Кирица Е. Направленный синтез каротиноидов у дрожжей и перспектива их использования

Подождите немного. Документ загружается.

104

135

154

125

104

138

134

100

120

140

160

% К

0,05 0,1 0,2 0,5 1 0,1 0,2 0,4 0,8 1,6

[Fe2NiO(CCl3COO)6(CH3OH)3] Fe2Mn(CCl3COO)6(CH3OH)3]

а)

105

159

163

172

101

111

109

100

120

140

160

180

% К

0,05 0,1 0,2 0,5 1 0,1 0,2 0,4 0,8 1,6

[Fe2NiO(CCl3COO)6(CH3OH)3] Fe2Mn(CCl3COO)6(CH3OH)3]

б)

107

154

135

146

100

105

115

148

100

120

140

160

% К

0,05 0,1 0,2 0,5 1 0,1 0,2 0,4 0,8 1,6

[Fe2NiO(CCl3COO)6(CH3OH)3] Fe2Mn(CCl3COO)6(CH3OH)3]

в)

Рисунок 4.6. Влияние различных координационных соединений Fe (II) на содержание

β – каротина (а), торулина (б) и торулародина (в) в биомассе дрожжей

Rhodotorula gracilis CNMN-YS-III/5

Отметим, что наилучшие результаты были получены при использовании в

качестве биорегулятора процесса каротиногенеза соединения

[Fe2NiO(CCl3COO)6(CH3OH)3] концентрацией 0,2 мг/л (рис.4.6 (в)).

Обобщая полученные результаты, можно констатировать, что из исследуемых

координационных соединений железа специфическое стимулирующее действие на

процесс каротинообразования дрожжей свойственно координационному соединению

[Fe2NiO(CCl3COO)6(CH3OH)3].

На следующем этапе, для подтверждения эффективности действия

[Fe2NiO(CCl3COO)6(CH3OH)3] в качестве специфического регулятора процесса биосинтеза

каротиноидов, были поставлены эксперименты с культурой дрожжей Rhodotorula gracilis

– CNMN-YS-03 на органической среде MZ-30.

123

174

163

128

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

% К

1- 0,05 мг/л, 2 – 0,1 мг/л, 3-0,2 мг/л, 4- 0,5 мг/л

Рисунок 4.7. Влияние [Fe2NiO(CCl3COO)6(CH3OH)3] на содержание каротиноидов в

биомассе дрожжей Rhodotorula gracilis – CNMN-YS-03

В результате исследований было установлено, что присутствие (0,05-0,5 мг/л)

координационного соединения [Fe

2NiO(CCl3COO)6(CH3OH)3] в питательной среде

оказывает стимулирующее действие на процесс каротиногенеза (рис. 4.7). Содержание

каротиноидов при этом увеличивалось на 23-74%, по сравнению с контролем.

Максимальный выход суммарного количества каротиноидных пигментов обеспечивает

присутствие в питательной среде координационного соединения железа в концентрации

0,1 мг/л.

Изменение качественного состава каротиноидного комплекса пигментов дрожжей,

выращенных на питательных средах

с соединением [Fe2NiO(CCl3COO)6(CH3OH)3],

различных концентраций представлено на рисунке 4.8.

На рисунке 4.8 видно, что биосинтез главного пигмента дрожжей – β-каротина

происходит наиболее активно при наличии в питательной среде испытуемого соединения

в концентрации 0,1 мг/л. Количество пигмента в биомассе увеличивается на 98 % по

сравнению с контролем.

131

120

198

169

157

144

178

146

151

123

112

100

120

140

160

180

200

% К

0,05 0,1 0,2 0,5

β-каротин торулин торулародин

Рисунок 4.8. Влияние [Fe2NiO(CCl3COO)6(CH3OH)3] на качественный состав

каротиноидных пигментов дрожжей Rhodotorula gracilis CNMN-YS-03

Количество каротиноидов красной группы пигментов (торулина и торулародина) в

биомассе дрожжей также варьировало в зависимости от концентрации соединения

[Fe2NiO(CCl3COO)6(CH3OH)]. Количество данных пигментов увеличивалось на 69% и 78%

соответственно при наличии в среде этого вещества в концентрациях 0,1 и 0,2 мг/л.

Из проведенных исследований следует, что координационное соединение

[Fe2NiO(CCl3COO)6(CH3OH)3] обладает специфическим характером действия и является

биорегулятором процесса биосинтеза каротиноидных пигментов штаммами дрожжей рода

Rhodotorula.

Таким образом, анализ результатов исследований, направленных на изучение

действия нетрадиционных источников питания (экстрактов яблочных, виноградных и

томатных выжимок), предшественников каротиногенеза (ацетата натрия, ацетата цинка,

лимонной кислоты), индукторов биосинтеза каротиноидов (растительных масел и

ретинола) и металлокомплексов железа ([Fe2Mn(CCl3COO)6(CH3OH)3],

[Fe2NiO(CCl3COO)6(CH3OH)3]), включенных в состав питательной среды MZ-30, на

продуктивность и процесс каротинообразования дрожжей рода Rhodotorula выявил

достоверные существенные особенности:

- использование экстрактов из томатных выжимок при культивировании

Rhodotorula gracilis CNMN-YS-03 позволяет повысить продуктивность до 15,633 г/л с.в., а

содержание каротиноидов в биомассе до 9755,319 мкг/л;

- использование ацетата натрия в концентрации 3,0 г/л позволяет повысить

продуктивность дрожжей до 14,73 г/л; общее количество каротиноидов (β-каротина,

торулина и торулародина) увеличивается в 2,5 раза по сравнению с контролем при

культивировании штамма Rhodotorula gracilis CNMN-YS-03 на питательной среде MZ-30

с лимонной кислотой концентрацией 1,0 г/л;

- наличие подсолнечного масла концентрацией 1,0 г/ л в питательной среде

повышает продуктивность дрожжей Rhodotorula gracilis CNMN-YS-03 на 65 % по

отношению к контролю; кукурузное масло обладает наилучшим стимулирующим агентом

на выход общего количества каротиноидов, достигающего 3180,406 мкг/л, что в 2 раза

выше контрольного значения;

- применение координационного соединения [Fe

NiO(CCl

COO)

(CH

OH)

] в

составе питательной среды Лундина способствует активному биосинтезу каротиноидов,

содержание которых в биомассе дрожжей увеличивается на 54 % для Rhodotorula gracilis

CNMN-YS-III/5 и на 74 % для Rhodotorula gracilis CNMN-YS-03.

Полученные результаты свидетельствуют о необходимости проведения

дальнейших исследований, целью которых является разработка питательной среды

оптимального состава и способов направленного синтеза каротиноидов у дрожжей.

4.5 Способы направленного синтеза каротиноидов у дрожжей

Известно, что содержание каротиноидных пигментов в биомассе дрожжей

находится в прямой зависимости от состава питательной среды и условий

культивирования (NIPPON, 1992; BRAMLEY, 1992).

В предыдущих исследованиях проводилось изучение влияния нетрадиционных

источников питания (экстракта томатных, виноградных и яблочных выжимок),

индукторов (соевого, подсолнечного, оливкового, кукурузного масел и ретинола),

предшественников (ацетатов и лимонной кислоты) и координационных соединений

железа на продуктивность и каротиногенез дрожжей Rhodotorula gracilis CNMN-YS-03.

Исходя из того, что составляющие питательных сред были изучены по

отдельности, следующим этапом являлось исследование комплексного влияния

компонентов питательной среды на процесс биосинтеза пигментов и изменение

качественного состава каротиноидов штамма дрожжей Rhodotorula gracilis CNMN-YS-03.

Для решения поставленной задачи мы воспользовались методами математического

планирования эксперимента в биологии (МАКСИМОВ, 1980). Согласно данным методам,

была составлена матрица полного факторного эксперимента (табл. 4.5).

Таблица 4.5

Матрица полного факторного эксперимента ПФЭ 2²

Экстракт

томатных

выжимок

Кукурузное

масло

Лимонная

кислота

[Fe

NiO(CCl

(CH

OH)

]

Фактор

Х1 Х2 Х3 Х4

Нижний уровень

(-)

0,1 0,5 0,5 0,05

Верхний уровень

(+)

1,0 2,0 3,0 0,5

Единица

измерения

л г/л г/л мг/л

Эксперименты

- - - -

+ - - -

- + - -

+ + - -

- - + -

+ - + -

- + + -

+ + + +

- - - +

+ - - +

- + - +

+ + - +

- - + +

+ - + +

- + + +

+ + + +

Где:

1–MZ-30 (контроль);

2-MZ-30+экстракт томатных выжимок (0,8 л);

3-MZ-30+кукурузное масло (1,0 г/л);

4-MZ-30+экстракт томатных выжимок (0,8 л)+кукурузное масло (1,0 г/л);

5-MZ-30+лимонная кислота (1,0 г/л);

6-MZ-30+лимонная кислота (1,0 г/л)+экстракт томатных выжимок (0,8 л);

7-MZ-30+кукурузное масло (1,0 г/л)+лимонная кислота (1,0 г/л);

8-MZ-30+экстракт томатных выжимок (0,8 л)+кукурузное масло (1,0 г/л)+

лимонная

кислота (1,0 г/л);

9-MZ -30 + [Fe2NiO(CCl3COO)6(CH3OH)3] (0,005 г/л);

10 -MZ-30+экстракт томатных выжимок (0,8 л)+[Fe2NiO(CCl3COO)6(CH3OH)3] (0,005 г/л);

11 -MZ-30+кукурузное масло (1,0 г/л)+[Fe2NiO(CCl3COO)6(CH3OH)3] (0,5 г/л);

12-MZ-30+экстракт томатных выжимок (0,8 л)+кукурузное масло (1,0 г/л)+

[Fe2NiO(CCl3COO)6(CH3OH)3] (0,005 г/л);

13 - MZ -30 + лимонная кислота (1,0 г/л)+[Fe2NiO(CCl3COO)6(CH3OH)3] (0,5 г/л);

14-MZ-30+экстракт томатных выжимок (0,8 л)+лимонная кислота (1,0 г/л)+

[Fe2NiO(CCl3COO)6(CH3OH)3] (0,005 г/л);

15-MZ-30+кукурузное масло (1,0 г/л)+лимонная кислота (1,0 г/л)+

[Fe2NiO(CCl3COO)6(CH3OH)3] (0,005 г/л);

16 -MZ -30 + экстракт томатных выжимок (0,8 л)+ кукурузное масло (1,0 г/л)+ лимонная

кислота (1,0 г/л)+ [Fe2NiO(CCl3COO)6(CH3OH)3] (0,005 г/л).

В соответствии с составленной матрицей, были проведены эксперименты для

получения оптимального состава среды, использование которой способствовало бы более

интенсивному каротинообразованию пигментных дрожжей. Результаты исследований

представлены в таблице 4.6. Согласно полученным данным, было установлено, что

биосинтез каротиноидов зависит от состава питательной среды.

При культивировании штамма Rhodotorula gracilis CNMN-YS-03 на питательной

среде MZ–30, содержащей комбинацию лимонной кислоты (1,0 г/л), экстракта томатных

выжимок (0,8 л) и [Fe

NiO(CCl

COO)

(CH

OH)

] (0,5 мг/л) (вариант среды № 14)

максимальный выход каротиноидов в биомассе дрожжей (до 15213,66 мкг/л, что на

165,95 % больше по сравнению с контролем). Эффективность использования питательной

среды данного состава обуславливается, вероятно, тем, что экстракт томатных выжимок

является дополнительным источником углеводов и витаминов, лимонная кислота является

предшественником, который принимает прямое участие в процессе аэробного дыхания

микроорганизмов, координационное соединение железа является специфическим

регулятором синтеза каротиноидов, а совокупность этих факторов обеспечивает

присутствие в питательной среде всех веществ, необходимых для эффективного

биосинтеза каротиноидов дрожжами.

При стимулирующем влиянии каждого фактора по отдельности на биосинтез

каротиноидов наблюдается отрицательное действие некоторых сочетаний факторов в

составе среды для выращивания дрожжей, к которым, согласно данным, представленным

в таблице 4.6, относятся комбинации: а) экстракта томатных выжимок (0,8 л), кукурузного

масла (1,0 г/л) и лимонной кислоты (1,0 г/л) (вариант №8); б) экстракта томатных

выжимок (0,8 л), кукурузного масла (1,0 г/л), лимонной кислоты (1,0 г/л) и

координационного соединения [Fe2NiO(CCl3COO)6(CH3OH)3] (0,5 мг/л) (вариант №16).

Таблица 4.6

Влияние состава питательной среды на каротиногенез дрожжей Rhodotorula gracilis CNMN-YS-03

Каротиноиды

№ п/п Варианты

мкг/г с.в.

Х1±Х2

% к

мкг/л с.в.

Х1±Х2

% к

MZ -30 - контроль

615,37±21,36 100,00 5720,53±98,76 100,00

MZ -30+экстракт томатных выжимок (0,8 л)

842,94±56,64 136,98 8682,28±161,58 151,77

MZ -30+кукурузное масло (1,0 г/л)

1262,95±75,23 205,23 13426,81±187,57 234,71

MZ -30+экстракт томатных выжимок (0,8 л)+кукурузное масло

(1,0 г/л)

937,16±69,87 152,29 9899,01±125,69 173,04

MZ -30+лимонная кислота (1,0 г/л)

1085,12±55,63 176,33 8994,56±166,13 157,23

MZ -30+лимонная кислота (1,0 г/л)+экстракт томатных выжимок

(0,8 л)

642,44±46,85 152,58 12697,48±145,91 221,96

MZ -30+кукурузное масло (1,0 г/л)+ лимонная кислота (1,0 г/л)

1135,05±76,95 184,45 12222,22±134,64 213,66

MZ -30+экстракт томатных выжимок (0,8 л)+кукурузное масло

(1,0 г/л)+лимонная кислота (1,0 г/л)

461,18±34,51 74,94 5797,23±137,85 101,34

MZ -30+[Fe

NiO(CCl

COO)

(CH

OH)

] (0,5 мг/л)

1070,05±65,12 173,89 9004,43±169,18 157,41

MZ -30+экстракт томатных выжимок (0,8 л)+

[Fe

NiO(CCl

COO)

(CH

OH)

] (0,5 мг/л)

696,00±33,27 180,96 13123,92±174,69 229,42

MZ -30+кукурузное масло (1,0 г/л)+

[Fe

NiO(CCl

COO)

(CH

OH)

] (0,5 мг/л)

818,68±42,15 133,04 7289,54±119,51 127,43

MZ-30+экстракт томатных выжимок (0,8 л)+кукурузное масло

(1,0 г/л)+ [Fe

NiO(CCl

COO)

(CH

OH)

] (0,5 мг/л)

1035,21±73,16 168,22 9575,72±167,85 167,39

MZ -30+лимонная кислота (1,0 г/л)+

[Fe

NiO(CCl

COO)

(CH

OH)

] (0,5 мг/л)

1028,42±67,29 167,12 8515,31±164,26 148,86

MZ -30+лимонная кислота (1,0 г/л)+экстракт томатных выжимок

(0,8 л)+[Fe

NiO(CCl

COO)

(CH

OH)

] (0,5 мг/л)

814,96±45,38 185,08

15213,66±158,38 265,95

MZ -30+кукурузное масло (1,0 г/л)+лимонная кислота (1,0 г/л)+

[Fe

NiO(CCl

COO)

(CH

OH)

] (0,5 мг/л)

852,19±38,64 138,48 7221,44±124,56 126,24

MZ -30+экстракт томатных выжимок (0,8 л)+кукурузное масло

(1,0 г/л)+лимонная кислота (1,0

г/л)+[Fe

NiO(CCl

COO)

(CH

OH)

] (0,5 мг/л)

322,39±21,06 52,39 2912,95±89,68 50,92

В соответствии с результатами, полученными при изучении влияния состава

питательной среды на каротинообразование дрожжей, согласно матрице полного факторного

эксперимента, были рассчитаны коэффициенты регрессии по схеме Иейтс (табл. 4.7).

Таблица 4.7

Расчет коэффициентов регрессии по схеме Иейтс для каротиноидов

№

п/п

Результаты

экспериментов

1 шаг 2 шаг 3 шаг 4 шаг

регрессии

Ряд

1 5720,53 14402,81 37728,63 77440,12 150297,08 9393,57 1

2 8682,28 23325,82 39711,49 72856,96 5507,41 344,21 Х1

3 13426,81 21692,04 38993,60 -3288,12 -13607,25 -850,45 Х2

4 9899,01 18019,45 33863,35 8795,53 -29457,60 -1841,10 Х1Х2

5 8994,56 22128,35 -566,05 5250,42 -3147,39 -196,71 Х3

6 12697,48 16865,26 -2722,07 -18857,67 -6171,83 -385,74 Х1Х3

7 12222,22 23728,97 6405,66 -16617,46 -20927,09 -1307,94 Х2Х3

8 5797,23 10134,39 2389,86 -12840,14 -12811,88 -800,74 Х1Х2Х3Х

9 9004,43 2961,76 8923,01 1982,86 -4583,16 -286,45 Х4

10 13123,92 -3527,80 -3672,59 -5130,25 12083,65 755,23 Х1Х4

11 7289,54 3702,91 -5263,09 -2156,03 -24108,09 -1506,76 Х2Х4

12 9575,72 -6424,99 -13594,58 -4015,80 3777,32 236,08 Х1Х2Х4

13 8515,31 4119,48 -6489,56 -12595,61 -7113,11 -444,57 Х3Х4

14 15213,66 2286,18 -10127,90 -8331,49 -1859,77 -116,24 Х1Х3Х4

15 7221,44 6698,35 -1833,30 -3638,34 4264,12 266,51 Х2Х3Х4

16 2912,95 -4308,49 -11006,84 -9173,54 -5535,20 -345,95 Х1Х2Х3Х4

Математический анализ результатов полного факторного эксперимента и расчет

коэффициентов регрессии на их основе дает нам возможность составить уравнение

регрессии:

Y=9393.57+344,21Х1-850,45Х2-1841,10Х1Х2-385,74Х1Х3-1307,94Х2Х3-

800,74Х1Х2Х3+755,23Х1Х4-1506,08Х2Х4+236,08Х1Х2Х4-444,57Х3Х4+266,51Х2Х3Х4-

345,95Х1Х2Х3Х4

Составленное уравнение регрессии является прямой зависимостью выхода

каротиноидных пигментов из биомассы дрожжей от концентрации компонентов,

используемых в питательной среде. Исходя из полученного уравнения регрессии, можем

предположить, что использование в питательной среде комбинации факторов Х1Х4

(экстракта томатных выжимок и координационного соединения [Fe

NiO(CCl

COO)

(CH

OH)

])

(вариант № 10) будет оказывать существенный стимулирующий эффект на

каротинообразование дрожжей. Примерно одинаковую степень эффективности на биосинтез

каротиноидов будут проявлять сочетания Х1Х2Х4 (экстракт томатных выжимок, кукурузное

масло и координационное соединение [Fe

NiO(CCl

COO)

(CH

OH)

]) (вариант №2) и

Х2Х3Х4 (вариант №15) (кукурузное масло, лимонная кислота и

[Fe

NiO(CCl

COO)

(CH

OH)

]). Незначительное стимулирующее или отрицательное влияние

на выход пигментов в биомассе дрожжей, согласно составленному уравнению регрессии,

окажет наличие в среде для культивирования дрожжей сочетание экстракта томатных

выжимок и кукурузного масла.

Изменения качественного состава каротиноидного комплекса дрожжей Rhodotorula

gracilis CNMN-YS-03 при культивировании штамма на питательных средах различного

состава, согласно составленной матрицей полного факторного эксперимента, представлены

на рисунке 4.9 (а, б, в).

Анализ результатов показал, что биосинтез β-каротина происходил достаточно

эффективно при выращивании штамма на всех испытуемых вариантах питательных сред

(рис.4.9 (а)). Использование различных комбинаций факторов в оптимальных концентрациях

не оказывало отрицательного действия на синтез главного пигмента дрожжей, обладающего

А-провитаминным действием. Следует отметить, что наилучшие результаты были получены

при использовании в составе среды экстракта томатных выжимок и лимонной кислоты

(вариант № 6). Культивирование дрожжей на среде данного состава позволит увеличить

выход данного пигмента до 4056,20 мкг/л питательной среды, что на 175 % больше

контрольного значения. Значительный стимулирующий эффект при использовании

комбинации экстракта томатных выжимок и лимонной кислоты обуславливается, возможно,

функциональным сочетанием углеводов, витаминов и каротиноидов, содержащихся в

составе экстракта и действием лимонной кислоты, которая участвует в процессе

последовательного окисления жирных кислот, являющихся активаторами синтеза ряда

ферментов в составе питательной среды.

100

150

200

250

300

% К

12345678910111213141516

мкг/г мкг/л

а)

100

150

200

250

% К

12345678910111213141516

мкг/г мкг/л

б)

100

150

200

250

% К

12345678910111213141516

мкг/г мкг/л

в)

1–MZ-30- контроль 2-MZ-30+экстракт томатных выжимок (0,8 л) 3-MZ-30+кукурузное масло (1,0 г/л)

4-MZ-30+экстракт томатных выжимок (0,8 л)+кукурузное масло (1,0 г/л) 5-MZ-30+лимонная кислота (1,0 г/л)

6-MZ-30+лимонная кислота (1,0 г/л)+экстракт томатных выжимок (0,8 л) 7-MZ-30+кукурузное масло (1,0 г/л)+лимонная кислота (1,0 г/л)

8-MZ-30+экстракт томатных выжимок (0,8 л)+кукурузное масло (1,0 г/л)+лимонная кислота (1,0 г/л

)

9-MZ -30 + [Fe

NiO(CCl

COO)

(CH

OH)

] (0,5 мг/л) 10 -MZ-30+экстракт томатных выжимок (0,8 л)+ [Fe

NiO(CCl

COO)

(CH

OH)

] (0,5 мг/л)

11 -MZ-30+кукурузное масло (1,0 г/л)+ [Fe

NiO(CCl

COO)

(CH

OH)

] (0,5 мг/л)

12-MZ-30+экстракт томатных выжимок (0,8 л)+кукурузное масло (1,0 г/л)+ [Fe

NiO(CCl

COO)

(CH

OH)

] (0,5 мг/л)

13 - MZ -30 + лимонная кислота (1,0 г/л)+ [Fe

NiO(CCl

COO)

(CH

OH)

] (0,5 мг/л)

14-MZ-30+экстракт томатных выжимок (0,8 л)+лимонная кислота (1,0 г/л)+ [Fe

NiO(CCl

COO)

(CH

OH)

] (0,5 мг/л)

15-MZ-30+кукурузное масло (1,0 г/л)+лимонная кислота (1,0 г/л)+ [Fe

NiO(CCl

COO)

(CH

OH)

] (0,5 мг/л)

16 -MZ -30 + экстракт томатных выжимок (0,8 л)+ кукурузное масло (1,0 г/л)+ лимонная кислота (1,0 г/л)+ [Fe

NiO(CCl

COO)

(CH

OH)

] (0,5 мг/л)

Рисунок 4.9. Влияние состава питательной среды на биосинтез β-каротина (а),

торулина (б) и торулародина (в) дрожжами Rhodotorula gracilis CNMN-YS-03