемента. Зависи-

мость g-фактора от константы спин-орбитальной связи имеет вид

g =

2.0023

[2 — /

(>./Д)1,

где А — величина расщепления

между

основным и более высоким орбитальным состояниями атома.

Таким

образом, добавочный орбитальный магнитный момент при-

водит к отклонению g-фактора от значения

2,0023,

что определяет-

ся

не только факторами X и А, но и зависит от влияния электричес-

кого поля, создаваемого соседними атомами.

Кристаллическое или молекулярное электрическое поле, влияя

на

орбитальное движение электрона, определенным образом ориен-

тируют

магнитный момент электро-

на

относительно внутреннего поля

частицы. Конкуренция

между

внешним

магнитным полем и

внут-

ренним

кристаллическим полем

приводит к анизотропии g-фактора.

В свою очередь, анизотропия

g-фактора приводит и к уширению

суммарного сигнала ЭПР, наблю-

дающегося для ансамбля парамаг-

нитных частиц. Значения g-факто-

ра по трем осям системы коорди-

нат, связанной с частицей, обозна-

Рис.

100.

Схема

диполь-дипольно-

чают

как g

liy

. Эти

значе-

го

взаимодействия

двух

магнит-

ния

можно

определить

для

моно-

ных

моментов:

кристаллов,

определенным

образом

1X1

" "'

,н-нны'ч

ит

,"ектр"нов

нты

нес

ориентируя

их во

внешнем

магнит-

но