Диссертация на соискание ученой степени доктора технических
наук.
Санкт-Петербург, Санкт-Петербургский национальный исследовательский университет информационных технологий механики и оптики, 2015. — 386 с.
Специальность: 05.18.07 Биотехнология пищевых продуктов и биологических активных веществ.
Научный консультант: доктор технических наук, профессор Колодязная B.C. Цель исследования - теоретически и экспериментально обосновать применение ассоциативных бактерий-антагонистов в интегрированной защите картофеля от фитопатогенов при производстве и холодильном хранении в экологически ориентированных системах агропромышленного комплекса на примере Северо-Запада РФ.
Научная новизна работы. Разработана методология направленного поиска и ступенчатого скрининга потенциальных биоконтрольных штаммов с полифункциональной биологической активностью для интродукции в биоценозы при вегетации и холодильном хранении картофеля. Из эпифитной микробиоты клубней картофеля, находящегося на длительном холодильном хранении, выделены эффективные биоконтрольные штаммы бактерий родов Pseudomonas и Mycobacterium, ассоциированные с биоценозом, сформированным из психрофильных аборигенных микроорганизмов, отселекционированных, специфичных для промышленных условий холодильного хранения растительной продукции. Определено таксономическое положение прокариотного сообщества эпифитной микрофлоры клубней при холодильном хранении картофеля при использовании метода молекулярно-генетической идентификации. Выявлено изменение доминантных микроорганизмов аборигенного бактериального сообщества при введении в микробиом бациллярного инокулята B.subtilis. Доказана комплементарность культур родов Bacillus и Pseudomonas к низким температурам в условиях холодильного хранения картофеля методом высокопроизводительного секвенирования. Методом флуоресцентной in situ гибридизации и конфокальной сканирующей лазерной микроскопии определена пространственная локализация интродуцированных биоконтрольных штаммов на поверхности клубней при низкотемпературном хранении картофеля. Протестирована и определена в опытах in vitro и in vivo эффективность бактерий родов Pseudomonas, Mycobacterium и Bacillus против основных возбудителей инфекционных заболеваний при холодильном хранении вегетативных органов растений семейства пасленовых. Выявлено влияние бактерий-антагонистов на фитогормональный статус клубней. Установлено продуцирование биоконтрольным штаммом B.subtilis413 экзометаболитов, обладающих фитогормональными свойствами. Показано влияние интродуцированных штаммов бактерий-антагонистов на интенсификацию защитных реакций клубней картофеля с образованием стрессовых метаболитов, активизацию фенольного метаболизма и окислительных ферментов, участвующих как в повреждении внедряющегося фитопатогена на ранних этапах взаимодействия, так и на более поздних стадиях - при синтезе полимеров, создающих барьер для инфекции. Установлено влияние исследуемых штаммов бактерий родов Pseudomonas и Bacillus, отобранных по биоконтрольному эффекту, на повышение урожая картофеля и эффективности минеральных удобрений при интродукции бактериальных штаммов в агрофитоценозы, общий уровень фитофизиологической активности растений картофеля, снижение распространенности болезней урожая клубней. Дана оценка эффективности действия бактерий как в монокультуре, так и при применении в микробной паре при дефиците минерального азота в почве. Доказано, что обработка клубней биоконтрольными штаммами в процессе адаптации к низким температурам длительного холодильного хранения картофеля способствует сохранению устойчивости клубней к неблагоприятным внешним факторам, ограничивая тем самым глубокие физиолого-биохимические перестройки в растительных тканях. Бактериальная инокуляция индуцирует устойчивость картофеля к фитопатогенам при длительном холодильном хранении.
Практическая значимость. Выделены и селекционированы эффективные, технологичные биоконтрольные штаммы бактерий родов Pseudomonas, Mycobacterium, Bacillus, обладающие мико- и бактериостатическим действием по отношению к фитопатогенам вегетативных органов растений семейства паслёновых, на примере картофеля, через механизмы конкуренции и антагонизма, стимулирования защитных реакций растительных клеток в условиях холодильного хранения. Определены условия эффективного биоконтроля и метаболитной активности, проявления защитного и фиторегуляторного эффектов бактерий-антагонистов родов Pseudomonas, Mycobacterium, Bacillus применительно к картофелю и его сортовой специфичности при производстве и в условиях низких температур холодильного хранения. Обоснованы технологические параметры обработки биопрепаратами семенных клубней, вегетирующих растений и картофеля перед закладкой на длительное хранение при низких положительных температурах, обеспечивающие повышение урожайности, качества и пищевой ценности картофеля, снижение содержания нитратов, потерь от микробиальной порчи, затрат на минеральные удобрения и пестициды. Совокупность научных положений, результатов и выводов, приведенных в работе, апробация технологии в производственных условиях, позволяют решить важную народно-хозяйственную проблему: длительно сохранить картофель с минимальными потерями от инфекционных и физиологических заболеваний, и как следствие, бесперебойно обеспечить население картофелем отечественного производства, отличающимся высоким качеством и пищевой ценностью. Разработана технология и технологическая инструкция по применению биопрепаратов при производстве и длительном холодильном хранении картофеля. Предложено устройство для обработки растительной продукции, в том числе картофеля, биопрепаратами, представленное в виде герметичной камеры опыливания с замкнутой многократной рециркуляцией пылевоздушной смеси защитного препарата. Технология обработки биологическими средствами защиты посадочного материала картофеля, вегетирующих растений и продукции, закладываемой на лительное холодильное хранение внедрена в научно-производственном объединении «Белогорка», Ленинградская область. Результаты исследования используются в учебном процессе при подготовке бакалавров по направлениям 19.03.02 «Продукты питания из растительного сырья», 19.03.01 «Биотехнология» и магистров по направлению 19.04.02 «Продукты питания из растительного сырья». Личный вклад автора состоит в разработке научной концепции, в выборе и обосновании научного направления, цели и задач исследования, в непосредственном участии на всех этапах постановки задач, проведения экспериментов, теоретического анализа и обобщения полученных результатов. По выполненной работе автором лично или при его непосредственном участии подготовлены к опубликованию научные труды. Скрининг биоконтрольных штаммов in vitro проводился совместно со специалистами Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии, технологического института антибиотиков и ферментов медицинского назначения. Молекулярно-генетическая идентификация, флуоресцентная in situ гибридизация и конфокальная сканирующая лазерная микроскопия, высокоэффективная жидкостная хроматография (HPLC) проведены при участии сотрудников лаборатории технологии микробных препаратов и лаборатории ризосферной микрофлоры ГНУ ВНИИСХМ. Часть исследований проведена с использованием оборудования ЦКП «Геномные технологии и клеточная биология» ГНУ ВНИИСХМ. Содержание:
Теоретические и практические аспекты применения искусственного холода и биологических средств защиты при длительном хранении растительной продукции.
Влияние экзогенных факторов на устойчивость растительной продукции к основным возбудителям инфекционных заболеваний при хранении.
Биологические методы в интегрированной защите продукции растениеводства.
Механизмы биологического контроля фитопатогенов.
Применение полифункциональных микробиологических биопрепаратов для защиты растительной продукции от фитопатогенов при хранении.
Методология и организация научных исследований.
Схема экспериментальных исследований.
Объекты микробиологического исследования. Первичный ступенчатый скрининг культивируемых биоконтрольных штаммов в опытах in vitro.
Объекты исследования действия биологических средств защиты. Отбор перспективных штаммов бактерий-антагонистов в условиях модельных экспериментов in vivo.
Методы оценки физиолого-биохимических механизмов защитного действия бактериальных штаммов.
Методы исследования влияния бактериальной инокуляции на характер и активность метаболических процессов в клубнях картофеля при длительном холодильном хранении.
Методы определения эффективности биоконтрольных штаммов при промышленном производстве и хранении картофеля.
Скрининг штаммов бактерий-антагонистов с комплексной биологической активностью в отношении фитопатогенов.
Селективное выделение и идентификация штаммов микробов-антагонистов.
Фенотипические характеристики биоконтрольных штаммов.
Оценка биоконтрольной активности микробов-антагонистов в условиях модельных экспериментов.
Влияние температуры и биоконтрольных штаммов на защитные механизмы картофеля.
Исследование влияния биоконтрольных штаммов бактерий-антагонистов на физиолого-биохимические процессы картофеля при его длительном холодильном хранении.
Интенсивность дыхания.
Активность терминальных оксидаз.
Изменение углеводной фракции: моно- и дисахариды, крахмал, пектиновые вещества.
Аскорбиновая кислота.
Спектральные характеристики.
Оценка эффективности действия биологической обработки на лёжкоспособность, товарное качество и безопасность картофеля.
Фиторегуляторная активность, стрессоустойчивость, товарное качество и сохраняемость при производстве картофеля.
Эффективность использования бактериальной инокуляции для сохранения качества и снижения потерь при холодильном хранении картофеля.
Экологические особенности, показатели пищевой ценности картофеля и безопасности применения биологических средств защиты.
Рекомендации по способу применения биоконтрольных штаммов в условиях опытно-промышленного производства и хранения картофеля.
Заключение.
Список литературы.
Приложения.
Санкт-Петербург, Санкт-Петербургский национальный исследовательский университет информационных технологий механики и оптики, 2015. — 386 с.
Специальность: 05.18.07 Биотехнология пищевых продуктов и биологических активных веществ.
Научный консультант: доктор технических наук, профессор Колодязная B.C. Цель исследования - теоретически и экспериментально обосновать применение ассоциативных бактерий-антагонистов в интегрированной защите картофеля от фитопатогенов при производстве и холодильном хранении в экологически ориентированных системах агропромышленного комплекса на примере Северо-Запада РФ.
Научная новизна работы. Разработана методология направленного поиска и ступенчатого скрининга потенциальных биоконтрольных штаммов с полифункциональной биологической активностью для интродукции в биоценозы при вегетации и холодильном хранении картофеля. Из эпифитной микробиоты клубней картофеля, находящегося на длительном холодильном хранении, выделены эффективные биоконтрольные штаммы бактерий родов Pseudomonas и Mycobacterium, ассоциированные с биоценозом, сформированным из психрофильных аборигенных микроорганизмов, отселекционированных, специфичных для промышленных условий холодильного хранения растительной продукции. Определено таксономическое положение прокариотного сообщества эпифитной микрофлоры клубней при холодильном хранении картофеля при использовании метода молекулярно-генетической идентификации. Выявлено изменение доминантных микроорганизмов аборигенного бактериального сообщества при введении в микробиом бациллярного инокулята B.subtilis. Доказана комплементарность культур родов Bacillus и Pseudomonas к низким температурам в условиях холодильного хранения картофеля методом высокопроизводительного секвенирования. Методом флуоресцентной in situ гибридизации и конфокальной сканирующей лазерной микроскопии определена пространственная локализация интродуцированных биоконтрольных штаммов на поверхности клубней при низкотемпературном хранении картофеля. Протестирована и определена в опытах in vitro и in vivo эффективность бактерий родов Pseudomonas, Mycobacterium и Bacillus против основных возбудителей инфекционных заболеваний при холодильном хранении вегетативных органов растений семейства пасленовых. Выявлено влияние бактерий-антагонистов на фитогормональный статус клубней. Установлено продуцирование биоконтрольным штаммом B.subtilis413 экзометаболитов, обладающих фитогормональными свойствами. Показано влияние интродуцированных штаммов бактерий-антагонистов на интенсификацию защитных реакций клубней картофеля с образованием стрессовых метаболитов, активизацию фенольного метаболизма и окислительных ферментов, участвующих как в повреждении внедряющегося фитопатогена на ранних этапах взаимодействия, так и на более поздних стадиях - при синтезе полимеров, создающих барьер для инфекции. Установлено влияние исследуемых штаммов бактерий родов Pseudomonas и Bacillus, отобранных по биоконтрольному эффекту, на повышение урожая картофеля и эффективности минеральных удобрений при интродукции бактериальных штаммов в агрофитоценозы, общий уровень фитофизиологической активности растений картофеля, снижение распространенности болезней урожая клубней. Дана оценка эффективности действия бактерий как в монокультуре, так и при применении в микробной паре при дефиците минерального азота в почве. Доказано, что обработка клубней биоконтрольными штаммами в процессе адаптации к низким температурам длительного холодильного хранения картофеля способствует сохранению устойчивости клубней к неблагоприятным внешним факторам, ограничивая тем самым глубокие физиолого-биохимические перестройки в растительных тканях. Бактериальная инокуляция индуцирует устойчивость картофеля к фитопатогенам при длительном холодильном хранении.
Практическая значимость. Выделены и селекционированы эффективные, технологичные биоконтрольные штаммы бактерий родов Pseudomonas, Mycobacterium, Bacillus, обладающие мико- и бактериостатическим действием по отношению к фитопатогенам вегетативных органов растений семейства паслёновых, на примере картофеля, через механизмы конкуренции и антагонизма, стимулирования защитных реакций растительных клеток в условиях холодильного хранения. Определены условия эффективного биоконтроля и метаболитной активности, проявления защитного и фиторегуляторного эффектов бактерий-антагонистов родов Pseudomonas, Mycobacterium, Bacillus применительно к картофелю и его сортовой специфичности при производстве и в условиях низких температур холодильного хранения. Обоснованы технологические параметры обработки биопрепаратами семенных клубней, вегетирующих растений и картофеля перед закладкой на длительное хранение при низких положительных температурах, обеспечивающие повышение урожайности, качества и пищевой ценности картофеля, снижение содержания нитратов, потерь от микробиальной порчи, затрат на минеральные удобрения и пестициды. Совокупность научных положений, результатов и выводов, приведенных в работе, апробация технологии в производственных условиях, позволяют решить важную народно-хозяйственную проблему: длительно сохранить картофель с минимальными потерями от инфекционных и физиологических заболеваний, и как следствие, бесперебойно обеспечить население картофелем отечественного производства, отличающимся высоким качеством и пищевой ценностью. Разработана технология и технологическая инструкция по применению биопрепаратов при производстве и длительном холодильном хранении картофеля. Предложено устройство для обработки растительной продукции, в том числе картофеля, биопрепаратами, представленное в виде герметичной камеры опыливания с замкнутой многократной рециркуляцией пылевоздушной смеси защитного препарата. Технология обработки биологическими средствами защиты посадочного материала картофеля, вегетирующих растений и продукции, закладываемой на лительное холодильное хранение внедрена в научно-производственном объединении «Белогорка», Ленинградская область. Результаты исследования используются в учебном процессе при подготовке бакалавров по направлениям 19.03.02 «Продукты питания из растительного сырья», 19.03.01 «Биотехнология» и магистров по направлению 19.04.02 «Продукты питания из растительного сырья». Личный вклад автора состоит в разработке научной концепции, в выборе и обосновании научного направления, цели и задач исследования, в непосредственном участии на всех этапах постановки задач, проведения экспериментов, теоретического анализа и обобщения полученных результатов. По выполненной работе автором лично или при его непосредственном участии подготовлены к опубликованию научные труды. Скрининг биоконтрольных штаммов in vitro проводился совместно со специалистами Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии, технологического института антибиотиков и ферментов медицинского назначения. Молекулярно-генетическая идентификация, флуоресцентная in situ гибридизация и конфокальная сканирующая лазерная микроскопия, высокоэффективная жидкостная хроматография (HPLC) проведены при участии сотрудников лаборатории технологии микробных препаратов и лаборатории ризосферной микрофлоры ГНУ ВНИИСХМ. Часть исследований проведена с использованием оборудования ЦКП «Геномные технологии и клеточная биология» ГНУ ВНИИСХМ. Содержание:
Теоретические и практические аспекты применения искусственного холода и биологических средств защиты при длительном хранении растительной продукции.
Влияние экзогенных факторов на устойчивость растительной продукции к основным возбудителям инфекционных заболеваний при хранении.
Биологические методы в интегрированной защите продукции растениеводства.
Механизмы биологического контроля фитопатогенов.
Применение полифункциональных микробиологических биопрепаратов для защиты растительной продукции от фитопатогенов при хранении.
Методология и организация научных исследований.
Схема экспериментальных исследований.
Объекты микробиологического исследования. Первичный ступенчатый скрининг культивируемых биоконтрольных штаммов в опытах in vitro.
Объекты исследования действия биологических средств защиты. Отбор перспективных штаммов бактерий-антагонистов в условиях модельных экспериментов in vivo.
Методы оценки физиолого-биохимических механизмов защитного действия бактериальных штаммов.
Методы исследования влияния бактериальной инокуляции на характер и активность метаболических процессов в клубнях картофеля при длительном холодильном хранении.
Методы определения эффективности биоконтрольных штаммов при промышленном производстве и хранении картофеля.
Скрининг штаммов бактерий-антагонистов с комплексной биологической активностью в отношении фитопатогенов.
Селективное выделение и идентификация штаммов микробов-антагонистов.
Фенотипические характеристики биоконтрольных штаммов.
Оценка биоконтрольной активности микробов-антагонистов в условиях модельных экспериментов.
Влияние температуры и биоконтрольных штаммов на защитные механизмы картофеля.
Исследование влияния биоконтрольных штаммов бактерий-антагонистов на физиолого-биохимические процессы картофеля при его длительном холодильном хранении.
Интенсивность дыхания.
Активность терминальных оксидаз.
Изменение углеводной фракции: моно- и дисахариды, крахмал, пектиновые вещества.
Аскорбиновая кислота.
Спектральные характеристики.
Оценка эффективности действия биологической обработки на лёжкоспособность, товарное качество и безопасность картофеля.
Фиторегуляторная активность, стрессоустойчивость, товарное качество и сохраняемость при производстве картофеля.
Эффективность использования бактериальной инокуляции для сохранения качества и снижения потерь при холодильном хранении картофеля.
Экологические особенности, показатели пищевой ценности картофеля и безопасности применения биологических средств защиты.
Рекомендации по способу применения биоконтрольных штаммов в условиях опытно-промышленного производства и хранения картофеля.
Заключение.
Список литературы.
Приложения.