Волькенштейн М.В. Общая биофизика

Подождите немного. Документ загружается.

7.0.

МОЛЕКУЛЯРНЫЙ МЕХАНИЗМ ФОТОРЕЦЕПЦИН

381

общности их эволюционного происхождения. Имеются бактерии,

лишенные,

конечно, зрения, но содержащие бактериородопсин,

весьма сходный со зрительным пигментом.

Таблица

7.5

Зрительные

пигменты

Максимум

поглоще-

ния

Л, А

{

Свет

+Опсин

^=^ Родопсин

5000

палочек

Свет

So4eK

(

Свет

-fOncmi *—> Порфиропсин

5220

палочек

Свет

Исходя из общих принципов, можно снова заключить, что

вслед

за поглощением света в фоторецепторе должна возникать

некая

фотохимическая реакция. В родопсине ретиналь

образует

шиффово

основание в

результате

взаимодействия альдегидной

группы ретиналя с амино-группой опсина [110, 111], а именно

с e-NH

-rpynnofi лизила [109, 112]:

H_,

CH=O

+ H

N—опсин —>

CH=N—

опсин + Н

О.

Бычий

родопсин имеет молекулярный вес около 40 000. Если счи-

тать

молекулу

сферической, то ее диаметр составляет 40 А.

Под действием света ретиналь отщепляется от родопсина,

аналогичные процессы протекают и в

трех

других

случаях

(см.

табл. 7.5). Однако этим фотохимическое превращение не исчер-

пывается. Одновременно происходит фотоизомеризация рети-

наля.

Комплекс опсина с ретиналем возникает за

счет

CH = N-

связи и ряда

слабых

взаимодействий хромофора с белком. Эти

взаимодействия оптимизируются в

результате

структурного

со-

ответствия ретиналя и опсина. Ретиналь может существовать в

виде ряда изомеров, так как двойная связь С = С

образует

транс- или цг/с-конфигурацию. Наиболее устойчива сплошная

гранс-конфигурация, которая и показана для ретинола! на

стр. 380. Установлено, что в комплексе с опсином в темноте

382

ГЛ. 7. ФОТОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ

ретиналь фигурирует в форме

11-цис

[113]:

Н,

СН,

Н I

СН

НС

В П-^ис-форме СНз-группа у Ci

и водород у Сю очень сбли-

жены,

между

ними возникает сильное отталкивание. Благо-

даря этому молекула несколько скручена, в ней нарушено пло-

ское расположение л-связей. Тем самым уменьшена энергия со-

пряжения,

и 11-цис-форма должна быть менее стабильной, чем

полная

транс-форма. Однако в комплексе с опсином проигрыш

энергии сопряжения перекрывается выигрышем в энергии взаи-

модействия с белком, наибольшей для

\-цис-формы.

При

выцветании пигмента на

свету

ретиналь отщепляется

от опсина и изомеризуется в наиболее

устойчивую

сплошную

Родопсин

Изомерам

71-цис-ретиналб

олеин

Сплаштйтрат-ретитлА+ола/н

Алкоголйдегифогеша,

11-цис-ретинол

' > ? « *

Сплошной

тра//с-ретш/м

Рис.

7.28.

Цикл

изомеризации родопсина.

гранс-форму. Цикл цис—гране-изомеризации является обязатель-

ной

частью

любой известной фоторецепторной системы [109].

Этот цикл показан на рис. 7.28 [109].

В растворе ретиналь

образует

под действием света смесь изо-

меров, состав которой зависит от длины волны света и полярно-

сти растворителя [П4, И5]. Полярный растворитель — этанол —

стабилизует 11-ч«оконфигурацию. Ее содержание в таком рас-

творе ретиналя составляет

25—30%

[116].

Установлено, что единственное действие света на ретиналь

состоит именно в изомеризации

\-цис -> сплошной транс. От-

щепление ретиналя от опсина должно рассматриваться как след-

ствие этого процесса [117].

7.9. МОЛЕКУЛЯРНЫЙ МЕХАНИЗМ

ФОТОРЕЦЕПЦИИ

383

В этой книге и в «Молекулярной биофизике» [12] постоянно

подчеркивается определяющее значение конформационных пре-

вращений

молекулы в биологических явлениях.

В фоторецепции мы встречаемся не с ротамеризацией, не

с конформационной перестройкой ретиналя, а с

цис—транс-нзо-

меризацией

— повороты происходят вокруг двойных, а не еди-

ничных связей. Различие

между

ротамеризацией и

цис—трпнс-

изомеризацией

имеет количественный характер. В первом

случае

для конформационного превращения нужно преодолеть барьер

порядка

нескольких ккал/моль (в этане 3 ккал/моль), во вто-

ром,

при переходе 11-цис-ретиналя в полностью

транс-форму

—

около

25 ккал/моль, причем значение частотного предэкспонен-

циального множителя составляет от 10

до 10" с~' в зависимо-

сти от растворителя [118]. Соответственно изомеры ретиналя

устойчивы в растворе. Разности их энергий не велики — порядка

1—3 ккал/моль.

При

возбуждении молекулы поглощенным светом происходит

перестройка я-электронной оболочки, и барьер внутреннего вра-

щения

снижается до величины, соизмеримой с k^T. Время жизни

молекулы в синглетном возбужденном состоянии 10~

с, время,

нужное для поворота,

10~"—10~

с. Квантовый

выход

для реак-

ции

изомеризации

\-цис-+

полностью транс составляет

0,5—0,7

[119]. Энергия кванта света более чем достаточна для изомери-

зации

— кванту с X

5000

А отвечает энергия 58 ккал/моль.

Значительный

интерес представляет детальный механизм

изомеризации.

Нужно установить, через какое возбужденное со-

стояние—

синглетное или триплетное — проходит изомеризация

под действием света. В теоретических работах показано, что

энергетический барьер для переходов в триллетном состоянии

существенно ниже, чем в синглетном [120—122]. Окончательный

ответ на вопрос о роли возбужденных триплетных состояний при

изомеризации

хромофора в родопсине был получен в работах

Розенфельда и сотрудников [123]. В этих работах был применен

метод лазерного фотолиза и использована система веществ-до-

норов,

позволявшая в

результате

светового возбуждения созда-

вать высокую концентрацию триплетных состояний шиффова ос-

нования

ретиналя. Действительно, оказалось, что эффективность

изомеризации

в триплетном состоянии очень высока. Однако

время жизни триплетных состояний шиффова основания рети-

наля

практически такое же, как для триплетных состояний ре-

тиналя.

Это означает, что отсутствие триплетного поглощения,

установленное для шиффовых оснований ретиналя [124], объяс-

няется

не малым временем жизни триплетов, а малой эффектив-

ностью интеркомбинационной конверсии. При непосредственном

фотолизе этих соединений триплеты не обнаруживаются [123].

384

ГЛ.

ФОТОБИОЛОГПЧЕСКПЕ ПРОЦЕССЫ

По-видимому, триплетное состояние

не

играет роли

при

изоме-

ризации

хромофора

зрительном пигменте.

Действуя светом разных длин волн

на

раствор родопсина

эквимолярной

смеси глицерина

водой

при

температуре

—190 °С,

можно обратимо смещать равновесие изомеров,

что

находит свое

выражение

сдвигах полосы поглощения [109].

На

основе такого

рода исследовании

Уолд

построил

схему

последовательных

пре-

вращений

родопсина, показанную

на рис. 7.29. Под

действием

Прел/ома

у (5430)

\>-/40°

РоЗопеин

л™

>-45

Выцветание

Зрительное

Рис.

7.29. Стадии выцветания родопсина.

Ретиналь

заштрихован.

скобках указаны величины

пач

в А;

температуры измеряются

градусах

Цельсия.

света ретиналь, находящийся

комплексе

опсином, изомери-

зуется, образуется прелюмиродопсин.

При

этом нарушается

структурное соответствие ретиналя

опсина,

последний вместе

со связанным ретиналем испытывает конформационное превра-

щение.

Глобула

опсина постепенно раскрывается, возникают

ста-

дии,

обозначаемые

как

люмиродопсин

метародопсины.

На за-

ключительной стадии шиффово основание гидролизуется,

и ре-

тиналь отщепляется

от

опсина.

При

раскрытии опсина

экспони-

руются новые химические группы,

частности,

две

SH-группы

группа, связывающая протон,

с рК

около

6,6

(вероятно, имида-

зольная).

Эти

факты установлены

помощью биохимических

физико-химических методов [125—127].

Поглощая

второй квант света, ретиналь может вновь перейти

11-^ис-форму. Пигмент

не

только выцветает

на

свету,

но

может

регенерироваться. Соответствующая схема представлена

на

рис.

7.30

[109].

Таким

образом, фоторецепция сводится

изомеризации

хро-

мофора,

за

которой

следует

изменение структуры липопро-

теида

—

опсина. Конформационное превращение опсина приво-

дит

конечном счете

возникновению нервного импульса.

7.9.

МОЛЕКУЛЯРНЫЙ МЕХАНИЗМ

ФОТОРЕЦЕПЦИИ

385

В сетчатке головоногих моллюсков наряду

родопсином

со-

держится второй фоторецепторный комплекс

—

ретинохром.

В от-

личие

от

родопсина, ретиналь

ретинохроме находится

сплош-

ной

гране-форме, изомеризующейся

11-^«с-форму

при

воздей-

ствии оранжевым светом. Белковая часть ретинохрома может

давать

комплексы

и с

другими изомерами ретиналя.

При

освеще-

нии

все они

дают

l-цис-форму,

отщепляющуюся

от

белка.

В этом смысле поведение ретинохрома противоположно поведе-

нию

родопсина. Можно

думать,

что

ретинохром катализирует

^-*-

Родопсин

Пре

Прелюмиродопсин

(5430

А)

>-14О°С

^Лт

ЛюмироЗопсин

(4970)

>-4ОГ

Метародопсш

1(4780)

\\н+>-/гс

МетароЗолсин

II(3800)

\ >0Х

==:

ч£ЛарароЗолсин

(4050)

Сплошной

транс-ретиналь

<*^3370)

~~ ~—~-—

Опсин

Рис.

7.30. Промежуточные стадии при выцветании и регенерации родопсина

Волнистые линии—действие света, прямые—темновое превращение.

изомеризацию ретиналя

и, тем

самым, способствует реконструк-

ции

выцветшего родопсина [128].

В работе

[129]

было показано,

что

выцветание

регенерация

родопсина

vitro

зависят

от

частоты коротких вспышек лазер-

ного освещения. Поглощается лишь свет, поляризация которого

отвечает

определенной ориентации молекул родопсина.

Тем са-

мым существенно соотношение

между

частотой вспышек

и вре-

менем поворота молекул родопсина

растворе.

Ценная

информация

об

электронных

переходах

ретинале

получена

исследованиях флуоресценции

(см.,

например, [130]).

Изучение флуоресценции родопсина, внешних сегментов пало-

чек

как

целостных систем

модельного соединения

—

N-рети-

нил

—

опсина позволило выявить особенности переноса энергии

между

соседними молекулами пигмента [131].

этими явле-

ниями

связан

ряд

интересных

важных проблем биомолекуляр-

ной

оптики.

Различные

формы зрительных пигментов характеризуются

различными спектрами поглощения.

Эти

различия

не

сводятся

указанным

табл.

7.5.

Полоса поглощения хромофора суще-

ственно зависит

от его

взаимодействия

опсином

и,

следова-

386 ГЛ. 7. ФОТОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ

тельно, от состояния липопротеина и его видовых особенностей.

Так,

сетчатка лягушки содержит два типа палочек («красные» и

«зеленые»)

и два типа колбочек. Красные палочки содержат

«классический» родопсин, зеленые — родопсин с полосой погло-

щения,

сдвинутой в коротковолновую сторону. Спектральная чув-

ствительность зрительных пигментов, как правило, коррелирует

со спектральным составом света в среде, в которой

существует

данный

организм. При переходе от голубоватой морской воды к

желтоватой пресной воде родопсин в палочках рыб постепенно

замещается порфиропсином. Сетчатка морских рыб имеет мак-

симум чувствительности вблизи

5050

А, пресноводных — вблизи

5400

А (см. [132]).

Пигментная

система фоторецепторов сходна с пигментной си-

стемой фотосинтеза в том отношении, что в обоих случаях у ог-

раниченного

числа пигментов встречаются самые разные спект-

ральные чувствительности, что объясняется разнообразием их

взаимодействий с белками.

В данной главе рассматриваются лишь взаимодействие каро-

тиноидов со светом, их роль в фотосинтезе и фоторецепции. Од-

нако

этим не исчерпывается участие каротиноидов в биологиче-

ских процессах. Способность каротиноидов к ^ыс-г^анс-изомери-

зации

существенна для метаболизма. Наличие большого числа

ненасыщенных

двойных связей определяет легкую окисляемость

этих соединений и, следовательно, участие в окислительно-вос-

становительных реакциях. Соответственно каротиноиды функ-

ционируют в темновой биологии. Они фигурируют в ряде тканей

животных, в частности, в нейронах моллюсков, в тканях вос-

производящих органов как беспозвоночных, так и позвоночных

(в

том числе и у человека). Каротиноиды функциональны в

окислительном метаболизме [133, 134]. Если биохимическая эво-

люция

приводит к синтезу той или иной группы органических

соединений,

то они используются в живой природе многообраз-

но—

везде, где это оптимизирует существование организма.

Факты

и гипотезы, кратко изложенные в настоящем параг-

рафе,

ставят ряд физических задач, еще далеких от своего реше-

ния.

Структура опсина, а значит, и родопсина изучена недоста-

точно.

Поэтому пока невозможно построение детализированной

модели родопсина и его превращений на

свету.

Значительный

интерес представила бы квантовая химия этих явлений, еще не

построенная.

Наибольший

интерес представляет установление связи ме-

жду событиями, происходящими в родопсине, и возникновением

электрических потенциалов в последовательных нейронах сет-

чатки,

завершающееся посылкой нервного импульса в мозг. Об

этом почти ничего не известно. Далее необходимо изучить строе-

ние

и свойства мембран фоторецепторных клеток. Очевидно, что

7.10.

МЕМБРАНЫ

ФОТОРЕЦЕПТОРОВ

387

без такого рассмотрения нельзя

даже

подойти к решению ука-

занных вопросов. Дальнейшие подробности, относящиеся к фо-

торецепции

на молекулярном уровне, см. в [109, 135].

Для понимания молекулярного механизма фоторецепции су-

щественны исследования кинетики темновых реакций зритель-

ного пигмента, протекающих вслед за световым воздействием.

Согласно Абрахамсону [136], целесообразно разделять эти реак-

ции

на ранние и поздние стадии. К первым относятся переходы

прелюмиродопсин -> люмиродопсин -> метародопсин / —* метаро-

допсин

//. Они происходят быстро, как установлено с помощью

импульсного фотолиза (см.

[137—139]).

Предполагается, что по-

следний переход, сопровождаемый конформационными измене-

ниями,

и приводит к изменению проницаемости фоторецептор-

ной

мембраны и к генерации импульса. Это удалось подтвердить

экспериментально

[140]. Процессы второй стадии, следующие за

указанными,

по-видимому, не имеют отношения к формированию

первичного электрического ответа фоторецептора и, возможно,

играют роль в регенерации родопсина [141]. Они происходят

очень медленно (секунды и

даже

минуты) и характеризуются

простой кинетикой. Напротив, кинетика перехода метародо-

псин

I—* метародопсин //, изученная методом импульсного

фотолиза, сложна, она аппроксимируется суммой не менее, чем

трех

экспонент [142]. То же относится к реакциям прелюмиродо-

псин-*

люмиродопсин [143] и люмиродопсин-> метародопсин /

[142]. Были опубликованы и

другие

данные. В наиболее подроб-

ном

исследовании перехода прелюмиродопсин -> люмиродопсин,

проведенном методом импульсного фотолиза в

средах

с различ-

ной

вязкостью, установлено, что кинетика перехода аппроксими-

руется суммой

трех

экспонент, т. е. процесс является суммой

параллельных реакций первого порядка. Константы скоростей

перехода не зависят от вязкости [143, 144]. Есть основания ду-

мать, что сложная кинетика является универсальным свойством

ранних

темновых реакций как in

vitro,

так и in

vivo

[145]. При-

чины

сложной кинетики и ее биологическая значимость остаются

пока

неясными.

§ 7.10. МЕМБРАНЫ ФОТОРЕЦЕПТОРОВ

Как

уже сказано, фоторецепторные клетки содержат стопки

ламелл или дисков — мембран, в которых и локализованы зри-

тельные пигменты. Число таких дисков в одной клетке велико,

оно

достигает

500—1000.

Мембраны содержат обычный били-

пидный

слой, что доказывается методами рентгеноструктурного

анализа, электронной микроскопии и др. [146]. Установлено, что

388 ГЛ. 7. ФОТОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ

молекулы родопсина лежат на внутренней гидрофильной по-

верхности мембраны [147].

Фоторецепторные мембраны внешних сегментов палочек

быка и лягушки содержат около 60% белка и 40% липидов. Ро-

допсин

является главной фракцией белка, составляя до 80% от

его общего содержания. Липиды представлены главным образом

фосфолипидами

— фосфотидилэтаноламином, фосфотидилхоли-

ном

и фосфотидилсерином, присутствует и 5—10% гликолипида.

Предложены различные модели устройства фоторецепторной

мембраны, на которых мы не

будем

останавливаться (см. [146,

148—150]).

Эти модели не всегда согласуются

друг

с другом.

Диски

внешних сегментов палочек представляют собой сво-

бодно плавающие внутриклеточные органеллы, подобные мито-

хондриям. Мембрана диска охватывает определенное простран-

ство, отделяемое полупроницаемой мембраной от внутриклеточ-

ного пространства фоторецептора, в котором «взвешены» диски.

Мембрана непроницаема для Na

, К

, Са

, Mg

, Cl~ и РО4".

vitro

в ответ на изменения осмотического давления окру-

жающей среды изолированные диски

набухают

и сжимаются

[151].

Наиболее интересна проблема влияния освещения на мем-

брану в целом. В

результате

освещения мембрана становится

более проницаемой — она не удерживает все растворенное ве-

щество столь же эффективно, как мембрана, адаптированная

темноте [151]. Конформационное изменение родопсина приво-

дит к изменению состояния мембраны, к увеличению пассивной

проницаемости

ионов Na и К

Методами рентгенографии и электронной микроскопии

уста-

новлено,

что в мембране диска при освещении происходят опре-

деленные структурные изменения, масштаб которых пропорцио-

нален

времени экспозиции. Суть этих изменений состоит в транс-

локации

родопсина. В

результате

освещения родопсин перехо-

дит с междисковой гидрофильной поверхности во внутреннюю

гидрофобную фазу мембраны [152]. Такого рода транслокации

имеют характер фазовых переходов. Фазовые переходы в мем-

бранах фоторецепторных клеток лягушки и кальмара были

обнаружены и изучены методом дифференциальной калоримет-

рии

[153].

Общий

обзор строения и свойств фоторецепторных мембран

дан Деменом [154].

помощью электронного парамагнитного резонанса было

проведено исследование фоторецепторной мембраны с введен-

ным

в нее спиновым зондом — бирадикалом

RO(CH

)

Si—О—Si(CH

)

OR,

7.10. МЕМБРАНЫ ФОТОРЕЦЕПТОРОВ 389

где R есть иминоксильный радикал

QN-6

При

освещении суспензии мембран наблюдаются значительные

изменения

спектров ЭПР, указывающие на увеличение времени

вращательной диффузии бирадикала в мембране т. Форма кри-

вой

зависимости т от длительности освещения свидетельствует

том, что фотолиз пигмента сопряжен с изменением конформа-

ционного

состояния мембраны, с увеличением микровязкости ее

гидрофобных областей. Эти результаты можно считать прямым

доказательством конформационных превращений мембраны при

освещении

[155].

сходным выводам приводит изучение фоторецепторных

мембран методом ^"резонансной спектроскопии (эффект Мёсс-

бауэра). В качестве метки применялся аскорбат железа, обога-

щенный

изотопом

источником

у-

изл

чения

служил

Со

[156].

Особый интерес представляет АТФ-азная ферментативная

активность, присущая фоторецепторной мембране. Еще в 30-х

годах

Энгельгардт высказал предположение об использовании

энергии

АТФ в первичном процессе зрения. Это предположение

было косвенно подтверждено Венкстерн в исследовании АТФ-

азной

активности сетчатки [157, 158]. В дальнейшем была

уста-

новлена локализация АТФ-азной активности в мембранах на-

ружного сегмента фоторецепторов. АТФ-аза является Mg-акти-

вируемой, она связана с родопсином [159]. Фотолиз зритель-

ного пигмента in

vitro

приводит к заметному ингибированию

АТФ-азы, что, надо

думать,

обусловлено внутримолекулярной

перестройкой пигмента, подвергающегося фотоденатурации на

последних стадиях фотолиза. Не исключено, что на более ран-

них стадиях ферментативная активность увеличивается, как

предполагал

Уолд

[160].

Можно

думать,

что АТФ-азная активность необходима при

фоторецепции

для усиления полученного фоторецепторной клет-

кой

сигнала за счет энергии АТФ. Человеческий глаз, как уже

сказано,

обладает высокой чувствительностью к

свету

— он спо-

собен регистрировать несколько фотонов. Палочка может быть

стимулирована одним фотоном с энергией порядка

4-10~

эрг

(при

5000

А). Согласно основному закону фотохимии Эйн-

штейна, один фотон может вызвать перестройку одной лишь

390 ГЛ. 7. ФОТОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ

молекулы родопсина из 10

молекул, содержащихся в палочке.

Светочувствительность палочки максимальна.

Однако энергия одного кванта недостаточна для физиологи-

ческой стимуляции рецепторной клетки. Расчеты показывают,

что для этого нужно усиление в несколько тысяч раз. Предполо-

жительно усиление имеет биохимический характер и происходит

результате

ферментативного гидролиза АТФ. Механизм этого

гипотетического процесса пока совершенно загадочен.

Именно

на фоторецепторных мембранах лучше всего изу-

чены жидкостные (жидко-кристаллические) свойства мембран

(ср.

§ 3.8). Это оказалось возможным потому, что в фоторецеп-

торных мембранах функционирует практически один лишь бе-

лок

— родопсин, — за которым легко следить.

Уже давно было установлено, что палочки, адаптированные

темноте, обладают дихроизмом. Свет, поляризованный перпен-

дикулярно к длинной оси палочки, поглощается в несколько раз

сильнее,

чем свет, поляризованный параллельно этой оси. Сле-

довательно, хромофор родопсина ориентирован параллельно

плоскости мембраны диска. Однако на этой плоскости хромо-

форы

ориентированы беспорядочно и соответствующего ди-

хроизма нет [161, 162]. Можно фотоиндуцировать дихроизм, про-

водя частичное выцветание родопсина с помощью плоскополя-

ризованного

света. В обычных условиях дихроизм не возникает,

что объясняется броуновским вращательным движением моле-

кул родопсина в сетчатке [163]. Однако при обработке сетчатки

глутаровым альдегидом наблюдается очень сильный фотоинду-

цированный

дихроизм [164]. Глутаровый альдегид образует

сшивки,

препятствующие вращению молекул родопсина.

Другие

возможные объяснения отсутствия фотодихроизма в нормаль-

ной

сетчатке исключены экспериментально. Перенос энергии

между

молекулами родопсина, среднее расстояние

между

кото-

рыми

составляет около 70 А [165], невозможен. Работа [164] до-

казывает вращательную подвижность родопсина в сетчатке.

О том же свидетельствует изучение фотодихроизма при импульс-

ном

фотолизе [166]. При импульсном освещении происходит

скачкообразное возрастание поглощения, определяемое превра-

щением

родопсина в прелюмиродопсин. Это возрастание значи-

тельно больше, если векторы поляризации действующего света

света, поглощение которого измеряется, параллельны, чем

том случае, когда оба вектора перпендикулярны

друг

другу.

Вспышка индуцирует дихроизм, который быстро исчезает. По-

ловинное

время исчезновения дихроизма при 20 °С составляет

3,0 ±1,5 мкс. С увеличением температуры этот процесс уско-

ряется.

Увеличение вязкости среды замедляет исчезновение фо-

тодихроизма.