Кирица Е. Направленный синтез каротиноидов у дрожжей и перспектива их использования

Подождите немного. Документ загружается.

вторичным метаболизмом (BARNETT et. al., 1983; Промышленная микробиол..,1989;

ЗАЛАШКО, 1991; ВАСИЛЬЧЕНКО, 1994).

В зависимости от условий среды, изменяются метаболические процессы в клетке. На

состояние клеток исключительно влияет химический состав среды и особенно концентрации

питательных веществ, находящихся в относительном минимуме (RUDIC şi alt., 200; QIU

HONG – DUON et. al., 2001). Условия для многих синтезов, то есть физиологическое

состояние для их протекания можно предсказывать на основании выявленных

закономерностей, оптимизацией микробиологических процессов, состоящей из следующих

этапов: 1) изучение динамики роста, биосинтеза продуктов, потребления субстратов в

периодических культурах; 2) выявление лимитирующего рост фактора среды, недостаток

которого депрессирует сверхсинтез целевого продукта; 3) подбор синтетической среды,

обеспечивающей рост биомассы и последующий биосинтез продукта, каждый компонент

продукта которого физиологически обоснован; 4) подбор практически доступной среды, на

которой сверхсинтез экономичен (РАБОТНОВА, 1986; SANDMAN, 2001).

Знание зависимости между конкретными условиями среды с теми или иными

сторонами жизнедеятельности клеток микроорганизмов позволяет регулировать рост,

развитие и биосинтез необходимых веществ. Отсюда, поддерживая необходимые условия,

можно в известной мере управлять ходом ферментативных процессов, накапливать биомассу

и отдельные продукты метаболизма с заданными свойствами (FANG et. al., 1996;

ДЕНИСЕНКО, 2000).

В современной биотехнологии придается большое значение управляемому синтезу

биологически активных веществ микроорганизмами (БЕРКЕР, 1990). В настоящее время

научные исследования, направленные на изучение условий управляемого синтеза

биологически активных веществ дрожжами, являются актуальными и перспективными.

Очевидна целесообразность поиска таких добавок к питательным средам, которые при

производственном культивировании дрожжей увеличили бы выход биомассы и продуктов

метаболизма одновременно.

Исходя из вышеизложенного, перед нами была поставлена задача изучить

эффективность использования нетрадиционных источников питания, индукторов,

предшественников и координационных соединений некоторых металлов

([Fe2NiO(CCl3COO)6(CH3OH)3] и [Fe2Mn(CCl3COO)6(CH3OH)3]) для оптимизации питательных

сред и разработка эффективных способов направленного синтеза β-каротина, торулина и

торулародина у дрожжей.

4.1. Влияние нетрадиционных источников питания на продуктивность

и биосинтез каротиноидов дрожжами Rhodotorula gracilis CNMN - YS-03

Одним из главных факторов для активной жизнедеятельности дрожжей является

присутствие в питательной среде доступных источников энергии, которыми являются

углеводы. Выяснение первых метаболических путей (ферментации глюкозы в этанол и СО2),

проделанных дрожжами, согласно литературным данным, являлось моделью для всех

последующих исследований промежуточного метаболизма живых организмов (МЕЦЛЕР,

1986; ДЕБАБОВ,1988; CHEN et.al., 1999).

Известно, что ферментативное использование источников углерода дрожжами является

их общей характеристикой. Все дрожжи способны к ферментации глюкозы, при этом

интенсивность ферментации пропорциональна числу клеток и их физиологическому

возрасту. Наличие витаминов в среде культивирования дрожжей также влияет на ход

ферментации (IACOB, 1991).

По данным литературы, наибольшая часть стоимости производства биомассы

приходится на сырье. Поиск эффективных дешевых источников сырья, с одной стороны, и

эффективных путей утилизации отходов различных производств, с другой стороны,

определяет целесообразность использования этих отходов и вторичных продуктов, как

источников энергии и вещества для получения биомассы и каротиноидов (БАЛХАНТ и др.,

1991; BARRETO, 2002).

Следует отметить важность изучения возможности использования отходов пищевой

промышленности, богатых источниками углерода и, в свою очередь, создание экономных и

эффективных питательных сред для культивирования дрожжей рода Rhodotorula –

потенциальных источников каротиноидов.

Поэтому в наших исследованиях, в качестве нетрадиционных источников питания,

были использованы экстракты виноградных, яблочных и

томатных выжимок, являющиеся в

Молдове вторичным сырьем агропромышленного комплекса.

Согласно литературным данным и нашим исследованиям, количество сахаров в

экстрактах варьирует от 10 до 43 мг/мл. Самое высокое содержание сахаров – 43 мг/мл

содержится в виноградном экстракте, в томатном экстракте - 10 мг/мл и яблочном экстракте

– 33 мг/мл. Помимо сахаров, экстракты растительных шротов,

согласно литературным

данным, богаты витаминами РР и Е. Так, в яблочных отходах содержатся витамины группы

РР (до 1,6%) и витамины Е (50 мг%); в виноградных выжимках витамина РР (3 мг%) и

витамин Е (40 мг%). В томатных выжимках содержится витамина Е 89 мг%, каротиноидных

пигментов – 18,5 мг% (ЩЕРБАКОВ, 1991).

В исследованиях за основу была взята питательная среда MZ-30, следующего состава

(г/л): глицерин – 20.0; меласса – 20.0; KH2PO4 – 1.0; NaCl – 0.5, MgSO

•7H

O-0,5; CaCl2 –

1.0; Fe2SО4•7H2O- 0, 00003 (следы); экстракт растительных шротов до 1 л; рН 5,5. Инокулят

дрожжей рода Rhodotorula вводился в среду культивирования в количестве 3-5%.

Культивирование проводилось при температуре +25-27ºC на качалке 180-200 об/мин, рН –

5,5-6,5, освещение 12-15 тыс. эрг/см

Первоначальной задачей было выяснение влияния присутствующих в составе среды

культивирования экстрактов растительных выжимок на продуктивность и процесс

каротинообразования штамма дрожжей Rhodotorula gracilis CNMN-YS -03.

Результаты проведенных исследований показали, что процесс аккумуляции клеточной

массы дрожжей зависит от вида экстракта, присутствующего в среде культивирования

дрожжей (табл. 4.1).

Таблица 4.1

Влияние нетрадиционных источников питания на продуктивность и содержание

каротиноидов у дрожжей Rhodotorula gracilis CNMN-YS -03

Продуктивность Содержание каротиноидов

Варианты

питательных сред

г/л с.в.

Х1±Х2

% К

мкг/ г с.в.

Х1±Х2

% К

мкг/л

Х1±Х2

% К

MZ 30+экстракт

виноградных

выжимок

11,13±0,22 145,47 684,99±12,71 155,29 7624,22±73,93 225,97

MZ-30+экстракт

томатных

выжимок

15,63±0,11 204,27 624,14±4,47 141,49 9755,31±68,25 289,09

MZ-30+экстракт

яблочных

выжимок

12,34±0,36 161,27 549,45±17,72 124,56 6780,28±60,85 200,93

MZ-30

(К)

7,65±0,29 100,00 441,12±11,88 100,00 3374,56±186,60 100,00

Данные, представленные в таблице, свидетельствуют о том, что рост дрожжей

происходит активно на всех исследуемых вариантах сред, количество биомассы при этом

увеличивается по сравнению с контролем на 45 - 104%. Отметим, что культивирование

штамма Rhodotorula gracilis CNMN-YS - 03 на питательных средах, содержащих экстракт

яблочных и томатных выжимок, способствует увеличению выхода клеточной массы

дрожжей до 12,34 и 15,63 г/л соответственно, что на 64,27 и 104,27% больше контрольного

значения. Наибольшая продуктивность биомассы, согласно представленным результатам,

отмечена при добавлении к питательной среде экстракта томатных выжимок (15,63 г/л).

Изучение влияния экстрактов растительных шротов на процесс каротиногенеза

дрожжей показало, что присутствие последних в питательной среде оказывает

положительное действие на накопление пигментов в биомассе. Так, добавление в среду

экстракта виноградных выжимок позволило увеличить количество каротиноидов в биомассе

на 55,29 %, что составляет 684,99 мкг/г сухих веществ. Следует отметить, что процесс

пигментообразования дрожжами усиливался и при внесении в питательную среду экстракта

томатных и яблочных выжимок - на 41,49 и 24,56 %, соответственно, по сравнению с

контролем. Было выявлено, что при культивировании штамма дрожжей Rhodotorula gracilis

CNMN-YS - 03 на питательной среде, содержащей экстракт томатных выжимок, количество

пигментов доходит до 9755,31 мкг/л, что в 2,8 раза больше контрольного значения.

Стимулирующий эффект экстракта томатных выжимок объясним, вероятно, не только

содержанием сахаров, которые являются дополнительным источником энергии,

необходимой для активной жизнедеятельности дрожжей, но и наличием в его составе

микроэлементов и витаминов.

Характер влияния экстрактов растительных шротов на качественный состав пигментов

дрожжей имеет ряд

особенностей. На рисунке 4.1 представлены результаты изучения

влияния экстрактов растительных шротов на биосинтез β–каротина, торулина и

торулародина.

Так, согласно результатам, представленным на рисунке 4.1(а), видно, что биосинтез β –

каротина дрожжами Rhodotorula gracilis CNMN-YS-03 активизируется при культивировании

на питательных средах, содержащих любой из исследуемых экстрактов растительных

шротов. Содержание β – каротина в клетках дрожжей при этом увеличивается на 21 - 27% по

сравнению с контролем. Следует отметить, что максимальный стимулирующий эффект

достигается при культивировании пигментных дрожжей на питательной среде с экстрактом

томатных выжимок: количество β – каротина составляет в данном варианте опыта 224,14

мкг/г с.в., или на 27 % больше по сравнению с контролем.

β-каротин

217,23; 33%

224,14; 34%

214,07; 33%

экстракт виноградных выжимок

экстракт томатных выжимок

экстракт яблочных выжимок

торулин

229,32;

31%

315,69;

43%

186,63;

26%

экстракт виноградных выжимок

экстракт томатных выжимок

экстракт яблочных выжимок

а) б)

торулародин

163,97; 36%

150,97; 33%141,97; 31%

экстракт виноградных выжимок

экстракт томатных выжимок

экстракт яблочных выжимок

в)

Рисунок 4.1. Влияние нетрадиционных источников питания на содержание β-каротина

(а), торулина (б) и торулародина (в) в биомассе дрожжей

Rhodotorula gracilis CNMN-YS-03

Анализ влияния экстрактов растительных шротов на биосинтез одного из

представителей красной группы пигментов – торулина (3’, 4’-дегидро – γ-каротин) показал,

что данный процесс также зависит от вида экстракта добавляемого в питательную среду для

выращивания дрожжей. Как видно на рисунке 4.1 (б), внесение экстракта яблочных

выжимок способствует увеличению количества торулина в клетках дрожжей на 20%,

экстракта томатных выжимок - на 47 %, по отношению к контролю, а наличие в среде

экстракта виноградных выжимок - увеличению выхода данного пигмента из 1 г сухой

биомассы на 102%, что составляет 315,69 мкг/г сухих веществ.

Биосинтез торулародина, согласно результатам проведенных исследований,

происходил активно на всех питательных средах, в состав которых входили экстракты

растительных шротов. Однако, наилучшие результаты были получены при культивировании

штамма дрожжей Rhodotorula gracilis CNMN-YS–03 на питательной среде с экстрактом

томатных выжимок: выход торулародина увеличивался на 49% и составил 163,97 мкг/ г с.в.

(рис. 4.1 (в)).

Таким образом, проведенные исследования показали, что отходы агропромышленного

производства - экстракты яблочных, виноградных и томатных выжимок - представляют

практический интерес, как дополнительные компоненты питательных сред для

культивирования пигментных дрожжей. Использование экстракта томатных выжимок в

качестве компонента питательных сред для выращивания пигментных дрожжей позволяет

увеличить выход биомассы и каротиноидов в 2,5 раза.

4.2. Влияние предшественников на продуктивность и биосинтез

каротиноидов дрожжами Rhodotorula gracilis CNMN-YS -03

В современной биотехнологии очевидна целесообразность поиска таких добавок к

питательным средам, которые позволят одновременно регулировать рост и синтез отдельных

компонентов клетки дрожжей. Зная биохимические пути биосинтеза того или иного

продукта, можно значительно улучшить процесс биосинтеза путем добавления в

питательную среду для выращивания микроорганизмов предшественников получаемого

продукта, ингибиторов или стимуляторов отдельных звеньев

данного процесса ( БИРЮКОВ,

1985; ФЕОФИЛОВА, 1994).

Согласно современным представлениям, биосинтез каротиноидов может быть разбит

на несколько стадий: образование С

– промежуточного продукта геранилпирофосфата;

образование фитоина – первого С

– каротина; ряд реакций десатурации; циклизация и

связанные с ней реакции с участием двойной связи С -1,2; окончательные модификации. В

процессе синтеза каротиноидов первым общим предшественником для всех видов каротинов

является ацетат в виде ацетил – КоА, который в процессе биосинтеза подвергается

восстановлению в две стадии до мевалоновой кислоты (ФЕОФИЛОВА, 1980; БРИТТОН,

1986; ЕГОРОВ, 1989; GIL–HWAN et al., 1990; CHEN et al., 1999).

Важную роль в процессе биосинтеза каротиноидов играют органические кислоты,

входящие в состав трикарбонового цикла, к которым относятся трикарбоновые кислоты –

лимонная, цисаконитовая, изолимонная, щавелевоянтарная и дикарбоновые кислоты -

яблочная, янтарная, кетоглутаровая, фумаровая и щавелевоуксусная (КОРОЛЕВА, 1979;

МЕЦЛЕР, 1986; МЕЛЬНИКОВ и др., 1997). Согласно литературным данным, для

обеспечения клеток максимальным количеством энергии необходимо, чтобы отщепляемые

от жирных кислот ацетильные остатки, содержащие два атома углерода, были полностью

окислены до двуокиси углерода. Химическое окисление ацетильной группы осуществляется

циклом трикаброновых кислот (циклом лимонной кислоты) (МЕЦЛЕР, 1988). Цикл

трикарбоновых кислот, являясь одним из наиболее важных циклов аэробных организмов

(бактерий, простейших, грибов, растений и человека), представляет собой типичный

каталитический цикл, с которым всегда ассоциирован метаболический путь,

обеспечивающий синтез регенерирующего субстрата. Субстратом является и уксусная

кислота, которая в активной форме, т.е. в виде ацетилкофермента А (ацетил – СоА),

участвует в конденсации с щавелевоуксусной кислотой, приводящей к образованию

лимонной кислоты. Именно ацетильный остаток, вошедший в структуру лимонной кислоты,

подвергается окислению; атомы углерода окисляются до СО

, атомы водорода частично

акцептируются коферментами дегидрогеназ, частично в протонированной форме переходят в

раствор, т.е. в окружающую среду. Используемый при этом метаболический путь

обеспечивает механизм биосинтеза любых необходимых количеств любого промежуточного

продукта, образующегося в ходе цикла. Клетки получают из цикла трикарбоновых кислот

значительные количества оксалоацетата, α-кетоглутарата и сукцинил СоА, используя для

синтеза других клеточных компонентов. Таким образом, метаболический путь синтеза

регенерирующего субстрата и некоторые из ферментов цикла используются для

формирования путей биосинтеза тех или иных компонентов клетки (МЕЦЛЕР, 1980; PILAR

et. al., 1995).

Исходя из того, что вопрос о влиянии различных добавок на рост и

каротинообразование дрожжей представляется весьма важным как в теоретическом, так и в

практическом отношении, несомненный интерес представляет изучение влияния таких

предшественников, как ацетат натрия, ацетат цинка и лимонная кислота, на количественный

и качественный состав каротиноидов дрожжей Rhodotorula gracilis – CNMN-YS – 03.

Первоначальной задачей было выяснение степени аккумуляции клеточной массы

дрожжей, выращенных на питательной среде MZ-30 с добавлением предшественников в

различных концентрациях: ацетат натрия (NaCH3COO)-1,0; 3,0; 5,0 г/л, лимонная кислота

(С6Н8О7)-1,0; 3,0; 5,0 г/л и ацетат цинка (Zn(CH3COO)24Н2О)-0,005; 0,010; 0,015 г/л.

В результате исследований было установлено, что продуктивность дрожжей зависит

от того, какой предшественник и в каком количестве добавлен в основную среду

культивирования - MZ-30 (табл. 4.2).

Таблица 4.2

Влияние предшественников на продуктивность и содержание

каротиноидов у дрожжей Rhodotorula gracilis – CNMN-YS – 03

Продуктивность Каротиноиды

Варианты

Концентрация

, г/л

г/л с.в.

Х1±Х2

мкг/г с.в.

Х1±Х2

мкг/л

Х1±Х2

1,0

12,53±0,08 170,81 671,72±0,35 138,08 8416,59±33,67 234,71

3,0

14,73±0,06 195,02 531,45±0,44 109,24 7828,20±24,5 218,29

MZ-30 + ацетат

натрия

5,0

9,94±0,03 134,97 490,85±0,68 100,89 4879,05±6,38 136,06

1,0

10,34±0,08 140,37 873,63±0,07 179,58 9036,37±36,34 251,85

3,0

11,79±0,12 160,01 593,18±0,35 121,93 6993,59±38,68 195,02

MZ-30 +

лимонная

кислота

5,0

10,17±0,04 138,05 480,32±0,53 98,73 4885,66±11,15 136,24

0,005

12,25±0,13 166,21 413,51±0,84 85,00 5065,49±20,156 141,26

0,010

10,66±0,15 144,62 491,34±0,21 100,98 5327,68±31,24 148,57

MZ-30+ацетат

цинка

0,015

9,02±0,95 122,29 554,59±0,75 114,00 5002,40±24,26

139,49

MZ-30 (К)

7,37±0,03 100 486,48±0,56 100,00 3586,03±7,76 100,00

Исходя из полученных данных, следует, что использование ацетата цинка различных

концентраций обуславливает меньший прирост биомассы дрожжей по сравнению с другими

веществами. При этом продуктивность биомассы дрожжей составляет 9,02-12,25 г/л с.в., что

на 22,29..66,21% больше контроля. Внесение в среду для выращивания дрожжей

ацетата натрия концентрацией 3,0 г/л, согласно полученным результатам, позволило

максимально увеличить продуктивность дрожжей Rhodotorula gracilis-CNMN-YS-03 до

14,375 г/л с.в., что на 95% больше контрольного значения.

Как показали исследования, присутствие предшественников в питательной среде

оказывает стимулирующее действие и на каротинообразование пигментных дрожжей.

Так, дрожжи активно синтезируют каротиноиды на среде, содержащей

предшественники (ацетат натрия или лимонную кислоту) в минимальных

концентрациях. Наличие в составе питательной среды ацетата натрия в минимальной

концентрации (1,0 г/л), увеличивает содержание пигментов в клетке на 38,08 %, что

составляет 671,72мкг/г с.в.

Культивирование дрожжей на среде, в состав которой входит ацетат цинка (0,15

мг/л) позволяет увеличить содержание каротиноидов в биомассе лишь на 14% по

сравнению с контролем. Эти данные свидетельствует о малоэффективном действии

последнего на биосинтез каротиноидов, что, вероятно, связано с наличием в его составе

цинка, основной функцией которого является стабилизация клеточных структур

(ДЕДЮХИНА, 1998).

В присутствии лимонной кислоты дрожжи синтезируют максимальное количество

каротиноидов - 873,63 мкг/г с.в., что на 79,58 % больше контроля. Содержание

каротиноидных пигментов в биомассе на 1 л составляет 9036,368 мкг/г с.в., что в 2,5

раза больше контрольного значения. Результаты определения влияния

предшественников различных доз на качественный состав каротиноидных пигментов

дрожжей представлены на рисунках 4.2 (а, б, в). Анализ проведенных экспериментов

показал, что биосинтез пигментов

β-каротина, торулина и торулародина зависит от

природы используемого вещества и его количества в питательной среде. Биосинтез β-

каротина дрожжами Rhodotorula gracilis CNMN-YS-03 происходит наиболее активно

при внесении в питательную среду предшественников – ацетата натрия (3,0 г/л) или

лимонной кислоты (1,0 г/л), которые оказывают значительное стимулирующее

действие на данный процесс (рис.4.2 (а)). При этом

содержание β-каротина

увеличивается на 57 и 70% соответственно по сравнению с контролем, что составляет

329,69 и 357,46 мкг/г с.в. Эффективность действия данных предшественников,

вероятно, обусловлена их участием в процессе метаболизма микроорганизмов и, в

частности, в процессе дыхания и биосинтеза каротиноидных пигментов (МЕЦЛЕР,

1986).

157

165

100

170

149

116

105

102

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

% К

172

111

181

134

120

0 50 100 150 200

% К

а) б)

174

183

117

195

142

119

0 50 100 150 200

% К

в)

1-NaCH

3COO (1,0 г/л); 2- NaCH3COO (3,0 г/л); 3 - NaCH3COO(5,0 г/л);

4 - С

6Н8О7 (1,0 г/л); 5 - С6Н8О7 (3,0 г/л); 6 - С6Н8О7 (5,0 г/л);

7 - [Zn(CH

3COO)2



4Н2О] (0.005 г/л); 8 - [Zn(CH3COO)2



4Н2О] (0.010 г/л);

9-[Zn(CH

3COO)2



4Н2О] (0.015 г/л)

Рисунок 4.2. Влияние предшественников каротиногенеза на содержание β-

каротина(а), торулина (б) и торулародина (в) в биомассе дрожжей

Rhodotorula gracilis CNMN-YS – 03

Лимонная кислота, как представитель цикла трикарбоновых кислот, согласно

полученным результатам, представленным на рисунке 4.2 (б, в), оказывает наилучшее

стимулирующее действие на процесс синтеза каротиноидов красной группы пигментов

– торулина и торулародина: выращивание дрожжей Rhodotorula gracilis CNMN-YS – 03

на питательной среде с лимонной кислотой в концентрации 1,0 г/л усиливает синтез

торулина на 81% (284,65 мкг/г с.в.), а торулародина на 95% (231,25 мкг/г с.в) по

сравнению с контролем.