Елинов Н.П. Основы биотехнологии

Подождите немного. Документ загружается.

общностью организации, а с другой—различной специфичностью.

характере иммунного ответа исключительная роль принадле-

жит кооперативным взаимодействиям иммунокомпетентных кле-

ток (ИКК)

—

макрофагов, лимфоцитов и вспомогательных дендрит-

ных клеток. ИКК содержатся в периферической крови, селезенке,

лимфоузлах, зобной железе и, следовательно, кооперативные вза-

имодействия ИКК могут иметь место в различных частях тела. В

таких взаимодействиях ведущую роль играют поверхностные ан-

тигены, кодируемые HLA; в них принимают также участие различ-

ные медиаторы (посредники), или цитокины (рис. 161). К цитоки-

нам относят разнородные вещества, участвующие в физиологиче-

ских и патофизиологических реакциях лейкоцитов„и других кле-

ток, и называемые клеточными регуляторами.

Рис.

161.

Кооперативные взаимодействия клеток иммунной системы с участием

медиаторов, или цитокинов: МФ — макрофаг, СК — стволовая клетка, ЭБ —

эквивалент бурсы, В — лимфоцит, ТИ — тимус, Кп — клетка памяти, ПК —

плазматическая клетка, КомК — коммитированные клетки, Тс — Т-супрессоры, Тх

— Т-хелперы, АГ — антиген, НК — натуральные (естественные) киллеры, КК —

цитотоксические клетки-киллеры, ИЛ

—-

интерлейкины, ФР — факторы роста, Ig-ы

— продукция циркулирующих антител: IgG, IgM, IgA, IgD, IgE, ВИЧ-вирус иммуно-

дефицита человека.

565

Цитокинам присущ ряд общих признаков: они низкомолекулярны

(ММ менее 80 кДа) и гликозилированы, действуют в пикомольных

(пМ) концентрациях, выделяются местно и непостоянно, выступа-

ют как паракринные или аутокринные (но не эндокринные) фак-

торы (от греч. krino — отделяю; para — возле, при; autos — сам;

endon — внутри), взаимодействуют с высокоафинными рецепто-

рами на клетках, изменяют спектр клеточных РНК и функциональ-

ную активность клетки после взаимодействия с рецепторами,

регулируют силу и продолжительность реакций воспаления и

иммунитета. Отдельные цитокины проявляют множественную ак-

тивность; ответ на цитокины зависит от их концентраций и типов

клеток. К тому же они взаимно индуцируют секрецию друг друга,

проявляя то синергизм, то антагонизм. Так, например, биологиче-

ская эффективность интерлеикинов (ИЛ) 1 и 6 опосредуется друг

другом.

К настоящему времени описано более десятка цитокинов,

включая лимфокины, монокины, интерлейкины, интерфероны и

др.

Только интерлеикинов известно

13,

первый из них

ИЛ-1

открыт

в 1972 г., образуется макрофагами; ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-5, ИЛ-7, ИЛ-8

и ИЛ-9 — Т-клетками; ИЛ-4 — активированными Т-клетками,

некоторыми линиями В-клеток и тучными клетками; ИЛ-6 —

различными клетками и является интерфероном (3-2. Не все ин-

терлейкины изучены с одинаковой глубиной, поэтому приводимая

характеристика их неравноценна.

ИЛ-1 стимулирует пролиферацию тимоцитов, рост и диффе-

ренцировку стволовых клеток, активирует Т-хелперы и В-клетки,

индуцирует миграцию лимфоцитов; его ММ 12—18 кДа.

ИЛ-2.

называют еще Т-клеточным ростовым фактором. Он

активирует Т-клетки, стимулирует дифференциацию и пролифе-

рацию В- и Т-клеток, повышает функцию клеток-киллеров, акти-

вированных лимфокинами.

ИЛ-3 повышает колониеобразование костно-мозговых клеток,

стимулируя гемопоэз, функцию эозинофилов и клеток-киллеров,

активированных лимфокинами.

ИЛ-4,

или фактор 1, стимулирующий В-клетки. Он модулирует

переключение синтеза классов Ig. ММ его 15 кДа в негликозили-

рованной форме и 20 кДа — в гликозилированной; индуцирует

синтез IgE, выполняя при этом хелперную функцию, экспрессию

Fc-рецепторов.

ИЛ-5 — гликопротеин с ММ 45—60 кДа, усиливает дифферен-

циацию В-клеток в плазматические клетки на последней стадии,

566

секрецию IgA IgA-несущими клетками, пролиферацию эозинофи-

лов и активацию их зрелых форм.

ИЛ-6 (В-клеточный

фактор дифференциации, гибридомный

ростовый фактор, гепатоцитарный стимулирующий фактор: ин-

терферон (3-2) стимулирует В-клеточную дифференциацию. Он

включает

184

аминокислоты. ММ его 26 кДа, индуцирует секрецию

Ig В-клетками, рост гибридом, плазмацитом, проявляет синергизм

с ИЛ-1, ИЛ-3 и фактором некроза опухоли (TNF). Предполагают,

что ИЛ-6 является ключевым веществом в семействе цитокинов.

ИЛ-7,

содержащий 154 аминокислотных остатка, индуцирует

селективную дифференцировку пре-В- в В-лимфоциты. Ген ИЛ-7

включает 6 экзонов и 5 интронов.

ИЛ-8,

или фактор хемотаксиса нейтрофилов, активирует ней-

трофильные сегментоядерные лейкоциты.

ИЛ-9,

или цитокин Р40 индуцирует миграцию лимфоцитов. Ген

ИЛ-9 содержит 5 экзонов.

Таким образом, лишь на примере 9 интерлейкинов видна

сложность регуляторных механизмов, включающихся в управле-

ние взаимодействиями клеток иммунной системы. Очевидно, что

in vivo имеется много других регуляторов (цитокинов), которые

будут открыты в ближайшие годы.

Познание и использование функций компонентов иммунной

системы на молекулярном уровне называется молекулярной им-

мунологией. На этом уровне теперь исследуют антигены и анти-

тела, их взаимодействия; рецепторы различных клеток иммунной

системы; гены и генетическое обеспечение этой системы.

В течение 1982—1986 гг. было проведено три Международных

рабочих совещания, посвященных поверхностным лейкоцитарным

дифференцирующим антигенам, обозначенным CD-антигенами

(от первых букв в английских словах Cluster Differentiation —

групповая дифференциация). Некоторые авторы используют обоз-

начения CD в качестве ссылки на антиген, например CD-2 —

синоним ТИ антигена и т. д. Другие используют CD-номер для

того,

чтобы указать на антитела, определяющие антиген.

В целях определения CD-антигенов используют 3 главных

метода с моноклональными антителами:

иммунофлуоресцентный, иммуноосадочный (иммунопреципита-

ция) и иммуногистологический на тканевых срезах. К началу 90-х

годов было определено 78 CD-антигенов (CD1—CD78), часть из

которых представлена в таблице 59.

567

Таблица 59. Характеристика некоторых лейкоцитарных CD-антигенов

Обозначе-

ние

антигена

CD1

CD2

CD4

CD5

CD7

CD8

CD 10

CD16

Характеристика

Кортикальный маркер тимоцитов, исчезающий на последней

стадии созревания Т-клетки. Его находят также на клетках

Лангерганса

. Молекула CD

состоит из трех полипептидных цепей

с ММ 49 кДа (CDla), 45 кДа

(CDIB)

И 43 кДа (СД1с) и каждая из

них закодирована соответствующим геном на первой хромосоме.

Названные цепи ассоциированы с р"-2-микроглобулином и,

следовательно, антиген аналогичен классическим антигенам

гистосовместимости, хотя и закодированным на другой хромосоме.

Т-клеточный антиген, являющийся рецепторной молекулой для

эритроцитов барана (ЭБ), называемый еще Til-антиген и LFA-2.

Молекула его имеет ММ 46-50 кДа, и важно подчеркнуть его

значимость в Т-клеточном созревании, поскольку антитела против

одного эпитопа

(см)

могут индуцировать клеточную пролиферацию.

Молекула антигена с ММ 55 кДа представлена приблизительно на

2/3 цикрулирующих Т-клеток у человека, включая большинство

Т-хелперов. CD4 называют еще Т-4 антигеном. Его находят также

на моноцитах и макрофагах. Он выступает рецептором ВИЧ (вирус

СПИД, см. рис. 226).

Его называют еще Т-1 антигеном. Он имеет ММ

кДа;

представлен

на большинстве Т-клеток у человека, на незрелых В-клетках плода

и, в небольшом числе, на покровной зоне В-клеток в лимфоидной

ткани взрослого человека.

Антиген имеет ММ 40 кДа, представлен на многих Т-клетках; он

полезен в качестве маркера Т-клеточных неоплазм, когда другие

Т-клеточные антигены отсутствуют. CD7 антиген, по-видимому,

является Fc-рецептором для IgM.

Антиген, называемый еще Т-8 антигеном и аналогичный Lyt 2(3)

антигену у мышей, имеет ММ 32-33 кДа. Широко используют в

качестве маркера для субпопуляции Т-клеток — суппрессов и

цитотоксических клеток. Антиген также имеется на

синусоидальных клетках селезенки.

Этот антиген называют еще как антиген общей острой

лимфобластной лейкемии, или CALLA-антиген (от англ. Common

Acute Lympoblastic Leukaemia Antigen). Его MM 100 кДа. Он

представлен на многих типах клеток (стволовые, ростковые

клеточные центры, гранулоциты

+ +

, макрофаги, почечный

эпителий, фибробласты, желчные канальцы)

Молекула антигена имеет ММ 50-60 кДа, она представлена

преимущественно на гранулоцитах. Он также может быть найден

на НК- и К-клетках, на некоторых микрофагах. Предположительно

молекула функционирует как низкоафинный рецептор для Fc-

области IgG.

568

Продолжение таблицы 59.

Обозначе-

ние

антигена

CD26

CD43

Характеристика

Состоит из двух полипептидных цепей с ММ 120 и 200 кДа

соответственно; представлен на активированных Т-клетках.

Молекула с ММ 95 кДа представлена на многих клетках, включая

Т-клетки, гранулоциты, эритоциты, эпителиальные клеточные

линии и мозг. 1

Примечание: Клетки Лангерганса локализуются в коже.

+ +

К гранулоцитам относят сегментоядерные нейтрофильные, эозино-

фильные и базофильные лейкоциты (микрофаги, полинуклеары)

Благодаря анализу рецепторов обнаружены так называемые

"двойные отрицательные (DN) Т-клетки", содержащие у/8-рецеп-

торы, контактирующие с CD3 рецепторами на а- и р- Т-клетках,

но не имеющие CD4 и CD8 рецепторов. Таких лимфоцитов мало

в тимусе и еще меньше в других лимфоидных тканях (не более

1%). Считают, что эти Т-клетки выполняют контролирующие фун-

кции на поверхности эпителия

(в

частности, кишечника) и поэтому

их называют эпителиальными, лимфоцитами.

Молекулярный компонент иммунной системы, представлен-

ный пятью классами иммуноглобулинов, формируется за счет

клеток В-ряда (в частности, плазматических), кооперативно взаи-

модействующих с некоторыми другими ИКК (см. рис. 161).

Молекулы антител построены, в основном, по единому плану

(рис.

162). Несмотря на огромное разнообразие антиген-связыва-

ющих мест, вариабельная часть молекул антител представлена 5—6

каноническими вариантами пространственной укладки и, как по-

лагает К. Милстейн (1990), мно-

гообразие их репертуара обус-

ловливается комбинаторикой

канонических структур в соче-

тании с точковыми заменами

аминокислотных остатков в ан-

тиген-связывающих центрах.

Рис. 162. Схематичное строение мо-

лекулы антитела IgGl человека:

— иди-

отип, 2 — изотип, 3 — аллотип, Па —

расщепление папаином, Fc — фрагмент,

Fd — фрагмент, С — константная об-

ласть, У — углевод, V — вариабельная

область, Н — тяжелая цепь, L — легкая

509

цога

Y-

Являясь белками сыворотки крови, строго специфичные анти-

тела образуются после стимулирования иммунной системы соот-

ветствующим антигеном. Благодаря своей исключительной специ-

фичности (за счету областей), антитела находят все более широкое

применение не только в фундаментальных исследованиях, но и в

практике выделения и очистки различных антигенных веществ, в

профилактике, диагностике и лечении многих заболеваний.

11.5.2.

Получение моноклональных антител

(МкАТ).

Вводимый

или попадающий в организм антиген признается и перерабатыва-

ется макрофагами, затем антигенная информация представляется

лимфоцитам, содержащим рецепторы. Так, в частности, стимули-

руется формирование клонов плазматических клеток, продуциру-

ющих специфичные антитела. Качество и количество антител

зависят от качества и дозы антигена, способа его введения в

организм, от вида животного — реципиента. Однако при традици-

онной технологии удается получать преимущественно гетероген-

ные антитела. В то же время "жизнь диктовала" необходимость

получения моноклональных антител — продуктов единого клона

клеток. Важным шагом к этому было открытие Портера в 1972 г.,

связанное с установлением "антительной природы" парапротеинов

в сыворотке крови людей и животных с опухолевым поражением

лимфатической системы (миелома). Миеломные клетки представ-

ляют собой трансформантов плазматической клетки, продуциру-

ющих моноклональные антитела. К сожалению, антиген при этом

до сих пор остается неустановленным. Тем не менее, факт обра-

зования моноклональных антител миеломными клетками был ре-

шающим в создании гибридом, с помощью которых сделан огром-

ный скачок в иммунобиотехнологии. Выдающийся вклад в это

внесли Г. Келер и К. Милстейн (1975), разработавшие метод

получения МкАТ желаемой специфичности и в большом количе-

стве.

Теперь известно, что каждой антигенной детерминанте соот-

ветствует свой клон В-клеток

—

антителопродуцентов

(в

организме

человека имеется в среднем 10

клонов В-клеток). Отсюда и

происходит понятие о МкАТ.

Келер и Милстейн слили мышиные миеломные клетки РЗ-Х63-

Ад8,

культивируемые in vitro, с лимфоцитами селезенки иммуни-

зированной овечьими эритроцитами мыши. При слиянии образо-

вывались гомо(ди-, поли)кариотические гибридные клетки — гиб-

ридомы, сохраняющие признаки обеих родительских особей, а

именно — способность к неограниченному росту in vitro и in vivo

(признак миеломной клетки) и способность продуцировать специ-

570

фичное антитело (признак В-лимфоцита). Названием "гомо(ди-,

поли)кариотические гибридомы" подчеркивается факт происхож-

дения клеток от одного вида животного. Принципиально этот метод

пригоден для получения антител против любого антигена.

Таким образом, при традиционных методах получения антител

после иммунизации животных имунные глобулины оказываются,

как правило, поликлона льным и, тогда как с помощью

гибридом получают МкАТ.

Однако следует помнить, что не все клетки подвергаются

соматической гибридизации — специализированные функции ро-

дительских партнеров сохраняются лишь в том случае, если эти

клетки находятся на одной и той же стадии деления. Другие клетки

остаются неслившимися или сливаются с гомологичными особями.

Этапы получения гомо-, гетеро- или синкариотической гибридомы

являются следующими:

1) иммунизация антигеном (например, мыши),

2) взятие клеток селезенки (лимфоциты — плазматические

клетки) от иммунной мыши,

3) отбор миеломных клеток,

слияние клеток

—

получение гетерокариотических гибридом,

5) селекция гибридов,

6) клонирование гибридов,

7) накопление in vivo или in vitro антител и их выделение.

Клетки — гибридомы можно сохранять в замороженном виде,

например в

диметилсульфоксиде, или вначале их суспендируют

в смеси

диметилсульфоксида и

95%

сыворотки в концентрации

—

клеток/мл. Замораживают при — 70°С и хранят в жидком

азоте.

Теперь имеются линии клеток, которые сохраняются в течение

ряда лет без потери способности выделять Ig. Но есть и коротко-

живущие линии; у таких мышиных линий обычно вначале исчезает

тяжелая цепь Ig (утрата 12-й хромосомы), а затем — легкая цепь

Ig (потеря 6-й хромосомы).

В целях получения гибридом используют разные линии мие-

ломных клеток (таблица 60), из которой видно, что более прием-

лемыми линиями являются 8226AR/NI Р4-1 и Sp 2/0, не продуци-

рующие Ig. Следует иметь в виду и тот факт, что гибридомы легче

получаются при использовании клеток от одного вида животного

(гомокариотические гибриды). Межвидовые гибридизации (гете-

рокариотические гибриды) всегда мало удачны, так как один из

571

партнеров

гибридоме теряет ряд хромосом, включая

те

из

них,

которые контролируют образование

Ig. И все же

стабильные

гетерокариотические межвидовые гибриды удается получать,

на-

пример,

при

слиянии миеломных клеток мышей

крысиными

лимфоцитами.

Таблица 60. Линии некоторых миеломных клеток, рекомендованные

для получения гибридом

Происхождение

человеческая

—"—

крысиная LOU

мышиная BALB/c

—

—"—

Название

полное

SKO-007

(u=266ARI

GM15006TG-

А12

PPMJ-8226

210.RCY3.

.Agl.2.3

P3-X63-Ag8

P3-NSI/1-

Ag4-1

Sp2/0-Agl4

MPC-11-X45-

-6TG1.7

сокращенное

—

8226AR/

NIP4-1

X63

NS-1

Sp2/0

X45

Образуемые цепи

легкие

—

тяжелые

У2

—

у2Ъ

Примечание:

легкая цепь только образуется, но не выделяется.

Образование гомо(ди-, поли)кариртической клетки является

лишь первой ступенью

возникновению гибридомы. В последую-

щем, после первого митоза, ядра сливаются

образуются синка-

риотические гибридные клетки. Однако замечено,

что

лишь гиб-

ридомы

неслившимися ядрами могут развиваться дальше. Если

родительские партнеры

при

этом различались

по

фенотипу,

то

соматический гибрид имеет смешанный фенотип.

В 1980

г. Л.

Олссон

С.

Каплан;

К. М.

Кроус,

А.

Линенбах

572

др.

сообщили

получении миеломных линий от людей, пригодных

для накопления и выделения человеческих МкАТ (см. таблицу 60).

В целях получения лимфоидных клеток животному (мыши)

вводят внутримышечно или внутрибрюшинно антиген в дозе при-

мерно

5-^200

мг в расчете на чистый белок. В ответ на сильный

антиген в селезенке 0,05% клеток секретируют IgM и IgG в

соотношении, близком 10:1 из примерно 1% всех секретирующих

клеток. Через 3—4 недели повторно вводят 10—100 мкг антигена.

В течение последующих 2—4 недель проверяют титры антител и

затем перед экстирпацией селезенки в течение нескольких дней

вводят внутривенно небольшие дозы антигена для активации

В-лимфоцитов. Могут быть приняты и другие схемы иммунизации.

Для целей соматической гибридизации необходимы также

миеломные клетки мышей. Обычно используют линию BALB/c, от

которой была получена перевиваемая миелома МОРС-21 (от англ.

Mineral Oil—induced Plasmocytome 21). При этом необходимо:

1) наличие у клеток селективного маркера устойчивости к

определенному ингибитору, например, к 8-азагуанину, к бромде-

зоксиуридину и др.; клетки, устойчивые, к 8-азагуанину, не содер-

жат фермента

гипо-

ксантингуанинфос

форибозилтранс-

феразы (ГТФРТ) и

он-сн

/ поэтому не способ-

ны использовать

экзогенный гипо-

. ксантин для синте-

за пуринов. ГГФРТ

еромдазмсииждин катализирует реак-

цию взаимодейст-

н6

''*°

вйя гипоксантина и

гуанина

5'-фосфо-

рибозил-1-пирофосфатом с образованием соответствующих нук-

леотидов — инозин-5'-фосфата и гуанозин-5'-фосфата. Клетки,

устойчивые к бромдезоксиуридину, не обладают ферментом тими-

динкиназой (ТК); ТК катализирует реакцию превращения тимиди-

на в тимидин-5'-фосфат;

2) отсутствие образования нежелательных легких или тяжелых

цепей Ig (происхождение их может быть "миеломное"или "селезе-

ночное").

573

J0"

«&?.

Ar. &л

КГ

—он

он

он он

гуанозин-5'-фосфат тимцдин-5'-фосфат

Последний этап на пути к собственно технологическому про-

цессу накопления МкАТ заключается в экстирпации селезенки из

организма мыши и получение В-клеток. Это осуществляют через

3—4 дня после последнего введет л антигена.

Изолированную селезенку помещают в чашку Петри со средой,

содержащей сыворотку крови и ее промывают (перфузируют).

Клетки центрифугируют, эритроциты лизируют, лимфоциты сус-

пендируют в среде Дальбекко без сыворотки и проверяют их на

жизнеспособность.

На следующем этапе смешивают примерно 10

миеломных

клеток с 10

клеток селезенки. Клетки в среде без сыворотки

выдерживают 45 мин., центрифугируют в конических пробирках.

Супернатант удаляют, осадок встряхивают и к нему добавляют 2

мл.

40% полиэтиленгликоля (ПЭГ) с ММ примерно

1,5—4,0

кДа,

поддерживают температуру

37°С,

рН среды 7,6—7,8, выдерживают

30 мин., затем в течение последних 7—8 мин. добавляют среду

Дальбекко с фетальной телячьей сывороткой (5—15%). Клетки в

разведенном ПЭГ осаждают, ресуспендируют в

мл.

гибридомной

среды с сывороткой и распределяют в лунки объемом 2 мл для

микротитрования. При необходимости среду заменяют на свежую

(среда с гипоксантином и тимидином). В среду добавляют клетки-

фидеры, или "кормилки" (от англ. feeder — приток, питатель) —

преимущественно перитонеальные макрофаги, индуцированные

минеральными маслами) и

карбоксиметилцеллюлозу.

качест-

ве индукторов слияния клеток можно использовать вирус Сендай,

температурный шок, электроразряд и др.

В смешанной популяции из миеломных и селезеночных клеток

возможно возникновение нескольких типов гетерокарионов:

1) миеломные клетки — миеломные клетки,

2) миеломные клетки — В-лимфоциты,

3) миеломные клетки — любые клетки селезенки,

4) клетки селезенки — клетки селезенки.

574