Кирица Е. Направленный синтез каротиноидов у дрожжей и перспектива их использования

Подождите немного. Документ загружается.

Следует отметить, что включение в состав среды для культивирования дрожжей

экстракта томатных выжимок, кукурузного масла, лимонной кислоты и координационного

соединения железа в разнообразных вариантах оказывает различное влияние на биосинтез

торулина, т.е. его биосинтез находится в прямой зависимости от состава питательной среды

(рис. 4.9). Исходя из результатов, представленных на рисунке, следует, что комбинация:

экстракт томатных выжимок + кукурузное масло + лимонная кислота в составе

ферментационной среды (вариант №8), оказывает отрицательное действие на биосинтез

торулина, количество которого уменьшается на 33%. Значительное увеличение содержания

торулина в биомассе дрожжей, согласно представленным результатам, наблюдается при

культивировании дрожжей Rhodotorula gracilis CNMN-YS-03 на питательной среде, в состав

которой дополнительно входит только один фактор - кукурузное масло (вариант № 3).

Использование данного индуктора позволило повысить и активизировать биосинтез этого

каротиноида до 7208,29 мкг/л, что в 2,38 раза больше контрольного значения.

Биосинтез и содержание торулародина в биомассе дрожжей Rhodotorula gracilis

CNMN-YS-03, как следует из рисунка 4.9 (в), зависит от состава питательной среды. Как

видно из представленных данных, некоторые составляющие компоненты питательных сред

оказывают ингибирующее действие на биосинтез торулародина. Однако следует отметить и

положительное влияние некоторых комбинаций. Так, культивирование дрожжей на

питательной среде MZ -30 с кукурузным маслом и лимонной кислотой (вариант №7)

позволило увеличить до 2730,496 мкг/л или на 123,0 % содержание торулародина в

клеточной массе дрожжей. Подобной степенью эффективности обладает и наличие в

питательной среде

индуктора процесса каротинообразования дрожжей – кукурузного масла,

присутствие которого способствует увеличению выхода кислотного пигмента дрожжей на

103% (вариант № 3).

На основании результатов исследования изменения качественного состава

каротиноидного комплекса дрожжей в зависимости от состава питательной среды, были

рассчитаны коэффициенты регрессии для β-каротина, торулина и торулародина по схеме

Иейтс (табл. 4.8, 4.9, 4.10).

Таблица 4.8

Расчет коэффициентов регрессии по схеме Иейтс для β-каротина

№

п/п

Результаты

эксперимента

1 шаг 2 шаг 3 шаг 4 шаг К

регрес

сии

Ряд

1474,578 3797,64 11395,72 25666,19 46835,30 2927,21 1

2323,062 7598,08 14270,46 21169,12 1519,12 94,94 Х1

3731,113 7208,40 11604,51 1669,09 1942,25 121,39 Х2

3866,969 7062,07 9564,61 -149,97 -2698,12 -168,63 Х1Х2

3152,196 6287,58 984,34 3654,11 834,83 52,18 Х3

4056,200 5316,94 684,75 -1711,87 -3253,11 -203,32 Х1Х3

3640,661 5152,91 1401,77 -1835,89 -3717,35 -232,33 Х2Х3

3421,406 4411,69 -1551,75 -862,24 -89,06 -5,57 Х1Х2Х3

2645,371 848,48 3800,44 2874,74 -4497,07 -281,07 Х4

3642,208 135,86 -146,33 -2039,91 -1819,06 -113,69 Х1Х4

2456,001 904,00 -970,64 -299,59 -5365,98 -335,37 Х2Х4

2860,935 -219,26 -741,22 -2953,52 973,65 60,85 Х1Х2Х4

2896,812 996,84 -712,63 -3946,77 -4914,65 -307,17 Х3Х4

2256,104 404,94 -1123,26 229,42 -2653,93 -165,87 Х1Х3Х4

2661,366 -640,71 -591,90 -410,63 4176,19 261,01 Х2Х3Х4

1750,326 -911,04 -270,33 321,57 732,20 45,76 Х1Х2Х3Х4

Математический анализ представленных и рассчитанных коэффициентов регрессии

позволил вывести уравнение регрессии для β-каротина:

Y=2927,21+94,94Х1+121,39Х2-168,63Х1Х2+58,18Х3-203,32 Х1Х3-232,33Х2Х3-5,57Х1Х2Х3-

281,07Х4-113,69Х1Х4-335,37Х2Х4+60,85Х1Х2Х4-307,17Х3Х4-

165,87Х1Х3Х4+261,01Х2Х3Х4+45,76Х1Х2Х3Х4

Согласно данному уравнению регрессии, можно констатировать, что комбинации

факторов в составе питательных сред могут оказывать различное действие на процесс

биосинтеза β-каротина как в положительную сторону, так и в отрицательную. Однако

отметим, что наиболее эффективно для получения наибольшего количества β-каротина,

будет способствовать наличие в составе питательной среды сочетания факторов - лимонная

кислота,

кукурузное масло и координационное соединение железа (вариант №15) или только

кукурузного масла (вариант среды № 3).

В дальнейшем, по результатам изучения влияния состава среды культивирования

пигментных дрожжей на синтез торулина, были рассчитаны коэффициенты регрессии по

схеме Иейтс (табл. 4.9).

Таблица 4.9

Расчет коэффициентов регрессии по схеме Иейтс для торулина

№

п/п

Результаты

экспериментов

1 шаг 2 шаг 3 шаг 4 шаг К

регрессии

Ряд

3022,362 7858,83 19792,22 37275,81 70266,05 4391,63 1

4836,468 11933,39 17483,59 32990,24 -301,52 -18,85 Х1

7208,291 9612,53 18455,40 -2975,53 -6430,53 -401,91 Х2

4725,098 7871,06 14534,84 2674,00 -13641,69 -852,61 Х1Х2

4043,952 9994,09 -669,09 2333,09 -6229,20 -389,32 Х3

5568,577 8461,31 -2306,44 -8763,62 -3176,04 -198,50 Х1Х3

5851,062 10882,84 2106,35 -9652,99 -11514,09 -719,63 Х2Х3

2019,998 3652,00 567,66 -3988,70 -6212,01 -388,25 Х1Х2Х3

4616,074 1814,11 4074,56 -2308,63 -4285,57 -267,85 Х4

5378,017 -2483,19 -1741,47 -3920,57 5649,53 353,10 Х1Х4

3558,456 1524,63 -1532,78 -1637,35 -11096,71 -693,54 Х2Х4

4902,858 -3831,06 -7230,84 -1538,69 5664,29 354,02 Х1Х2Х4

4156,715 761,94 -4297,30 -5816,03 -1611,94 -100,75 Х3Х4

6726,125 1344,40 -5355,69 -5698,07 98,67 6,17 Х1Х3Х4

2826,873 2569,41 582,46 -1058,39 117,96 7,37 Х2Х3Х4

825,1231 -2001,75 -4571,16 -5153,62 -4095,23 -255,95 Х1Х2Х3

Х4

Обработка полученных результатов математическим методом позволила составить

уравнение регрессии для торулина, используя рассчитанные коэффициенты регрессии,

согласно схеме Иейтс:

Y=4391,63-18,5Х1-401,91Х2-852,61Х1Х2-389,32Х3-198,5Х1Х3-719,63Х2Х3-388,25Х1Х2Х3-

267,85Х4+353,1Х1Х4-693,54Х2Х4+354,02Х1Х2Х4-100,75Х3Х4+6,17Х1Х3Х4+7,37Х2Х3Х4-

255,95Х1Х2Х3Х4

По данному уравнению, можно проанализировать, как различные факторы будут

оказывать действие на биосинтез торулина дрожжами. Согласно уравнению регрессии,

наилучший позитивный эффект на синтез этого пигмента будет получен при

культивировании штамма дрожжей Rhodotorula gracilis CNMN-YS-03 на питательной среде,

в состав которой будут включены экстракт томатных выжимок и координационное

соединение железа (вариант среды №10) или комбинация – экстракт томатных выжимок,

кукурузное масло и координационное соединение железа (вариант среды № 12).

Результаты определения содержания торулародина в биомассе дрожжей, полученной на

питательных средах, состав которых был определен по матрице полного факторного

эксперимента, служили основой для рассчета коэффициентов регрессии по схеме Иейтс

(табл. 4.10).

Таблица 4.10

Расчет коэффициентов регрессии по схеме Иейтс для торулародина

№

п/п

Результаты

экспериментов

1 шаг 2 шаг 3 шаг 4 шаг

регрессии

Ряд

1223,586 2746,34 6540,69 12626,03 25642,46 1602,65

1522,752 3794,35 6085,35 13016,42 -3263,45 -203,97

Х1

2487,409 2999,02 6747,61 -3853,78 -1565,70 -97,86

Х2

1306,942 3086,32 6268,81 590,33 -5564,52 -347,78

Х1Х2

1798,416 3660,61 -881,30 1135,31 -934,15 -58,38

Х3

1200,608 3087,01 -2972,48 -2701,01 -2923,80 -182,74

Х1Х3

2730,496 4198,11 711,47 -3256,49 -2514,52 -157,16

Х2Х3

355,8263 2070,70 -121,15 -2308,03 -3329,69 -208,11

Х1Х2Х3

1742,989 299,17 1048,01 -455,34 390,39 24,40

Х4

1917,618 -1180,47 87,30 -478,80 4444,10 277,76

Х1Х4

1275,081 -597,81 -573,60 -2091,18 -3836,32 -239,77

Х2Х4

1811,926 -2374,67 -2127,41 -832,62 948,47 59,28

Х1Х2Х4

1461,782 174,63 -1479,63 -960,71 -23,46 -1,47

Х3Х4

2736,328 536,85 -1776,86 -1553,81 1258,55 78,66

Х1Х3Х4

1733,198 1274,55 362,22 -297,23 -593,10 -37,07

Х2Х3Х4

337,502 -1395,70 -2670,24 -3032,46 -2735,23 -170,95

Х1Х2Х3

Х4

Согласно данным, представленным в таблице расчета коэффициентов регрессии,

было составлено уравнение регрессии для торулародина - кислотного пигмента

каротинсинтезирующих дрожжей:

Y=1602,65-203,97Х1-97,86Х2-347,78Х1Х2-58,38Х3-182,74Х1Х3-157,16Х2Х3-

208,11Х1Х2Х3+24,4Х4+277,76Х1Х4-239,77Х2Х4+59,28Х1Х2Х4-1,47Х3Х4+78,66Х1Х3Х4-

37,07Х2Х3Х4-170,95Х1Х2Х3Х4

По составленному уравнению регрессии можно сделать заключение о выборочном

влиянии комбинации факторов на биосинтез торулародина. Незначительный

стимулирующий эффект, как показал анализ составленного уравнения регрессия, на процесс

накопления торулародина будет наблюдаться при культивировании дрожжей на питательной

среде, содержащей такие факторы как кукурузное масло, лимонную кислоту и

координационное соединение железа (вариант среды № 15). Лучший стимулирующий

эффект на биосинтез каротиноида, согласно рассчитанным коэффициентам регрессии, будет

оказывать присутствие в питательной среде экстракта томатных выжимок и

координационного соединения железа (вариант среды №10). Незначительное влияние на

данный биосинтез торулародина будет оказывать сочетание факторов: экстракт томатных

выжимок, кукурузное масло и лимонная кислота (вариант среды № 8).

Таким образом, результаты проведенных исследований позволили констатировать,

что использование методов математического планирования эксперимента в биотехнологии

культивирования пигментных дрожжей позволяет не только оптимизировать состав

питательной среды для получения максимального количества конечного продукта, но и

предположить влияние сочетания различных факторов на процесс каротинообразования.

На основе проведенных экспериментов по изучению влияния нетрадиционных

источников питания, специфических индукторов, предшественников и металлокомплексов

на продуктивность и биосинтез каротиноидов у дрожжей разработаны следующие способы:

1) Способ получения биомассы дрожжей с повышенным содержанием

каротиноидов:

К питательной среде MZ-30 добавляется экстракт томатных выжимок (0,8 л),

лимонная кислота концентрацией 1,0 г/л и [Fe2NiO(CCl3COO)6(CH3OH)3] (0,5 мг/л). Вводится

инокулят дрожжей рода Rhodotorula в количестве 3-5%, от объема питательной среды.

Культивирование происходит при температуре +25-27ºC на качалке (180-200 об/мин.), рН –

5,5-6,5, освещение 12-15 тыс. эрг/см

. Данный способ позволит увеличить выход

каротиноидов на этой питательной среде в 2 раза.

2) Способ получения биомассы дрожжей с повышенным содержанием β-каротина:

К питательной среде MZ-30 добавляется экстракт томатных выжимок (0,8 л) и

лимонная кислота, в количестве 1,0 г/л. Вводится инокулят дрожжей рода Rhodotorula в

количестве 3-5%, от объема питательной среды. Культивирование происходит при

температуре +25-27ºC, на качалке (180-200 об/мин), рН – 5,5-6,5, освещение 12-15 тыс.

эрг/см

. Данный способ позволит увеличить выход β-каротина в 1,7 раза.

3) Способ получения биомассы дрожжей с повышенным содержанием торулина:

К питательной среде MZ-30 добавляется кукурузное масло концентрацией 1,0 г/л.

Вводится инокулят дрожжей рода Rhodotorula в количестве 3-5%, от объема питательной

среды. Культивирование происходит при температуре +25-27ºC на качалке (180-200 об/мин),

рН – 5,5-6,5, освещение 12-15 тыс. эрг/см

. Данный способ позволит увеличить выход

каротиноидов в 2,4 раза.

4) Способ получения биомассы дрожжей с повышенным содержанием торулародина:

К питательной среде MZ-30 добавляется кукурузное масло (1,0 г/л) и лимонная

кислота (1,0) мг/л. Вводится инокулят дрожжей рода Rhodotorula в количестве 3-5%, от

объема питательной среды. Культивирование происходит при температуре +25-27ºC на

качалке (180-200 об/мин), рН – 5,5-6,5, освещение 12-15 тыс. эрг/см

. Данный способ

позволит увеличить выход торулародина в 1,2 раза.

ГЛАВА 5

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДРОЖЖЕВОЙ БИОМАССЫ С

ПОВЫШЕННЫМ СОДЕРЖАНИЕМ ЦИНКА

Цинк является одним из главных комплексных биокатионов в биохимических

процессах и участвует на всех уровнях клеточной организации. Метаболизированный в

структуру некоторых белков, играющих каталитическую и транспортную роль,

биологическая роль цинка тесно связана с его участием в ферментных реакциях,

происходящих в клетке (PALAMARU ş.a., 1996). Примерно из 60 цинксодержащих

ферментов, влияющих на белковый и фосфорный

метаболизм, на фотосинтез и регуляцию

окислительно-восстановительного потенциала, особая роль отводится ДНК и РНК –

полимеразам, дипептидазам и основным фосфатазам.

Механизм высокой биологической активности цинка связан со стабильностью

координационных связей с большинством внутриклеточных лигандов. Обладая высокой

способностью к комплексации, цинк стабилизирует не только структуру некоторых

неферментных белков, таких как α – макроглобулин

, гликопротеин, но и внутриклеточные

структуры – рибосомы и гликопротеины. Отмечается также значимость цинка в механизме

наследственности (ШКОЛЬНИК, 1974; УДРИЧЕ, 1981). Данный эффект связан, вероятно, с

тем, что цинк играет существенную роль во внутриклеточном метаболизме железа

(ДЕДЮХИНА, 1992), которое, согласно литературным источникам, является важным

элементом для осуществления процессов дыхания и фотосинтеза у всех аэробных

микроорганизмов (CERDA-OLMEDO, 1989; RUDIC ş.a., 2000).

Необходимость цинка для метаболизма микроорганизмов объясняется в первичности

его значения для широкого спектра ферментов, среди которых можно отметить

оксидоредуктазы, трансферазы, гидролазы, изомеразы и лигазы. Цинк, согласно

литературным данным, оказывает не только стимулирующее действие на синтез некоторых

биологически активных веществ (белка, фикобилипротеидов, полисахаридов и липидов), но

и способствует активизации трипсина в желудке рыб (BRAFIELD, KOODIL, 1994;.

CHIRIAC, 2003).

Исходя из выше изложенного, представляет интерес изучение эффективности

использования различных соединений цинка для регуляции биосинтетических процессов у

пигментных дрожжей и разработка способа получения цинксодержащей биомассы для

использования в составе стартовых кормов личинок рыб.

5.1. Продуктивность и биосинтез каротиноидных пигментов

дрожжами, культивируемыми в присутствии различных

соединений цинка

Для отбора соединений цинка, используемых в качестве регуляторов биосинтетических

процессов при культивировании дрожжей, изучалось влияние различных соединений

[Zn(Gly)(DL-Ser)], [Zn(DL-Ala)(DL-Ser)], ZnSO47H2O, Zn(CH3COO)24H2O на

продуктивность дрожжей и биосинтез каротиноидных пигментов.

Дрожжи Rhodotorula gracilis CNMN-YS-03 культивировали на питательных средах

MS-1 или MZ-30 c добавлением 5 % инокулята при термическом режиме +25-27°С на

качалке (180-200 об/мин) и освещении 12-15 тысяч эрг/см². На пятые сутки культивирования

биомассу дрожжей отделяли от культуральной жидкости центрифугированием.

Продуктивность исследуемой культуры, количественное и качественное определение

каротиноидных пигментов определяли классическими методами (ЕГОРОВА, 1995; TAMAŞ,

NEAMŢU, 1986).

На первом этапе изучали влияние координационных соединений цинка [Zn(Gly)(DL-

Ser)] и [Zn(DL-Ala)(D-Ser)] в концентрациях 1,0; 5,0; 10,0 мг/л, на процесс аккумуляции

клеточной массы и биосинтеза каротиноидов.. Данные соединения цинка координированы с

лигандами органической природы, состоящими из двух аминокислот: глицин, серин и

аланин, серин, которые, обладают важными свойствами.

Аланин в качестве Д-изомера, является компонентом клеточной стенки

микроорганизмов, глицин необходим для синтеза белков, а серин является заменимой

кислотой, которая участвует в биосинтезе глицина, серосодержащих аминокислот

(метионина, цистеина и триптофана), а также этаноламина, сфинголипидов и, помимо этого,

служит источником одноуглеродного фермента (превращение в глицин с участием

тетрагидрофолиевой кислоты – ТГФК), который играет

важную роль в биосинтезе холина,

пуриновых оснований и пиримидинов (BRAFIELD, 1994).

Проведенные исследования показывают, что все используемые концентрации

координационных соединений цинка оказали положительный эффект на процесс

аккумуляции клеточной массы дрожжей (табл.5.1). Продуктивность дрожжей под действием

координационных соединений цинка изменяется в зависимости от концентрации

исследуемых веществ и от сочетания аминокислот, входящих в них.

Следует

отметить, что наилучшие результаты были получены при добавлении в

питательную среду металлокомплексов [Zn(Gly)(DL-Ser)] и [Zn(DL-Ala)(D-Ser)] в

концентрациях 5,0 и 10,0 мг/л. Максимальное увеличение продуктивности биомассы

дрожжей, по отношению к контролю, составило 57,28% при использовании соединения

[(Zn(Gly)(DL-Ser)] в концентрации 5,0 мг/л, и 68,29% при культивировании штамма в

присутствии [Zn(DL-Ala)(D-Ser)] концентрацией 10,0 мг/л.

Стимулирующий эффект координационных соединений цинка на прирост клеточной

массы дрожжей рода Rhodotorula, вероятно, можно объяснить основной функцией цинка -

стабилизацией клеточных структур, а также наличием в них комбинации аминокислот

глицина, серина и аланина, серина.

Таблица 5.1

Влияние координационных соединений цинка на продуктивность

и содержание каротиноидов у дрожжей Rhodotorula gracilis CNMN-YS-03

При изучении влияния координационных соединений цинка на биосинтетическую

активность дрожжей было установлено, что содержание каротиноидов в биомассе зависело

от концентрации и природы используемого соединения (табл. 5.1). Наилучшие результаты

были получены при культивировании каротинсинтезирующих дрожжей на питательной

среде с Zn(Gly)(D-Ser) концентрацией 10,0 мг/л, присутствие которого способствовало

Продуктивность Каротиноиды

Координац

ионные

соединения

Концентра

ция, мг/л

г/л с.в.

Х1±Х2

% К

мкг/г с.в.

Х1±Х2

% К

мкг/л

М±м

% К

1,0

4,9±0,25 154,14 332,41±8,36 61,03

1628,79±71,87

94,03

5,0

5,0±0,26 157,28 352,59±10,65 64,73

1762,93±132,58

101,78

Zn(Gly)(DL-Ser)

10,0

4,61±0,42 145,01 650,01±12,94 119,33

2996,54±12,32

172,98

1,0

4,77±0,36 150,05 365,89±9,68 67,17

1745,27±23,99

100,75

5,0

4,97±0,01 156,34 395,46±10,47 72,56

1965,44±7,35

113,46

[Zn(DL-Ala)(D-

Ser)]

10,0

5,35±0,08 168,29 458,66±6,83 84,20

2453,81±132,2

141,66

MS – 1 (К)

3,18±0,15 100,00 544,72±13,51 100,00

1732,21±59,4

100,00

увеличению суммарного содержания каротиноидов до 2996,54 мкг/л, что на 72,98 % больше

по сравнению с контролем.

Изменение качественного состава каротиноидного комплекса дрожжей Rhodotorula

gracilis CNMN-YS-03 в результате культивирования штамма на питательной среде MS – 1 с

координационными соединениями цинка представлено на рисунке 5.1.

Анализ полученных результатов показал, что содержание β-каротина, торулина и

торулародина в биомассе дрожжей варьирует в зависимости от природы лигандов, входящих

в состав координационных соединений, и их концентрации в питательной среде.

а) б)

в)

с)

Рисунок 5.1. Влияние координационных соединений цинка на содержание β-каротина

(а), торулина (б) и торулародина (в) в биомассе дрожжей

Rhodotorula gracilis CNMN-YS-03

116

157

109

110

100

120

140

160

% К

1 5 10 1 5 10

Zn(Gly)(DL-Ser) Zn(DL-Ala)(D-Ser)

торулародин

101

132

102

100

120

140

% К

15101510

Zn(Gl y)(DL-

Ser)

Zn(DL-Ala)(D-

Ser)

β-каротин

101 102

109

117

100

120

% К

15101510

Zn(Gly)(DL-Ser) Zn(DL-Ala)(D-Ser)

торулин